大花黃牡丹種子浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗保護酶活性的影響

， ， ， ， ， (.四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院， 四川 溫江 630； .西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所， 拉薩 85003)

大花黃牡丹種子浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗保護酶活性的影響

張翔宇1，鄧嵐2，張夕恒1，雷霞1，陳相宇1，劉光立1
(1.四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院， 四川 溫江 611130； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所， 拉薩 850032)

以大花黃牡丹(Paeonialudlowii)山南居群和林芝居群的種子為實驗材料，研究種皮、胚乳水浸提物對白菜種子萌發(fā)、幼苗生長及保護酶活性的影響，探討大花黃牡丹種子休眠的原因。結果表明，大花黃牡丹的種皮、胚乳中含有抑制白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的物質，且抑制作用隨著大花黃牡丹種子浸提液濃度的升高而增強；相同濃度條件下，胚乳浸提液的抑制作用均高于種皮浸提液；測試時間不同，白菜幼苗酶活性的實驗數(shù)據(jù)變化基本一致。山南居群的胚乳浸提液能直接抑制白菜幼苗POD酶活性，間接影響SOD和CAT酶活性；林芝居群的胚乳浸提液能直接抑制白菜幼苗POD和CAT酶活性，間接影響SOD酶活性。本研究認為，大花黃牡丹種子中抑制物質的存在是種子休眠的重要原因之一，且內(nèi)源抑制物主要存在于胚乳中。

大花黃牡丹； 種子休眠； 萌發(fā)； 白菜； 保護酶；

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組的叢生灌木[1]，是我國西藏特有的重要藥用及觀賞植物[2]，分布在西藏山南、林芝地區(qū)海拔2 900～3 200 m的河谷開闊地帶及山坡林緣[3-4]。大花黃牡丹是珍貴的花卉種質資源，具有純粹且能穩(wěn)定遺傳的黃色，在芍藥屬中，其植株最高大、開花最多且顯著[5]；大花黃牡丹也是名貴的藏藥材資源，它的根部、皮和花瓣均可入藥。由于自然植被的破壞和人為的采掘，大花黃牡丹分布范圍逐漸變窄，加之自然更新能力差，野生數(shù)量減少等原因，大花黃牡丹被列為瀕危植物[6]。

植物種子休眠的原因主要包括種皮障礙、內(nèi)源萌發(fā)抑制物和種胚發(fā)育狀況[7]。在紫斑牡丹(P.rockii)種子休眠研究中發(fā)現(xiàn)，其種子含有影響種子后熟和發(fā)芽以及抑制胚根和子葉生長的化學物質[8]。逆境(如低溫、干早、強光輻射、化學藥劑等)能影響植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，即增加活性氧，如超氧陰離子自由基、過氧化氫(H2O2)、羥自由基，如果這些氧自由基不能及時清除，將會導致生物膜脂上不飽和脂肪酸的過氧化或膜脂脫脂作用，從而破壞膜結構，最后導致植物細胞死亡。但是機體內(nèi)有一套抗氧化酶如過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶等能清除這些氧自由基，從而保護細胞免遭損害。在這些抗氧化酶中，過氧化物酶(POD)與超氧化物歧化酶(SOD)為最重要。此外，過氧化氫酶(CAT)通常定位于一種被稱為過氧化物酶體的細胞器中，植物細胞中的過氧化物酶體參與了光呼吸(利用氧氣并生成二氧化碳)和共生性氮固定(將氮氣(N2)解離為活性氮原子)。

本實驗擬以大花黃牡丹的山南和林芝2種居群種子為研究對象，初步研究種子內(nèi)源抑制物質的活性及其對植物主要保護酶活性的影響，根據(jù)白菜幼苗保護酶中的SOD、POD和CAT活性的高低，作為判斷白菜幼苗抗逆性強弱的指標，為大花黃牡丹休眠機制的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

