納豆芽孢菌劑對放養(yǎng)初期黑天鵝血液中IL-10和APRIL含量的影響

陳 斌 , 張占俠 , 孔佳佳 , 趙洪妹 , 劉偉娟 , 陳 葉 , 劉立賢 , 李勇軍 , 董 超

(1.石家莊市動物園管理處 ， 河北 石家莊 050200 ； 2.武安市農(nóng)牧局冶陶動物防疫監(jiān)督站 ， 河北 邯鄲 056300 ；3.河北省昌黎縣農(nóng)林畜牧水產(chǎn)局 ， 河北 秦皇島 066600 ； 4.河北省科學(xué)院生物研究所 ， 河北 石家莊 050081)

納豆芽孢菌劑對放養(yǎng)初期黑天鵝血液中IL-10和APRIL含量的影響

陳 斌1, 張占俠1, 孔佳佳2, 趙洪妹3, 劉偉娟1, 陳 葉1, 劉立賢1, 李勇軍1, 董 超4

(1.石家莊市動物園管理處 ， 河北 石家莊 050200 ； 2.武安市農(nóng)牧局冶陶動物防疫監(jiān)督站 ， 河北 邯鄲 056300 ；3.河北省昌黎縣農(nóng)林畜牧水產(chǎn)局 ， 河北 秦皇島 066600 ； 4.河北省科學(xué)院生物研究所 ， 河北 石家莊 050081)

通過檢測試驗前后黑天鵝血清中白介素-10(IL-10)和增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)含量，探討納豆芽孢菌劑對放養(yǎng)初期黑天鵝血液中細(xì)胞因子的影響。選取放養(yǎng)初期露天圈養(yǎng)的黑天鵝16只，隨機(jī)分為對照組和試驗組，對照組正常飼養(yǎng)，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加10%納豆芽孢菌劑。記錄體重和采食量變化，測定多個時間點血清中IL-10和APRIL含量。對照組黑天鵝體重和采食量均增加，試驗前后血清中IL-10沒有顯著變化，APRIL先增高后下降；試驗組黑天鵝體重增加，采食量下降，血清中IL-10降低，APRIL增高。表明黑天鵝在放養(yǎng)初期飼喂納豆芽孢菌劑，能夠增強(qiáng)動物體質(zhì)，抑制IL-10分泌，促進(jìn)APRIL分泌，主動提高免疫能力，減少病原入侵機(jī)體的機(jī)會，增強(qiáng)放養(yǎng)初期的黑天鵝抗病能力。

納豆芽孢菌劑 ； 黑天鵝 ； 細(xì)胞因子 ； 白介素-10 ； 增殖誘導(dǎo)配體

動物園外放到人工湖的珍貴游禽，在外放初期容易患病，導(dǎo)致存活率較低。前期研究表明[1]，珍貴游禽在這個時期，飼喂納豆芽孢菌劑，發(fā)病顯著減少，外放入人工湖后6個月內(nèi)未出現(xiàn)死亡。納豆芽孢菌劑能夠提高動物生產(chǎn)性能、抗病能力[2-3]和魚的非特異性免疫[4]，但在野生動物免疫方面未見報道。本試驗從細(xì)胞因子角度探索納豆芽孢菌劑增強(qiáng)放養(yǎng)初期的黑天鵝抗病能力的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和材料 黑天鵝：雁形目、鴨科、天鵝屬。亞成年體，全部按規(guī)程進(jìn)行免疫。納豆芽孢菌劑：為納豆芽孢桿菌發(fā)酵的全產(chǎn)物制劑，由河北省科學(xué)院生物研究所研制?；罹?×108/g，γ-多聚谷氨酸25 mg/g，納豆激酶20 000 IU/g，納豆蛋白肽30 mg/g，無機(jī)鹽0.025 g/g，環(huán)糊精載體0.9 g/g。

1.2 試驗設(shè)計 黑天鵝為16只，完全隨機(jī)分為對照組和試驗組，每組各8只，佩帶編號腳環(huán)。進(jìn)行5日預(yù)飼養(yǎng)，飼喂基礎(chǔ)日糧并記錄采食量，若采食量差異顯著則進(jìn)行重新分組，若兩組采食量差異不顯著則進(jìn)入試驗期。在試驗期中，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加10%納豆芽孢菌劑?；A(chǔ)日糧成分詳見表1。

