硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)局部刺激性試驗(yàn)與溶血性試驗(yàn)

劉桂蘭 ， 聶麗娜 ， 夏雪林 ， 劉愛玲 ， 王建鋒 ， 鄧旭明

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林 長春 130062 ； 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 ， 天津 東麗 300300)

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)局部刺激性試驗(yàn)與溶血性試驗(yàn)

劉桂蘭1,2， 聶麗娜2， 夏雪林2， 劉愛玲2， 王建鋒1， 鄧旭明1

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林 長春 130062 ； 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 ， 天津 東麗 300300)

頭孢喹肟(Cefquinome)又名頭孢喹諾、頭孢喹咪、克百特。為動物專用的第4代頭孢類抗生素，其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有很強(qiáng)的殺滅作用[1]，在動物體內(nèi)藥動學(xué)特點(diǎn)良好，吸收快、達(dá)峰時(shí)間短、生物利用度較高[2]。由于其抗菌效果好，毒性低，殘留低，安全性高，目前已被歐盟批準(zhǔn)主要用于敏感菌引起牛、豬的呼吸道感染與奶牛的乳腺炎治療[3]。為了科學(xué)評價(jià)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)的安全性，參考國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014)[4]相關(guān)要求，分別進(jìn)行皮膚刺激性試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)。預(yù)測臨床用藥的安全性，為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)提供參考。

1 皮膚刺激性試驗(yàn)

1.1 受試物名稱 硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：8 g/支；含頭孢喹肟75 mg，批號：20110305。對照藥物：制劑賦形劑，購自浙江田雨山藥用油有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 大耳白兔8只，雌、雄各半，體重2 kg左右，購自天津?qū)嶒?yàn)動物中心。

1.3 試驗(yàn)方法 用同體左右側(cè)自身對比法。

1.3.1 正常皮膚刺激性試驗(yàn) 選用大耳白家兔4只，試驗(yàn)前24 h在背部進(jìn)行剃毛，去毛范圍左、右各3 cm×3 cm。試驗(yàn)前觀察暴露皮膚，無損傷皮膚方可進(jìn)行試驗(yàn)。取硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)0.5 mL直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層玻璃紙覆蓋，再用膠布加以固定；另一側(cè)涂布注射用大豆油作為對照。貼敷時(shí)間至少4 h。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。間隔8h，按上述方法再進(jìn)行1次，連續(xù)4次。

1.3.2 破損皮膚刺激性試驗(yàn) 選用大耳白家兔4只，雌、雄各半，去毛方法同上，在用藥部位劃“井”字并以滲血為度。取硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)0.5 mL直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層玻璃紙覆蓋，再用膠布加以固定；另一側(cè)涂布制劑賦形劑大豆油作為對照。貼敷時(shí)間為4 h。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。間隔8 h，按上述方法再進(jìn)行1次，連續(xù)4次。

1.4 結(jié)果觀察 在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應(yīng)。按皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)(見表3)對皮膚紅斑和水腫進(jìn)行評分。

在每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前，觀察及記錄紅斑及水腫、涂敷部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發(fā)生時(shí)間及消退時(shí)間，并對紅斑及水腫進(jìn)行評分。末次貼敷后，在去除藥物后30～60 min，24、48h和72 h肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況，代表性圖片見圖1、圖2所示。皮膚觀察結(jié)果見表1、表2。

圖1 正常皮膚敷藥第4次貼敷后72 h相連，表面光滑，質(zhì)地柔軟，易碎

圖2 破損皮膚敷藥第4次貼敷后72 h

1.5 結(jié)果評價(jià) 按表4進(jìn)行刺激性強(qiáng)度評價(jià)。

1.6 試驗(yàn)結(jié)果評價(jià) 硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)對家兔的正常皮膚和破損皮膚均無刺激性。該試驗(yàn)系統(tǒng)與牛粘膜刺激反應(yīng)相當(dāng)。

2 溶血性試驗(yàn)-常規(guī)的體外試管法(肉眼觀察法)

2.1 受試物名稱 硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：8 g/支；含頭孢喹肟75 mg，批號：20110305。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物 兔血約30 mL

