元江野生稻柱頭特異性啟動子p51408的克隆及功能分析

周國華

(1.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

元江野生稻柱頭特異性啟動子p51408的克隆及功能分析

周國華1,2

(1.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

【目的】水稻柱頭是水稻有性生殖的重要器官，柱頭外露是決定異交結實的重要特性，是影響雜交水稻制種和不育親本繁育的關鍵因素之一，開展水稻柱頭外露特異表達啟動子研究是探尋水稻雜種優(yōu)勢分子機理及進行分子育種的基礎?！痉椒ā繉σ粋€元江野生稻柱頭外露特異表達基因的啟動子p51048進行了克隆，分析了該啟動子的序列結構特征及os51408的表達特性，通過構建該啟動子的GUS融合表達載體，獲得了轉化體?！窘Y果】組化染色分析表明，該啟動子能在水稻花器官的柱頭、花柱等區(qū)域特異表達，而在根、莖葉、穎花中無表達或低表達。【結論】推測其為柱頭組織特異性啟動子，將為進一步開展水稻柱頭外露這一重要性狀的分子機理和表達調控研究奠定基礎。

水稻；柱頭外露；啟動子；克隆

【研究意義】水稻是中國最主要的糧食作物[1]。自20世紀70年代雜交水稻的研究推廣，極大地提高了中國水稻產量，其繁育體系很大程度上依賴于以柱頭外露為主的不育系異交特性的改良。柱頭是參與水稻有性生殖過程中最重要的器官之一，柱頭外露是指水稻開花時柱頭伸到張開的穎殼之外，開花結束后穎殼閉合，但柱頭仍留在穎殼外的特性，在決定不育系可交配特性、異交結實率及雜交制種產量等雌性花器性狀中，柱頭的外露率是最直接、最重要的因素之一[2-3]，對水稻柱頭外露性狀的深入研究意義重大?！厩叭搜芯窟M展】隨著現(xiàn)代分子技術和遺傳連鎖圖譜的應用，有關水稻柱頭外露性狀QTL基因定位的研究也有很多報道，共檢測到與柱頭外露率相關的QTLs 多達40余個[4-6]，盡管目前QTLs定位分析的報告很多，但其研究結果并不完全一致，這也反應出柱頭外露性狀QTL遺傳的復雜性。關于柱頭外露的基因功能、分子機制的研究仍然還沒有很好的開展起來。野生稻比栽培稻具有更高的柱頭外露率，而相對于野生稻，屬于自花授粉的栽培稻柱頭外露率一般較少，且雌雄蕊也較小[7]。Virmani和Athwal[8]分析比較了29個栽培稻品種和野生稻類型的柱頭外露率，發(fā)現(xiàn)柱頭外露率最低的是秈稻品種臺中本地1號，最高的是野生稻。龐漢華[9]、范樹國[10]等都在野生稻中發(fā)現(xiàn)大量高柱頭外露率的類型，許多野生稻柱頭外露率甚至達到100 %。從野生稻中發(fā)掘在栽培稻中已丟失或削弱了的優(yōu)異基因已經成為當前雜交稻育種與水稻資源研究的熱點[11]?！颈狙芯壳腥朦c】元江野生稻分布在云南省紅河州元江縣，位于紅河水系上游，是中國迄今發(fā)現(xiàn)的分布海拔最高(海拔780 m)的普通野生稻，雌蕊呈羽毛狀，柱頭紫色，外露率達100 %[12]，是研究水稻柱頭外露性狀的優(yōu)異材料。本實驗在以往研究及綜合前人研究的基礎上[13-14]，采用Li[13]及Swanson[14]方法于開花前1 d取樣，對部分檢測的基因進行實時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測，發(fā)現(xiàn)探針號為OS51408.1.S1_at在柱頭外露組織中特異表達，為進一步研究其表達調控特征和功能?！緮M解決關鍵問題】本研究克隆了元江野生稻該基因上游1.8 kb啟動子區(qū)，分析其序列結構特征，構建了相應的GUS表達載體，以進一步分析其表達調控特征，為更深入地研究水稻柱頭外露性狀的組織特異性啟動子奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料來自元江野生稻的苗期嫩綠葉片，Trizol植物組織總RNA提取試劑盒自Invitrogen公司購買，EX-Taq、First strand cDNA Synthesis kit、轉化質粒載體、DNA連接酶等采購自TaKaRa公司，感受態(tài)細胞、DNA marker、Taq酶等實驗試劑購買自上海生工；瓊脂糖回收試劑盒購買自大連寶生生物公司。所需擴增引物由上海生工合成。轉化材料于2015年5月種植于宜春學院水稻實驗基地。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

