豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白的表達及抗原性鑒定

劉夢志 ， 陳 欣 ， 金淑秀 ， 張藝凡 ， 蔣佳羲 ， 劉寶山

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院 ， 遼寧 沈陽 110866)

豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白的表達及抗原性鑒定

劉夢志 ， 陳 欣 ， 金淑秀 ， 張藝凡 ， 蔣佳羲 ， 劉寶山

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院 ， 遼寧 沈陽 110866)

為研究豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF3蛋白的免疫活性，對其進行了表達及初步鑒定。根據(jù)NCBI上PCV-2 ORF3的基因序列(FR823451)設計特異性引物，擴增后將其插入pET28a表達載體構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-PCV-2-ORF3，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)誘導表達后用SDS-PAGE和免疫印跡進行了鑒定。隨后又用圓環(huán)病毒野毒感染豬和重組ORF2免疫小鼠的陽性血清對表達蛋白的免疫原性進行了檢測。結(jié)果表明，構(gòu)建成功的pET-PCV-2-ORF3表達菌被誘導后能大量表達PCV-2 ORF3蛋白。ORF3表達蛋白能與圓環(huán)病毒野毒感染豬的陽性血清發(fā)生特異性反應，與重組疫苗免疫鼠的陽性血清不能發(fā)生反應，表明ORF3蛋白具有很好的免疫原性和反應原性，有望作為圓環(huán)病毒野毒感染檢測的靶抗原。

PCV-2 ； ORF3 ； 表達 ； 鑒定

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染引起的豬傳染病，可表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、豬呼吸系統(tǒng)衰弱綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等疾病類型，而且還與母豬繁殖障礙、育肥豬炎性呼吸道病綜合征(PRDC)及仔豬腸炎有關[1-3]?，F(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后重要的豬傳染病[2, 4]。

豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為單股負鏈環(huán)狀DNA病毒。該科的病毒粒子直徑14～25 nm，為20面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，是已知的最小的動物病毒之一。PCV-2基因組全長為1 767～1 768 bp，含有11個可能的ORFs。PCV-2的2個最主要閱讀框是ORF1和ORF2。ORF1基因是PCV中最大的開放閱讀框，與病毒的滾環(huán)復制相關。ORF1基因全長936 bp (PCV-1)和945 bp (PCV-2)，編碼312～314個氨基酸的Rep蛋白，Rep蛋白分子質(zhì)量約為37 ku。ORF1序列相當保守，是PCV-1和PCV-2產(chǎn)生抗原交叉反應的主要原因[5]；ORF2基因是病毒第二大開放閱讀框，是病毒的核衣殼蛋白，全長702 bp，編碼233個氨基酸，編碼病毒的Cap蛋白，該蛋白相對分子質(zhì)量約為30；ORF2含有4 個免疫反應點，其中69～83 aa位和117～131 aa位堿基編碼的蛋白質(zhì)對PCV-2抗血清有特異性[5]。

ORF3基因是近年來研究的熱點，該基因位于ORF1基因的內(nèi)部，是除ORF1、ORF2外較大的閱讀框，在基因組互補鏈上的方向與ORF1基因相反，全長由315個核苷酸組成，編碼由104個氨基酸組成的非結(jié)構(gòu)蛋白。Liu等采用基因定點突變技術使ORF3基因缺失，并用基因缺失的該病毒進行PK-15細胞感染試驗，結(jié)果表明，ORF3編碼蛋白在培養(yǎng)細胞病毒復制中屬非必需蛋白，它是通過誘導細胞凋亡從而在致病性方面發(fā)揮作用[6]；進一步分析發(fā)現(xiàn)，ORF3蛋白通過與pPirh2反應或干擾p53與pPirh2的連接，而導致PCV-2感染細胞的凋亡[7-8]。

ORF3基因是除 ORF1、ORF2外較大的閱讀框，表達蛋白通過誘導細胞凋亡從而在致病性方面發(fā)揮作用[9]，其基因的缺失或變異均能減弱 PCV-2的致病。研究還發(fā)現(xiàn)，PCV-2 ORF3蛋白可以引起免疫小鼠血清中IL-4的濃度顯著升高(Plt;0.05)，而對IL-10、IL-12和INF-γ的濃度沒有影響，表明ORF3蛋白在PCV-2誘發(fā)的體液免疫中發(fā)揮一定的作用[10]。但ORF3刺激機體產(chǎn)生抗體的情況尚未有統(tǒng)一的報道[11-12]，本研究對此進行了研究。