大花黃牡丹的山南居群、林芝居群種子分別采自西藏南部山南、東南部林芝地區(qū)，于2015年9月初，在果實黃熟時期，晴天采集后陰干脫粒，種子去除雜質后低溫避光儲存?zhèn)溆?。校園周邊售賣的白菜(Brassicapekinensis)種子作為該實驗生物活性測定的材料。實驗在四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)實驗室進行。

1.2 種子浸提液的制備

分別選取2種不同居群的飽滿的大花黃牡丹種子，人工剝?nèi)〉姆N皮和胚乳分別放于40 ℃烘干箱中烘干至恒重，用種子粉碎機分別粉碎。各稱取10.00 g分別置于100 mL三角瓶中，加入約80 mL去離子水，用3層保鮮薄膜封口后置于20 ℃無光培養(yǎng)箱內(nèi)浸提24 h，將浸提液在4 000 r/min條件下離心10 min，將過濾得到的上清液定容至100 mL，即為0.1 g/mL的實驗粗提液， 均于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 種子內(nèi)源抑制物質活性測定

選取飽滿，大小形態(tài)相近的白菜種子，將白菜種子用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡30 min消毒后，用蒸餾水沖洗后浸泡，選擇能沉在水底的種子風干備用。用去離子水將種皮、胚乳粗提液分別配制成濃度為0，0.025，0.05，0.075 g/mL和0.1 g/mL的培養(yǎng)液。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中鋪入2層濾紙，分別加入不同濃度的培養(yǎng)液7 mL。每皿放置50粒白菜種子，每處理5個重復。置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行白菜種子生長實驗。24 h統(tǒng)計種子發(fā)芽率(以突破種皮為發(fā)芽標準)， 48 h測定胚根長度，72 h測定下胚軸長度[9]。

1.4 白菜幼苗保護酶活性的測定

將胚乳粗提液用去離子水配制成濃度為0，0.01，0.02，0.04 g/mL和0.08 g/mL的培養(yǎng)液。按1.3中所述的方法培養(yǎng)白菜種子，參照熊慶娥[10]的方法，在24，48 h和72 h均測定白菜幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)3種保護酶的活性。

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析采用Excel和SPSS 13軟件。

2 結果與分析

2.1 大花黃牡丹種子浸提液對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

圖1～圖3為大花黃牡丹種皮、胚乳浸提液對白菜種子發(fā)芽率、胚根和下胚軸長度影響。由圖1可看出，加入種皮浸提液對白菜種子發(fā)芽率幾乎無影響；胚乳浸提液的加入，對白菜種子萌發(fā)有明顯的抑制作用，發(fā)芽率隨著浸提液濃度的增加而降低。

由圖2可見，對照處理白菜幼苗胚根長度最大，白菜幼苗的胚根長度隨著浸提液濃度升高而降低；相同濃度的胚乳浸提液對白菜幼苗胚根的影響顯著高于種皮浸提液。

由圖3可知，大花黃牡丹種皮浸提液的加入，使得白菜幼苗下胚軸長度先降低后升高再降低，整體呈下降趨勢。加入胚乳浸提物，白菜幼苗下胚軸長度隨著濃度的升高而降低；濃度相同條件下，種皮浸提液對白菜幼苗下胚軸的抑制作用顯著低于胚乳浸提液。