分別對元江野生稻不同時期、不同組織進行取樣，按試劑盒說明提取總RNA后，電泳檢測其質量，合格后經DNaseⅠ處理，按照First stand cDNA Synthesis試劑盒程序進行第一鏈cDNA的合成。

1.3 生物信息學功能分析

通過基因芯片數(shù)據(jù)分析，在OS51408基因編碼上游1800 pb以內，利用啟動子功能預測與分析開放軟件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)及PlantCARE(http://bioinformatcs.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),查找該區(qū)域內的CAAT與TATA框等重要的自動自序列特征，進行該啟動子功能預測，并分析其中的各順式作用元件。

1.4 OS51408在不同組織中的表達量分析

根據(jù)OS51408基因組序列，以Actin為內參基因，設計熒光定量PCR引物：OS51408-F:5’- ACGCGTTTTTCCTGAACTGC -3’;OS51408-R:5’- CGACGACAGGGGCTTAACAA-3’;OsActinA:5’-CTTCATA GGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’;OsActinB:5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’。

分別提取元江野生稻不同生長階段的幼苗、根、幼葉、花藥、柱頭、子房等組織的總RNA，反轉錄后以cDNA為模板，熒光定量PCR儀(ABI 7300)分析OS51408基因的時空表達特征，20 μl反應體系為：cDNA模板1 μl、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl、SYBR Premix Ex-Taq10 μl、ROX Reference Dye(50×)0.4 μl、 ddH2O 8.6 μl。反應程序設置：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，36個循環(huán)，添加繪制溶解曲線。每個樣品實驗重復3次，選取其中一次結果來做統(tǒng)計分析，運用2-△△T法計算該基因在不同組織中的相對表達量。

1.5 啟動子序列分析與克隆

根據(jù)預測結果，利用Primer6.0軟件(http://www.premierbiosoft.com)設計特異性引物(P51408-F：5’-ACC AGC GTC GAC CCT ATT GAG GGC GTT CCG AT-3’，P51408-R：5’-CAC CAG CGC CAT GG GTA GGC AGG ACC AGA GGA GA-3’),并設計載體構建所需的限制性內切酶SalΙ和NcoΙ識別位點(劃線部分)以元江野生稻基因組DNA為模板，用高保真DNATaq酶PCR擴增該啟動子序列。20 μl反應體系包括：PCR緩沖液Buffer4 μl，dNTP1.64 μl，上下游引物各0.5 μl，元江野生稻基因組DNA模板1 μl，DNA聚合酶0.2 μl，ddH2O至20 μl。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性1 min， 56 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次; 最后72 ℃延伸10 min。擴增產物在2 %瓊脂糖凝膠電泳下分離檢測，回收試劑盒純化目標片段。

1.6 載體構建與轉化

用限制性內切酶SalΙ和NcoΙ分別雙酶切上述回收純化的PCR擴增產物和CAMBIA1305.1表達載體，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收、純化p51408啟動子序列和去除組成型啟動子35S序列的表達載體片段，用T4-DNA連接酶(TaKaRa，大連)連接，構建pCAMBIA1305:p51408:GUS啟動子報告基因表達載體(圖1)，電擊法轉化大腸桿菌DH105B菌株的感受態(tài)細胞，經卡那霉素抗性培養(yǎng)基上篩選后擴大培養(yǎng)，菌液PCR和雙酶切后送上海生工測序驗證。

圖1 表達載體pCAMBIA1305.1-p51408-GUS結構Fig.1 The structure of expression vector pCAMBIA1305.1-p51408-GUS