1 材料與試劑

1.1 圓環(huán)病毒陽性病料 2份試驗所用的圓環(huán)病毒DNA由沈陽信科農(nóng)業(yè)技術有限公司提供。

1.2 載體及菌株 試驗所用的pET28a原核表達載體和E.coliBL21(DE3)菌株由本實驗室保存。

1.3 抗體及試劑 豬圓環(huán)病毒野毒感染抗體、重組ORF疫苗免疫小鼠的陽性血清由沈陽信科農(nóng)業(yè)技術有限公司提供；6×His單克隆抗體、HRP標記的蛋白G、IPTG、DAB顯色試劑盒、硝酸纖維素膜，均購自上海生工生物工程技術服務有限公司； PremixTaq、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，均購自寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)。

2 方法和結(jié)果

2.1 引物的設計與合成 根據(jù)NCBI上發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因序列(FR823451)，使用分子生物學軟件prime premier 5.0設計并合成了1對可以擴增ORF3全長基因的引物。PCVORF3F： 5′-tttt gga tcc ATG GTA ACC ATC CCA CCA C-3′，PCVORF3R：5′-tttt gaa ttc TTA CTT ATT GAA TGT GGA GCT C-3′。為簡化試驗步驟，引物兩端分別設計了保護性堿基和限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2.2 圓環(huán)病毒2型ORF3基因的PCR擴增 在PCR管中依次加入超純水2 μL，PremixTaq5 μL、20 mol/L的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，混勻后短暫離心，進行PCR反應。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)后，72 ℃再延伸5 min。PCR結(jié)束后產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在250 bp和500 bp的條帶中間出現(xiàn)1條擴增條帶(圖1)，與預期目的片段315 bp相符。

圖1 PCV-2 ORF3基因的PCR擴增

2.3 圓環(huán)病毒2型ORF3表達載體pET-PCV-2-ORF3的構(gòu)建 將BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的特異性擴增片段和pET-28a質(zhì)粒膠回收后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進行PCR和BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定。質(zhì)粒1和2在315 bp處各獲得一特異性條帶(圖2)，說明豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因已重組到載體中，為陽性克隆。然后將質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測序，BLAST鑒定為圓環(huán)病毒ORF3序列。

圖2 PCV-2 ORF3基因的PCR和酶切鑒定

2.4 ORF3重組陽性菌的誘導表達和SDS-PAGE電泳 將鑒定正確的ORF3重組表達菌接種于4 mL含Kan(50g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，當其OD600約為0.40.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導表達4 h，然后取1 mL離心收集菌體沉淀。在收集的菌體沉淀中加入SDS-PAGE 上樣緩沖溶液100L，震蕩混勻后煮沸裂解10 min，離心取上清進行SDS-PAGE電泳。

SDS-PAGE電泳表明，誘導菌在15 ku附近出現(xiàn)大量的蛋白表達，和未誘導菌形成鮮明的對比(圖3)，表明蛋白誘導表達成功。

圖3 重組ORF3蛋白的SDS-PAGE鑒定

M：蛋白Marker; 1：未誘導菌； 2：誘導菌

2.5 重組ORF3蛋白的免疫印跡鑒定 誘導菌SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，使用1∶100倍稀釋的6×His單克隆抗體作為一抗，1∶1 000 倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠血清作為二抗對重組蛋白進行Western-Blot分析。

Western-Blot結(jié)果表明，誘導菌在15 ku的位置上出現(xiàn)了顯著的免疫印跡條帶(圖4)，位置和SDS-PAGE電泳位置相同，表明表達蛋白為ORF3的6×His融合蛋白。

2.6 ORF3與豬陽性血清的免疫反應性測定 分別使用1∶100倍稀釋的圓環(huán)病毒野毒感染豬的陽性血清和重組ORF2疫苗免疫鼠的血清作為一抗，1∶1 000 倍稀釋的HRP標記的蛋白G作為二抗對重組蛋白作Western-Blot分析。

Western-Blot結(jié)果表明，用重組ORF2免疫鼠的血清作為一抗時，誘導菌和對照菌在15 ku處沒有出現(xiàn)明顯的條帶差異，表明重組表達的ORF3和血清沒有反應(圖5A)，免疫鼠的血清中無ORF3抗體；而在使用圓環(huán)病毒野毒感染豬的陽性血清作為一抗時，15 ku的附近位置出現(xiàn)了明顯的免疫印跡條帶(圖5B)，而對照菌體未出現(xiàn)可見條帶，表明重組ORF3表達蛋白能與野毒感染豬陽性血清發(fā)生反應，具有反應原性。同時也間接表明PCV-2的ORF3蛋白能刺激感染動物機體產(chǎn)生相應抗體，具有免疫原性。