表1 對照組和試驗組日糧組成

1.3 飼養(yǎng)管理 黑天鵝由孵化室內(nèi)轉(zhuǎn)入人工湖湖心島露天圈養(yǎng)，對照組和試驗組分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期40 d，其中前5 d為預(yù)飼喂期，后35 d為試驗期。

1.4 樣本采集與指標(biāo)測定

1.4.1 樣本采集 對照組：飼喂基礎(chǔ)日糧并記錄采食量。試驗組：在基礎(chǔ)日糧中添加10%納豆芽孢菌劑，記錄采食量。兩組在試驗期第1、12、35天稱重。在試驗期第1、6、12、35天，于腿部內(nèi)側(cè)采取靜脈血，完全凝血后，4 000 r/min離心5 min，分離血清，在-20 ℃保存。

1.4.2 指標(biāo)測定 采用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo)測定血清中白介素10(IL-10)和增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)含量。具體步驟按照試劑盒(IL-10試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，APRIL試劑盒，購自Cloud-Clone Corp.)按說明書操作。

1.5 統(tǒng)計與分析 采用SSPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、配對樣本t檢驗和單因素方差分析，Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著，Pgt;0.05為差異不顯著，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢菌劑對黑天鵝采食和體重影響 選取預(yù)飼喂期5 d(預(yù)飼喂期)，試驗期第1-5天(試驗前期)，第11-15天(試驗中期)，第31～35天(試驗?zāi)┢?的采食量進(jìn)行比較。飼養(yǎng)期采食量變化趨勢見表2，體重變化見表3。

由表2可知，對照組和試驗組在預(yù)飼喂期和試驗初期采食量差異不顯著(Pgt;0.05)，所以分組合理，可以繼續(xù)試驗。試驗?zāi)┢冢瑢φ战M高于試驗組，差異極顯著(Plt;0.01)。

試驗所用黑天鵝處于成長期，通常認(rèn)為動物隨著成長，采食量和體重會逐步增加。對照組采食量從預(yù)飼喂期到試驗?zāi)┢?，采食量逐步增加，試驗?zāi)┢诓墒沉扛哂谠囼炃捌?，差異極顯著(Plt;0.01)。試驗組采食量從預(yù)飼喂期到試驗初期，采食量增加，從試驗初期到試驗?zāi)┢诓墒沉繙p少，差異顯著(Plt;0.05)。

由表3可知，對照組和試驗組體重均呈現(xiàn)增長趨勢。試驗各階段兩組間體重差異不顯著(Pgt;0.05)，試驗期第35天重于第1天，差異極顯著(Plt;0.01)。

表2 采食量變化

注：不同小寫英文字母表示同列組間差異顯著(Plt;0.05)，不同大寫英文字母表示同行組間差異顯著(Plt;0.05)，肩標(biāo)相同者表示差異不顯著，下表同

表3 體重變化

2.2 納豆芽孢菌劑對黑天鵝血液中IL-10和APRIL的影響 兩組黑天鵝血液中IL-10的變化見表4，APRIL的變化見表5。

由表4可知，組間比較，試驗期對照組與試驗組第1天IL-10差異不顯著(Pgt;0.05)。第6、12、35天，對照組低于試驗組，差異極顯著(Plt;0.01)。組內(nèi)比較，試驗期對照組各組間差異均不顯著(Pgt;0.05)；試驗組第35天IL-10低于第1天，差異極顯著(Plt;0.01)；試驗組第35天與第12天IL-10差異不顯著(Pgt;0.05)。對照組IL-10在試驗期中差異不顯著(Pgt;0.05)。

由表5可知，組間比較，試驗期對照組與試驗組第1天APRIL差異不顯著(Pgt;0.05)。第6、12、35天，對照組高于試驗組，差異極顯著(Plt;0.01)。組內(nèi)比較，對照組第6天APRIL高于第1、12、35天，差異顯著(Plt;0.05)；對照組第1、12、35天的APRIL差異不顯著(Pgt;0.05)；試驗組第35天APRIL高于第1天，差異極顯著(Plt;0.01)；試驗組第12天APRIL高于第1天，差異極顯著(Plt;0.01)；試驗組第35天APRIL與第12天差異不顯著(Pgt;0.05)。對照組在試驗第6天出現(xiàn)顯著升高，在第12天又顯著降低。