用構建好、測序正確的農桿菌菌株侵染受體ZH11幼胚誘導的愈傷組織。水稻愈傷組織培養(yǎng)、農桿菌介導的遺傳轉化以及陽性愈傷組織的篩選與再分化、抗性植株再生等操作依照粳稻遺傳轉化手冊[7]。

1.7 GUS染色檢測

將陽性轉化植株葉片、花瓣、根莖等組織剪成小片，放于1.5 mL離心管中，加入預冷的90 %丙酮完全覆蓋材料，常溫處理20～30 min。以預固定組織并去除部分葉綠素。用蒸餾水將材料漂洗干凈后置于1.5 mL離心管中；加入適量配制好的GUS染色工作液至完全覆蓋材料，錫箔紙包好常溫過夜放置。用25 %，50 %，70 %，95 %乙醇梯度洗脫，搖床輕搖每次20 min，光學顯微鏡下觀察、拍照，白色背景下的藍色染色區(qū)即為GUS表達位點。

2 結果與分析

2.1 Os51408基因的表達模式

為檢驗OS51408.1.S1_at的表達特征，對該啟動子的調控基因OS51408在高柱頭外露的元江野生稻各組織中的表達情況進行了分析，從圖2可以看出，OS51408 基因在幼苗、根、幼葉、花藥、子房中表達都很低，而在外露柱頭組織中表達急劇升高，與前人水稻表達譜芯片數(shù)據(jù)庫研究結果相吻合 (http://plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy/)[13]。說明p51408啟動子與元江野生稻的柱頭外露性狀緊密相關，是柱頭外露特異性表達啟動子。

圖2 Os.51408.1.S1_at在水稻不同組織的表達值Fig.2 The expression values of Os.51408.1.S1_at in different organism of rice

2.2 轉化載體的構建及植株的獲得

為驗證該啟動子的功能，本實驗用帶有酶切位點的特異引物從元江野生稻中擴增得到p51408啟動子區(qū)(圖3)，然后用SalI和NocI雙酶切擴增片段，純化后與經同樣酶切的pCAMBIA1305.1連接，構建了pCAMBIA1305:p51408: GUS 融合基因的表達載體并雙酶切驗證(圖1，圖4)，p51408啟動子約為1．8 kb。按照粳稻遺傳轉化的方法，以中花11為受體，用潮霉素篩選抗性愈傷組織，經分化、脫分化共得到陽性轉化植株52棵。

圖3 P51408目標片段擴增Fig.3 The amplification of target fragment of P51408

圖4 載體p51408:GUS表達載體的酶切檢驗Fig.4 The enzyme-cutting test of the vector of p51408:GUS

2.3 P51408啟動子的結構特征

啟動子分析網站在線軟件Softberry(www.softberry.com/berry.phtml)進行分析，結果表明，OS51408

基因上游1.8 kb左右序列為該基因啟動子區(qū)。使用PLACE Signal Scan Program(http://www.dna.affrc.go.jp /PLACE)軟件及PlantCARE(http://bioinformatcs.psb.ugent.be /webtools/plantcare/html/)軟件分析該啟動子序列，結果如圖5所示，在-50-55和-715-720位置(翻譯起始密碼子ATG中的A堿基位定義為+1)各有1個TATA box，在初始密碼子上游-24、-533、-545位置分別存在1個CAAT box，在-38處的G堿基位置為可能的轉錄起始位點。

經進一步的結構和功能域分析后，還在p51408啟動子序列中發(fā)現(xiàn)在受植物激素(auxin)及水楊酸(salicylic acid)調控轉錄活性的CREB調控因子結合位點ASFI[15]，多個受光及植物激素調控的順式作用元件G-box[16]，3個在參與赤霉素信號傳導起重要作用的WRKY71OS 的結合位點[17],6個脫落酸響應的順式作用位點，它們多是應答干旱和寒冷脅迫信號的MYB、MYC 蛋白因子專化識別的保守序列[18-19]；及植物組織特異表達和激素誘導rolB基因結合位點NTBBF1元件[20]。