由圖1～圖3可看出，相同濃度的種皮、胚乳浸提液對白菜胚根的抑制作用均強于對白菜發(fā)芽率和幼苗下胚軸的抑制作用。

注：數(shù)據(jù)為均值±標準差。圖1 大花黃牡丹種皮、胚乳浸提液對白菜種子發(fā)芽率的影響

圖2 大花黃牡丹種皮、胚乳浸提液對白菜幼苗胚根生長的影響

圖3 大花黃牡丹種皮、胚乳浸提液對白菜幼苗下胚軸生長的影響

2.2 大花黃牡丹胚乳浸提液對白菜幼苗幾種保護酶活性的影響

圖4～圖6分別是大花黃牡丹胚乳浸提液對白菜幼苗SOD、POD和CAT活性的影響。由圖4可知，白菜幼苗中SOD活性隨著胚乳浸提液濃度的升高總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。山南居群中，不同測定時間SOD活性變化差異較為明顯，1 d測定的SOD先降低后升高再降低，0.01 g/mL時酶活性最低，0.04 g/mL時酶活性最高；2 d測定的SOD先升高再降低，0濃度時酶活性最低，0.02 g/mL時酶活性最高，3 d測定的SOD先升高后降低再升高，濃度為0時酶活性最低，0.08 g/mL時酶活性最高(圖4)。林芝居群中，SOD活性表現(xiàn)為先升高后降低，在浸提物濃度為0.02 g/mL時活性最高，在0濃度時活性最低。盡管不同測定時間SOD活性也有變化，但1，2 d和3 d測定的SOD變化趨勢是一致的(圖4)。

圖4 2種居群的大花黃牡丹胚乳浸提液對白菜幼苗中SOD活性的影響

圖5 2種居群的大花黃牡丹胚乳浸提液對白菜幼苗中POD活性的影響

圖6 2種居群的大花黃牡丹胚乳浸提液對白菜幼苗中CAT活性的影響

在不同的測定時間內(nèi)，2種居群的胚乳浸提液培養(yǎng)的白菜幼苗，隨著浸提物濃度的升高，POD活性顯著降低。相比山南居群，林芝居群胚乳浸提液對白菜幼苗POD的抑制作用更顯著(圖5)。山南居群的胚乳浸提液培養(yǎng)的白菜種子，CAT活性隨著浸提物濃度的升高，整體呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(圖6)。林芝居群的胚乳浸提液培養(yǎng)的白菜種子，CAT活性均隨著浸提物濃度的升高而降低(圖6)。相同濃度條件下，1，2，3 d測定的CAT變化趨勢，2種居群的胚乳浸提液處理結果近似。

3 討論與結論

逆境因子可能造成植物體內(nèi)活性氧代謝失調，從而對植物造成傷害。研究表明，在對多種高等作物的化感作用實驗中，受體植物SOD和CAT酶活性受到多酚類化合物的抑制作用，導致其體內(nèi)活性氧增多，從而造成膜脂過氧化，膜的結構受到破壞[11]。連續(xù)種植4年的鳳丹(P.ostiiT.)根際發(fā)現(xiàn)了多種酚酸類物質[12]。楊勇等研究表明，四川牡丹胚乳中的內(nèi)源物質可能是有機酸和酚類物質[13]。因此，盡管實驗沒有進一步研究大花黃牡丹種子胚乳浸提液中的成分，但推測可得，大花黃牡丹種子浸提液中影響白菜幼苗生長和保護酶活性的成分可能也是有機酸和酚類化合物。有研究表明，溫水浸泡、GA3浸泡和種皮挫傷對野生黃牡丹(Paeonialutea)種子胚根的生長有促進作用[14]。GA3和低溫都有利于鳳丹幼苗的生長。因此，大花黃牡丹種子的休眠具有復雜性、綜合性。

在白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的實驗中，大花黃牡丹2種居群的種子浸提液對白菜種子發(fā)芽率、幼苗胚根生長及下胚軸伸長均有抑制作用，并且抑制作用隨著浸提液濃度的增加而增強，且胚乳浸提液的抑制作用更明顯?？赏茰y大花黃牡丹種子的發(fā)芽抑制物主要存在于胚乳中。大花黃牡丹種子浸提液對白菜幼苗胚根的伸長抑制作用明顯強于對白菜種子發(fā)芽率和幼苗的下胚軸伸長的抑制。在白菜種子萌發(fā)的過程中，大花黃牡丹種子浸提液在胚根的伸長階段發(fā)揮較強的抑制作用，但抑制的具體過程及原理還不清楚，有待進一步研究。

