林麝源解沒食子酸鏈球菌的分離鑒定及進化分析

姜俊慶 ， 程建國 ， 趙 位 ， 羅 燕 ， 王吳優(yōu) ， 田 青

(1.四川養(yǎng)麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 四川 溫江 611130)

林麝源解沒食子酸鏈球菌的分離鑒定及進化分析

姜俊慶1， 程建國1， 趙 位2， 羅 燕2， 王吳優(yōu)2， 田 青2

(1.四川養(yǎng)麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 四川 溫江 611130)

采用傳統(tǒng)的細菌鑒定方法和分子生物學(xué)方法，對四川省某養(yǎng)麝場2只患化膿性疾病林麝病原菌進行生理生化特征和16S rRNA基因序列測定，以小鼠感染試驗測試分離菌株的致病性，用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，并通過構(gòu)建進化樹對分離菌株進行進化分析。該研究分別從2只林麝機體內(nèi)分離出1株解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種和1株解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種，兩分離菌均能夠引起小鼠肝臟腫大，且對多類抗生素產(chǎn)生耐藥性，進化分析顯示，2分離菌處于不同的分支。本試驗結(jié)果為進一步研究解沒食子酸鏈球菌以及林麝化膿性疾病奠定基礎(chǔ)。

林麝 ； 解沒食子酸鏈球菌 ； 分離鑒定 ； 進化分析

解沒食子酸鏈球菌(Streptococcusgallolyticus)屬于牛鏈球菌。自1990年Osawa[1]首次于樹袋熊的排泄物中分離出該菌并命名以來，在人、家畜、家禽、野生動物以及水生動物機體內(nèi)也分離到該致病菌[2]。該菌屬于D族鏈球菌，其可用作食品發(fā)酵，也可引起動物感染。作為機會感染致病菌，解沒食子酸鏈球菌在臨床上可引起各種感染性疾病，如腹膜炎、尿路感染、菌血癥以及結(jié)腸/直腸癌等[3-6]。在早期研究中解沒食子酸鏈球菌生物學(xué)分類存在很大的爭議。至2003年，Schlegel等[7]將解沒食子酸鏈球菌分為3個亞種，即：解沒食子酸亞種、巴氏亞種和馬其頓亞種。到目前為止，臨床上對解沒食子酸鏈球菌的分離還比較少，而對于不同亞種之間的研究罕見有報道。

本研究分別從2只病死林麝的肝臟和肺臟中分離出了1株疑似解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種和1株疑似解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種。對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)診斷，并對其進行耐藥情況調(diào)查和致病性研究。最后，通過構(gòu)建進化樹，分析2株解沒食子酸鏈球菌不同亞種的進化地位。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 5%犢牛血清的胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic soy agar, TSA)平皿、生化反應(yīng)管以及藥敏紙片，2×TaqPCR Master Mix Kit和細菌基因組DNA提取試劑盒。供藥敏試驗的紙片抗生素的種類包括：鏈霉素、慶大霉素、頭孢匹胺、環(huán)丙沙星、青霉素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、頭孢噻吩、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢他啶、亞胺培南、卡那霉素和林可霉素。

1.2 樣品采集及菌株分離 于四川某養(yǎng)麝場分別采集2只不同病死林麝的肝臟和肺臟，密封于無菌采樣袋，送往實驗室立即進行細菌分離。將肝臟和肺臟劃線接種于TSA平皿，每個樣品3個重復(fù)，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后挑選單菌落劃線純化，最后進行革蘭染色，確定為純培養(yǎng)物后，甘油保存于-70 ℃冰箱，備用。

1.3 生理生化鑒定 將保存的菌種劃線接種于TSA平皿，培養(yǎng)18 h后觀察菌落大小、形態(tài)和顏色，然后采用細菌微量生化反應(yīng)管依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行生理生化鑒定，操作步驟按照細菌微量生化反應(yīng)管的說明書進行。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 將純化的菌種接種于TSA平皿，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，無菌生理鹽水洗下，提取基因組DNA，作為模板，進行PCR擴增。所用引物為：27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'; 1492R:5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'。PCR擴增體系為：2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L 27F引物2 μL，10 mmol/L 1492R引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結(jié)果送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，并在NCBI上進行比對。