圖4 6His單抗的免疫印跡鑒定

圖5 重組疫苗免疫血清和野毒感染血清的免疫印跡鑒定

A．重組疫苗免疫血清； B. 野毒感染血清M：蛋白Marker; 1：未誘導菌；2：誘導菌

3 討論

PCV-2包括4個基因亞型，即PCV-2a，PCV-2b，PCV-2c和PCV-2d。我國報道的PCV-2分離毒株的基因型主要是PCV-2a和PCV-2b，其中PCV-2b已成為近年來國內(nèi)流行范圍最廣的基因型[13]。

對于PCV-2感染的防控，除了采取綜合防治措施外，疫苗免疫接種已經(jīng)成為病毒污染嚴重豬場的主要措施。我國市場上批準銷售的疫苗有桿狀病毒表達的PCV-2 ORF2亞單位疫苗(勃林格殷格翰和英特威/先靈葆雅)、PCV-1-PCV-2嵌合體疫苗(美國富道)和全病毒滅活疫苗(法國梅里亞和國內(nèi)各疫苗廠家)[14]。但這些商品化疫苗主要針對PCV-2a型病毒，雖對PCV-2b型病毒也產(chǎn)生交叉保護，但不能完全控制PCV-2b型病毒在豬群中的傳播[13]。同時，生產(chǎn)中還存在免疫抑制、免疫不當、漏免等情況，造成疫苗免疫豬群中部分豬仍然存在野毒感染的情況，這對于豬場進行圓環(huán)病毒的防控和凈化非常不利。借鑒偽狂犬的凈化經(jīng)驗，要更好地進行圓環(huán)病毒的防控和凈化，還需要一種在免疫豬群中檢測野毒感染豬的手段，以便將野毒感染豬從免疫豬場進行剔除，減少豬場野毒感染的壓力，逐步做到PCV-2的凈化。然而，現(xiàn)有的商品化PCV-2抗體檢測試劑盒均檢測ORF2蛋白抗體，而ORF2蛋白在疫苗和野毒中都存在，所以它們不能將疫苗免疫豬和野毒感染豬區(qū)分開，不能進行免疫豬群中野毒感染豬的鑒定，只能用來進行非免疫豬群野毒感染的檢測及免疫豬群免疫效果的評價。

ORF3基因是PCV-2中除ORF1、ORF2外較大的閱讀框，位于基因組671～ 356 bp位堿基( 復制起始點作為序列起始)，共 315 bp，編碼104 個氨基酸。研究表明， ORF3 編碼蛋白在培養(yǎng)細胞的病毒復制中屬非必需蛋白，但可以通過與pPirh2 反應或干擾p53與pPirh2的連接，導致PCV-2感染細胞凋亡，從而在致病性方面發(fā)揮作用[9]，ORF3 蛋白的缺失或變異均能減弱PCV-2的致病。其他試驗還表明，ORF3( 特別是前50個氨基酸) 在豬感染 PCV-2導致PCVAD 中也起一定的作用。2013年王亞軍等報道發(fā)現(xiàn)，PCV-2 ORF3蛋白可以引起免疫小鼠血清中IL-4的濃度顯著升高(Plt;0.05)，而對IL-10、IL-12和INF-γ的濃度沒有影響，表明ORF3蛋白在PCV-2誘發(fā)的體液免疫中發(fā)揮一定的作用[10]，可以影響病毒衣殼蛋白在機體內(nèi)的免疫效果。2015年Choi等發(fā)現(xiàn)，ORF3蛋白也能促進豬上皮細胞IL-6、IL-8的分泌[15]。但ORF3刺激機體產(chǎn)生抗體的情況尚未有統(tǒng)一的報道，2012年楊曉燕等克隆表達了PCV-2 ORF3蛋白，免疫印跡表明其能夠和PCV-2陽性血清發(fā)生特異性相互作用[11-12]；而2010年冉旭華等卻發(fā)現(xiàn)重組ORF3與陽性血清之間沒有免疫反應[12]。

為分析PCV-2 ORF3蛋白的免疫原性，本研究對其進行了重組表達和免疫印跡，結(jié)果其能與 PCV-2野毒感染豬的陽性血清發(fā)生反應，而與重組ORF2疫苗免疫鼠的血清不發(fā)生反應，表明其在野毒感染過程中能刺激動物機體產(chǎn)生相應抗體，有望作為野毒感染抗體檢測ELISA試劑盒的靶抗原，從ORF2重組疫苗免疫豬群中鑒定出野毒感染豬，便于豬場的圓環(huán)病毒凈化。

本試驗使用野毒感染豬的血清進行表達蛋白的免疫印跡時出現(xiàn)了很多的雜帶，應是血清中含有大腸桿菌抗體與重組表達菌的菌體蛋白發(fā)生反應所致。

[1] 袁婧, 魏萍, 劉長明. 豬圓環(huán)病毒2型引起相關腸炎疾病的研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展, 2013,34(10):92-95.