表4 黑天鵝血液中IL-10變化

表5 黑天鵝血液中APRIL變化

3 討論

動物的免疫機(jī)能是抵御病原感染的主要力量，細(xì)胞因子在其中發(fā)揮重要作用[5]。黑天鵝在圈養(yǎng)期間接觸病原機(jī)會較小，但是外放后接觸其他禽類、采食非飼料食物等情況使得感染機(jī)會大增[6]，所以外放后6個月內(nèi)是其患病和死亡的高峰期。在外放前的過渡飼養(yǎng)期內(nèi)，提高黑天鵝的免疫機(jī)能可以減少外放后的發(fā)病率。

3.1 納豆芽孢菌劑對放養(yǎng)初期黑天鵝采食和體重的影響及分析 預(yù)飼喂期和試驗初期，兩組間沒有顯著差異，說明試驗動物分配均勻合理，體質(zhì)相當(dāng)。試驗所用黑天鵝處于成長期，通常認(rèn)為動物隨著成長，體重和采食量會逐步增加。對照組的體重和采食量符合這個情況，且試驗?zāi)┢隗w重和采食量呈現(xiàn)顯著增加。試驗組出現(xiàn)了不同情況。試驗組體重隨著成長逐步增加，但是采食量卻逐步減少，試驗?zāi)┢隗w重顯著增加，采食量顯著減少。試驗組并沒有因采食減少而導(dǎo)致生長放緩。說明添加納豆芽孢菌劑后黑天鵝對飼料的吸收和利用度顯著增加。試驗組黑天鵝體重逐步增加，且與對照組沒有顯著差異，但是組內(nèi)個體的整齊度要優(yōu)于對照組。試驗?zāi)┢?，對照組內(nèi)個體體重差異比較明顯，體重更大的個體對于體重較輕的個體具有采食和行動的優(yōu)先權(quán)。體重輕的個體在外放后，爭取不到足夠的食物和空間，而被淘汰。添加納豆芽孢菌劑后，有利于黑天鵝外放后減少甚至避免個體競爭導(dǎo)致的死亡。

3.2 納豆芽孢菌劑對放養(yǎng)初期黑天鵝血液中IL-10和APRIL的影響 細(xì)胞因子是細(xì)胞受病菌、病毒刺激而釋放發(fā)出來的一大類活性物質(zhì)，它能激活并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，對抗微生物入侵。IL-10屬于Th2型細(xì)胞因子，主要能夠抑制和消除炎性反應(yīng)，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。APRIL屬于Th1型細(xì)胞因子，為TNF家族成員，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗病原入侵的作用，在正常組織中低表達(dá)，受到抗原刺激后強(qiáng)表達(dá)。本試驗中試驗期內(nèi)，對照組IL-10沒有顯著變化；APRIL在第6天出現(xiàn)升高，而后下降并穩(wěn)定在試驗初期的水平。這可能是動物在外界受到抗原刺激，但刺激不強(qiáng)且不持續(xù)，所以引起短時間的升高，刺激消失后，逐步下降。試驗組中，IL-10在第6天開始顯著下降，并于第12天后穩(wěn)定不再顯著下降；APRIL在第6天開始顯著上升，于第12天后穩(wěn)定不再顯著上升。這說明飼喂納豆芽孢菌劑后，IL-10分泌被抑制，APRIL分泌則被激活，并于第12天達(dá)到新的穩(wěn)定狀態(tài)。有研究顯示[7]，體外細(xì)胞試驗中，納豆芽孢桿菌能夠起到大腸桿菌、沙門菌同樣的抗原刺激作用，刺激體外細(xì)胞大量分泌APRIL，并抑制IL-10的分泌，但不會像病原菌那樣損傷細(xì)胞。本試驗證明，納豆芽孢桿菌在黑天鵝體內(nèi)也有同樣的作用。APRIL分泌增加，增強(qiáng)機(jī)體對抗病原入侵能力，IL-10分泌受到抑制，能夠增強(qiáng)APRIL的促炎作用，這就使得動物在未接觸病原前就激活免疫系統(tǒng)，減少病原入侵機(jī)體的機(jī)會，這與臨床應(yīng)用的效果相吻合。