研究表明，加入大花黃牡丹胚乳浸提液，白菜幼苗POD活性隨胚乳浸提物濃度的增加而降低，且不同時間測定的POD酶變化趨勢一致，因而胚乳浸提物能夠抑制白菜幼苗POD酶活性；加入大花黃牡丹胚乳浸提液，白菜幼苗CAT活性整體隨胚乳浸提液濃度的增加而降低。白菜幼苗SOD酶活性總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，說明胚乳浸提物不會直接抑制SOD酶活性，這與宋會興等[15]的研究結果一致。原因可能是胚乳浸提液抑制了POD和CAT酶活性，植物體內(nèi)活性氧增多，使得植物啟動應激機制，SOD酶活性增加[13]。但隨著活性氧在植物體內(nèi)的不斷累積，植物受到嚴重迫害，使得SOD酶活性隨之失活[16-18]。

山南居群的胚乳浸提液能直接抑制白菜幼苗POD酶活性，間接影響SOD和CAT酶活性；林芝居群的胚乳浸提液能直接抑制白菜幼苗POD和CAT酶活性，間接影響SOD酶活性。2種居群的SOD活性的變化差異較大，同時測定SOD酶活性的時間不同，使得SOD酶活性的轉折點不同；0.04 g/mL山南居群的種皮浸提液使白菜幼苗中CAT活性略微升高，與林芝居群的實驗數(shù)據(jù)不同。這可能因為兩地的氣候環(huán)境的不同(山南市屬溫帶干旱性氣候，南部邊境地帶屬高原亞寒帶半干旱氣候；林芝地區(qū)為特殊的熱帶濕潤和半濕潤氣候)而造成內(nèi)源抑制物的組成成分或含量的不同，但因為對內(nèi)源抑制物成分和抑制機制的不確定，不能進一步證明內(nèi)源抑制物質是否會隨著環(huán)境的變化而改變的問題。2種居群的數(shù)據(jù)中，SOD酶活性轉折點不同，但整體趨勢一致；隨著胚乳浸提液濃度的增加，2種居群的CAT酶活性總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。因此，初步判定大花黃牡丹種子發(fā)芽抑制物的基本組成成分或基本抑制機制不隨環(huán)境氣候的改變而改變。

種子繁殖是大花黃牡丹唯一的繁殖途徑[19]。牡丹組植物種子均具有休眠萌發(fā)特性，包括上胚軸及下胚軸休眠，且上胚軸休眠更為突出[20-21]。早在13世紀初，便提出種子推遲發(fā)芽與抑制物質有關[22]。自1859年首次從歐洲花楸果實中分離出一種強抑制物——花楸酸[23]以來，發(fā)芽抑制物質的研究已經(jīng)成為種子休眠機理研究的重點。產(chǎn)生于植物種子內(nèi)部或外部的物質(一些有機酸、酯類、醛類、生物堿、脫落酸等)通過抑制種子的酶活性、抑制呼吸、阻礙胚生長等，間接抑制種子的萌發(fā)[24]。本實驗結果表明，大花黃牡丹種子內(nèi)存在抑制白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的物質，且胚乳抑制作用更明顯，主要抑制白菜幼苗胚根伸長。大花黃牡丹胚乳內(nèi)含有可以直接影響幼苗CAT和POD酶活性，間接影響SOD酶活性的物質，不同種群之間表現(xiàn)相似。初步推斷內(nèi)源抑制物質可能是有機酸和酚類化合物，但尚需要進一步的研究抑制物質的成分、性質及其抑制大花黃牡丹種子萌發(fā)的機理。

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Effects of Crude Extracts ofPaeonialudlowiiSeeds on Germination and Activities of Antioxidant Enzyme ofBrassicapekinensis

ZHANGXiangyu1,DENGLan2,ZHANGXiheng1,LEIXia1,CHENXiangyu1,LIUGuangli1

2016-10-20

西藏自治區(qū)自然科學基金“西藏牡丹種子萌發(fā)最適條件的研究”(13-15)。

張翔宇(1995—)，女，四川眉山人；在讀本科生；E-mail:964670742@qq.com。

劉光立，E-mail：liuguangli@sicau.edu.cn。

抑制作用

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.083

S 685.11

A

1001-4705(2017)02-0083-05