[2] 薛健. 豬圓環(huán)病毒的研究進展[J]. 國外畜牧學(豬與禽), 2014,34(12):48-49.

[3] Baro J, Segales J, Martinez J. Porcine circovirus type 2 (PCV-2) enteric disease: an independent condition or part of the systemic disease?[J]. Vet Microbiol, 2015,176(1-2):83-87.

[4] 孫健, 楊久仙. 豬圓環(huán)病毒病的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2014(13):52-54.

[5] 來景輝, 張?zhí)锰? 范紅結(jié). 豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2013(13):24-27.

[6] Liu J, Chen I, Kwang J. Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis[J]. J Virol, 2005,79(13):8 262-8 274.

[7] Liu J, Zhu Y, Chen I,etal. The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 interacts with porcine ubiquitin E3 ligase Pirh2 and facilitates p53 expression in viral infection[J]. J Virol, 2007,81(17):9 560-9 567.

[8] Karuppannan A K, Liu S, Jia Q,etal. Porcine circovirus type 2 ORF3 protein competes with p53 in binding to Pirh2 and mediates the deregulation of p53 homeostasis[J]. Virology, 2010,398(1):1-11.

[9] Hough K P, Rogers A M, Zelic M,etal. Transformed cell-specific induction of apoptosis by porcine circovirus type 1 viral protein 3[J]. J Gen Virol, 2015,96(Pt 2):351-359.

[10] 王亞軍, 楊順利, 才學鵬. 豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的表達及其表達產(chǎn)物免疫小鼠后致細胞因子變化的研究[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2013,43(06):583-587.

[11] 楊曉燕, 劉航, 楊順利, 等. 豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的克隆及原核表達[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學, 2012(03):120-122.

[12] 冉旭華, 李樹東, 聞曉波, 等. 豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的原核表達[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010,37(06):171-174.

[13] 趙晨辰, 王敏, 劉長輝, 等. 豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學及疫苗研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 2015,49(02):63-69.

[14] 田克恭, 李明. 動物疫病診斷技術 理論與應用[M] :北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2014.

[15] Choi C Y, Rho S B, Kim H S,etal. The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 (PCV2) promotes secretion of IL-6 and IL-8 in porcine epithelial cells by facilitating proteasomal degradation of Regulator of G protein Signaling 16 (RGS16) through physical interaction[J]. J Gen Virol, 2015.

ExpressionandIdentificationofORF3ProteinofPCV2

LIU Meng-zhi , CHEN Xin , JIN Shu-xiu , ZHANG Yi-fan , JIANG Jia-xi , LIU Bao-shan

(Husbandry and Veterinary Academy, Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866,China)

To study the function of ORF3 protein of PCV2, we expressed it and investigated its immunity activity. After designing a pair of specific primers according to the NCBI PCV2 ORF3 gene sequence, it was amplified and inserted into pET28a expression vector for the construction of the recombinant expression vector pET-PCV2-ORF3. After transforming the vector into E.coli BL21 (DE3), recombinant ORF3 protein was induced to express and its immunity activity was identified with 6his monoclonal antibody and positive serum of wild virus infected pigs by western blot. The results showed that the successful built pET-PCV2-ORF3 expressing bacterium was induced to express ORF3 protein. The rORF3 protein reacted with the positive serum of wild virus infected pigs in western blot, but didn’t react with positive serum of Vaccine-inoculated mice. These suggest that ORF3 protein has good immunogenicity and can be used as aim antigen to differentiate the inoculated pigs and infected pigs in the future.

PCV2 ； ORF3 ； Expression ； Identification

LIU Bao-shan

S855.3

A

0529-6005(2017)10-0055-04

2016-10-19

沈陽農(nóng)業(yè)大學2015年大學生創(chuàng)新訓練項目

劉夢志(1992-)，男，碩士生，研究方向為預防獸醫(yī)學，E-mail：865211615@qq.com

劉寶山，E-mail：liubaoshanl@163.com