4 結(jié)論

通過前期研究[1]和臨床經(jīng)驗，我們認(rèn)為在外放過渡時期，動物處于亞健康狀態(tài)[6]。由于從獸舍內(nèi)過渡到露天環(huán)境，體質(zhì)和免疫力被削弱，但是由于還在圈養(yǎng)條件下，相對完全散養(yǎng)的動物，受到飼養(yǎng)員較好的照顧，未接觸外界過多的病原，不容易被病原感染。動物處于一個弱的免疫平衡狀態(tài)。飼喂納豆芽孢菌劑后不僅消化吸收能力和體質(zhì)得到增強(qiáng)，而且受到納豆芽孢桿菌的刺激，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子APRIL分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子IL-10分泌，主動提高免疫能力，減少病原入侵機(jī)體的機(jī)會，增強(qiáng)放養(yǎng)初期的黑天鵝抗病能力。

[1] 陳斌,劉立賢，張占俠，等.納豆芽孢菌劑消除小天鵝轉(zhuǎn)群應(yīng)激的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,44(25)：122-123.

[2] 孫妍,王加啟,奚曉琦,等.納豆芽孢桿菌在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009,36(7):21-25.

[3] 王星,覃宗華,謝明權(quán),等.納豆芽孢桿菌對黃羽肉雞生產(chǎn)性能和免疫功能的影響[J].中國家禽,2007,29(22):20-23.

[4] 周國勤，杜宣，吳偉．納豆芽孢桿菌對魚類非特異性免疫功能的影響[J]．水利漁業(yè)，2006，26(1)：101-103.

[5] 王世若,王興龍,韓文瑜.現(xiàn)代動物免疫學(xué)[M].長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1996:172-184.

[6] 王萬華,王志永,李勇軍,等.動物園動物的應(yīng)激及其管理[J].野生動物雜志,2009,30(6):318-320.

[7] 尚沁沁，黃琴，徐歆，等。納豆芽孢桿菌B4對Caco-2細(xì)胞活性、黏附與細(xì)胞因子分泌的影響[J]。動物營養(yǎng)學(xué)報，2014，26(1)：279-286.

EffectofBacillusSubtilisNattoonIL-10andAPRILatEarlyStockingstageofBlackSwans

CHEN Bin1, ZHANG Zhan-xia1, KONG Jia-jia2, ZHAO Hong-mei3, LIU Wei-juan1, CHEN Ye1, LIU Li-xian1, LI Yong-jun1, DONG Chao4

(1.Shijiazhuang Zoo,Shijiazhuang 050200,China;2.Wu’an Agriculture and Animal Husbandry Bureau,Handan 056300,China;3.Changli Animal Husbandry Bureau,Qinghuangdao 066600,China;4. Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081,China)

By detecting the levels of IL-10 and APRIL in the serum of Black Swans, the effect of soybean sprout inoculum on the cytokines in the blood of Black Swans at early stage was studied.Black Swans in the early stage of rearing were randomly divided into two groups: control group and experimental group. The control group was normal feeding, and the experimental group added 10% Bacillus Natto inoculum in the basal diet. The changes of body weight and feed intake were recorded, and the contents of IL-10 and APRIL in serum were determined at different time points. The control group of Black Swans, body weight and feed intake were increased, serum IL-10 did not change significantly, and APRIL was increased first and then decreased. In the experimental group Black Swans, weight gain, feed intake, and serum IL-10 were decreased, but APRIL was increased.In the early stage of the Black Swans feeding, the soybean sprouts spore bacteria can enhance the animal's physique, regulate the cytokine, and improve the ability of the animals to resist the invasion of pathogens.

BacillusSubtilisNatto; Black Swans ; Cytokines ; IL-10 ; APRIL

S858

A

0529-6005(2017)10-0042-03

2017-07-10

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(161500182A)

陳斌(1980-)，男，獸醫(yī)師，碩士，從事野生動物疾病預(yù)防與治療工作，E-mail: 49343147@qq.com