1.5 小鼠的致病性試驗 將24只7周齡的BALB/c小鼠平均分成3個組(雌雄各半)，分別命名為A、B、C。同時將菌株劃線接種于TSA平皿，培養(yǎng)18 h后用無菌生理鹽水洗下，制成菌液。然后用平板計數(shù)法測定活菌濃度，將菌液濃度調(diào)整為109CFU/mL。將調(diào)整濃度后的肝臟、肺臟分離菌菌液分別腹腔接種于A, B組小鼠，0.5 mL/只，C組注射等量的生理鹽水作為對照組。飼養(yǎng)14 d，記錄小鼠死亡數(shù)量和死亡時間，并對感染死亡小鼠進行剖檢，觀察并記錄內(nèi)部臟器的病理變化。

1.6 藥敏試驗 采用美國臨床實驗室和標(biāo)準協(xié)會(CLSI)推薦的K-B法進行藥敏試驗，先將分離菌株增菌培養(yǎng)，10倍倍比稀釋后涂布MH瓊脂平板，分別將藥敏紙片貼于平板上。最后，將貼好的藥敏紙片的MH瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，試驗結(jié)果根據(jù)CLSI的標(biāo)準判讀。

1.7 分子進化分析 在NCBI上對分離到的2個菌株的16S rRNA基因序列進行同源性分析，采用Clustalx與從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得的解沒食子酸鏈球菌16S rRNA基因序列進行多序列比對，并用Mega 6.0構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離培養(yǎng) 將病死2只病死林麝的肝臟和肺臟劃線培養(yǎng)18 h后，在TSA培養(yǎng)基上，均形成透明、圓形、光滑的小菌落，革蘭染色可見紫色呈鏈狀排列或單個存在的革蘭陽性球菌。

2.2 菌種的生理生化性質(zhì) 各項生理生化指標(biāo)檢測試驗發(fā)現(xiàn)，肝臟和肺臟分離菌株菌發(fā)酵葡萄糖、乳糖、尿素以及V-P 反應(yīng)均表現(xiàn)為陽性，在棉籽糖、甘露醇、海藻糖發(fā)酵過程中肝臟分離株表現(xiàn)為陽性，而肺臟分離株表現(xiàn)為陰性。同時，在對阿拉伯糖發(fā)酵過程中肝臟分離株表現(xiàn)為陰性，而肺臟分離株表現(xiàn)為陽性。以上結(jié)果中，肝臟分離株符合解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種的生理生化特征，而肺臟分離株符合解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種的生理生化特征。

2.3 分子生物學(xué)鑒定 肝臟、肺臟分離菌株16S rRNA基因擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見大小分別約為1 200 bp和1 400 bp的條帶。將目的條帶膠回收后測序，結(jié)果表明，肝臟和肺臟分離株16S rRNA基因大小分別為1 274 bp和1 453 bp。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為：KU323659和KY693647。并在NCBI上分別對2分離菌株16S rRNA基因序列進行BLAST比對分析。結(jié)果顯示，肝臟分離菌株的16S rRNA基因序列與解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種16S rRNA基因序列相似性達99%，因此確定該分離菌為解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種，命名為FMDD_5。肺臟分離菌株的16S rRNA基因序列與解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種16S rRNA基因序列相似性達99%，因此確定該分離菌為解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種，命名為LPSM。

2.4 菌種對小鼠的致病性 A組和B組感染試驗小鼠精神委靡、食欲不振，剖檢均可見肝臟淤血、腫大，周邊鈍圓等病理變化，生理鹽水組小鼠無任何明顯的病理變化。

2.5 藥敏試驗 在所用的15種藥敏紙片中，分離菌株LPSM對卡那霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥，而分離菌株FMDD_5對青霉素、卡那霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素耐藥。