圖5 p51408啟動子系列部分應答元件Fig.5 The reply elements of p51408

A:柱頭，B：根，C：莖，D：葉，E：穎花A: Stigma，B：Root，C：Stem，D：Leaf，E：Spikelet圖6 不同組織的GUS染色結果Fig.6 The stained results of GUS in different organism

2.4 轉化植株的GUS表達檢測

從圖6可以看出，利用GUS進行組化染色，對52株水稻轉化植株的各組織表達情況進行分析，結果表明，在轉化植株中p51408啟動子能夠驅動GUS在水稻柱頭組織中特異表達，檢測到較強的表達信號(圖6A)，而在根、莖，葉及幼穗中無表達或低表達(圖6 B，C，D，E)，從而推測該啟動子為柱頭組織特異性啟動子。

3 討 論

植物組織特異性啟動子的研究已成為近年來分子生物學、植物功能基因和基因工程研究的一個重要方向，也將成為植物基因改良的重要工具[21-22]。柱頭外露是水稻異交結實中一個非常重要的性狀，目前的研究主要集中在栽培措施的調控、性狀的QTL定位上，而柱頭外露的基因功能、分子生物學的機理及其相關基因功能研究并未系統(tǒng)地開展[6]。盡管很多研究人員在水稻柱頭外露性狀QTL基因定位的研究方面已有很多報道，共檢測到與柱頭外露率相關的QTLs 多達40余個[4-6]，但其研究結果并不完全一致，這也反應出柱頭外露性狀QTL遺傳的復雜性。而通過特異性的材料，從啟動子的功能和表達特性這個獨特的角度對這一復雜性狀進行研究，將為該性狀的研究提供另一種思路和有益的探索。

4 結 論

本研究利用元江野生稻柱頭外露高的這一特殊特點，克隆了具有柱頭組織特異性并與其調控密切相關的啟動子p51408。運用生物信息學手段對其結構進行了預測，揭示其包含多個受植物激素、光照誘導及組織器官特異性應答元件，如ASFI、G-box、WRKY71OS、NTBBF1等，從另一方面也說明了柱頭外露的外源激素調控的分子基礎；表達模式分析顯示對其調控基因OS51408在幼苗、根、幼葉、花藥、子房中表達較低，而在柱頭中表達量高，表明其具有組織特異表達特性；構建載體GUS轉化染色顯示其在花柱及柱頭特異表達，在根、莖、葉及穎花中低或者不表達，表明p51408具有較強的柱頭組織特異表達特性，將有助于進一步開展與該性狀相關的啟動子調控的研究，并為開展水稻柱頭外露性狀的分子機理和調控研究奠定基礎。

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(責任編輯 王家銀)

CloningandFunctionalAnalysisofSpecificPromoterp51408inStigmaExsertionofWildRice(OryzarufipoganGriff.)fromYuanjiangCity

ZHOU Guo-hua1,2

(1.College of Life Sciences and Environment Resource, Yichun University, Jiangxi Yichun 336000，China; 2.College of Agronomy and Bio-technology, Yunan Agricultural Universty, Yunnan Kunming 650201，China)

【Objective】The stigma exsertion of rice(OryzasativaL.) was an important trait determining the outcrossing rates, which was also a key factor influencing the hybrid seed production and sterile line breeding, so the research of tissue-specific expression of stigma exsertion of rice would laid the foundation of the molecular mechanism in heterosis of rice. 【Method】 In this paper, a specific expression promoter p51408 related with stigma exsertion of wild rice (OryzarufipogonGriff.) from Yuanjiang City was cloned, the structural character of its sequence and expression feature of os51408 was analyzed. 【Result】With the construction of GUS expression vector and histochemical staining，the results showed that it was specific expression in stigma and style, no or low expression in root, stem, leaf and spikelet. 【Conclusion】So it could be a tissue-stigma specific expression promoter, and might play a very important role in rice stigma exsertion research.

Rice; Stigma exsertion; Specific promoter; Clone

S511

A

1001-4829(2017)11-2393-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.001

2016-07-09

國家自然科學基金項目(31200219)；江西省教育廳基金項目(GJJ151048)

周國華(1977- )，男，博士，主要研究方向：水稻雜種優(yōu)勢利用、水稻分子生物學，E-mail:zghynau@sina.com。