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 血細(xì)胞懸液的配制 取兔血約30 mL，放入

表1 正常皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

表2 破損皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

表3 皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表4 皮膚刺激強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，或用玻璃棒攪動血液，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，1 000～1 500 r/min 離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，供試驗(yàn)用。

2.3.2 受試物的制備 取硫酸頭孢喹肟乳房注入劑用0.9%氯化鈉溶液1∶3稀釋后作為供試品溶液。

2.3.3 試驗(yàn)方法 取潔凈試管7只，進(jìn)行編號，1～5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按表5所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉溶液或蒸餾水，混勻后，立即置 37±0.5 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。按下列順序加入各種溶液。

表5 溶血性試驗(yàn)操作過程

2.3.4 結(jié)果觀察與判斷 溫育15、30、45、60、120、180 min后，對受試物管、陰性對照、陽性對照所有試管進(jìn)行平行觀察，含不同受試物的1～5號血細(xì)胞混懸液管、生理鹽水陰性對照管均未發(fā)生溶血和凝聚，溫育過程中血細(xì)胞逐漸下沉，上層液清晰、無色，下層為紅色，無凝聚發(fā)生。含蒸餾水的陽性對照管溶液在30 min時(shí)，溶液上層呈澄明紅色，不再是無色狀態(tài)，說明有溶血發(fā)生，下層為紅色；溫育至120 min時(shí)，整體溶液呈澄明紅色，與其他澄明無色的上層液有明顯區(qū)別。由此判斷陰性對照管無溶血和凝聚發(fā)生，陽性對照管有溶血發(fā)生，受試物管中的溶液在3 h內(nèi)未發(fā)生溶血和凝聚。

3 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)驗(yàn)證了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)非口服給藥途徑的皮膚刺激性，選擇大耳白家兔，用同體左右側(cè)自身對比法，通過制劑對正常皮膚刺激性試驗(yàn)、破損皮膚刺激性試驗(yàn)，采用皮膚評分法進(jìn)行評價(jià)，試驗(yàn)組皮膚均無紅斑和水腫，皮膚刺激反應(yīng)評分均為0分。取兔血，1∶3稀釋硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)制劑后，分別按2%～10%不同比例加入2%紅細(xì)胞懸液中，測定制劑可能引起的溶血可能性，結(jié)果表明，受試物紅細(xì)胞混懸溶液在3 h內(nèi)未發(fā)生溶血和凝聚。上述結(jié)果表明，硫酸頭孢喹肟乳房注入劑(泌乳期)對家兔的皮膚無刺激性反應(yīng)，無溶血性反應(yīng)，提示本品的應(yīng)用安全性良好。

局部刺激性與溶血性試驗(yàn)是針對藥物的自身特點(diǎn)，對擬用于臨床制劑的安全性評估，評估時(shí)將原料藥刪除后的制劑賦形劑作為對照，重點(diǎn)考察皮膚局部及周圍相關(guān)部位的反應(yīng)，有助于提示臨床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。藥物整體的不良反應(yīng)或安全性，還要結(jié)合藥學(xué)、藥效學(xué)、其他毒理學(xué)及臨床應(yīng)用信息，通過合理、客觀的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究，來最終確定，這些信息均對指導(dǎo)臨床用藥有重要價(jià)值。

[1] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009.

[2] 杜向黨，李新生，吳寧鵬，等. 頭孢喹諾最新研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī). 2006, 33(9):87-89.

[3] 王付民，陳杖榴.頭孢喹諾的研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2004, 25(4):50-53.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局(2014-05-03). 化學(xué)刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/101018.html.

2017-09-15

天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)(ITTCRS2017008)

劉桂蘭(1975-)，女，高級畜牧師，博士生，從事獸藥研發(fā)工作，E-mail:liuguilanever@163.com;聶麗娜(1983-)，女，助理工程師，碩士生，從事獸藥制劑開發(fā)工件，E-mail:364608867@qq.com

注：聶麗娜和劉桂蘭對本文具有同等貢獻(xiàn)

劉愛玲，E-mail:liual@ringpu.com