2.6 分子進化分析 采用鄰近法將8株解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種和11株解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種與2株分離菌株進行建樹，建樹結(jié)果見圖1。肝臟分離株FMDD_5與其他8株解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種同屬一個大的分支，保守性比較高，基因序列相似性高達99.9%。肺臟分離菌株LPSM與其他11株解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種處于不同的分支，其相似性達99.72%。

圖1 21株解沒食子酸鏈球菌進化分析

3 討論

目前，國內(nèi)外對麝類的研究主要集中于野生麝類資源的保護、麝的人工養(yǎng)殖技術(shù)以及麝香的開發(fā)方面[8-9]，關(guān)于麝的化膿性疾病的研究相對較少。而化膿性疾病在麝養(yǎng)殖過程中發(fā)病率比較高，約占麝疾病的70%，嚴重制約麝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10]。加大對麝化膿性疾病的研究，是促進人工養(yǎng)麝的重要途徑。解沒食子酸鏈球菌作為一種人獸共患病病原，已經(jīng)在雞、鴨、鵝、野生亞洲象等動物機體內(nèi)分離到該致病菌[11]。李美霞等[12]對解沒食子酸鏈球菌不同感染途徑雛鴨的病理變化進行比較發(fā)現(xiàn)，不同途徑感染的雛鴨均有較高死亡率，表現(xiàn)出嚴重的心肌炎、腦膜炎等病理變化。解沒食子酸亞種一直被認為是正常菌群，存在于人類腸道[2]。越來越多的研究證實，解沒食子酸亞種是機會性致病菌，在人臨床研究發(fā)現(xiàn)，能引起心內(nèi)膜炎和敗血癥等多種感染，Sillanp等[13]研究證實，鏈球菌引起的人感染性心內(nèi)膜炎約24%的都是由解沒食子酸亞種引起。而在養(yǎng)殖業(yè)中，解沒食子酸亞種能夠引起動物感染乳腺炎、敗血癥等[14]。目前普遍認為馬其頓亞種不具備毒性，是安全的。

本試驗對病死林麝進行剖檢證實，解沒食子酸亞種和馬其頓亞種均能夠引起林麝的化膿性疾病，小鼠致病性試驗中，實驗室分離菌株解沒食子酸亞種FMDD_5和馬其頓亞種LPSM均能夠引起小鼠肝臟的病理變化。耐藥性試驗表明，解沒食子酸亞種和馬其頓亞種對多類抗生素都出現(xiàn)耐藥性，所以在臨床用藥中應(yīng)嚴格把控抗生素的使用。由于與馬其頓亞種具有較高同源性的菌株均表現(xiàn)出致病性，因此將馬其頓亞種應(yīng)用于食品中還應(yīng)該進行嚴格防范。

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Isolation,IdentificationandBioinformaticsAnalysisofStreptococcusgallolyticus

JIANG Jun-qing1， CHENG Jian-guo1， ZHAO Wei2, LUO Yan1， WANG Wu-you2, TIAN Qing2

(1 Sichuan Institute of Musk Deer Breeding, Dujiangyan 611830, China ;2 College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

Pathogens were isolated and identified by conventional method and 16S rRNA sequence analysis from suppurative disease of two forest musk deer in Sichuan. The pathogenicity of the isolates was verified by pathogenicity tests in mice, and antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test (K-B method). In order to establish the phylogenetic relationship of the isolates, the phylogenetic tree of the isolates was constructed. The results showed that oneS.gallolyticussubsp.gallolyticusstrain and oneS.gallolyticussubsp.macedonicusstrain were isolated and identified,and both the isolates caused hepatomegaly in BALB/c mice.Multiple antibiotic resistances were observed in the phenotypic analysis. Furthermore, the phylogenetic analysis of the two isolates showed that they were segregated in different branches.

forest musk deer ;Streptococcusgallolyticus; isolation and identification ; phylogenetic analysis

LUO Yan

Q93-331

A

0529-6005(2017)10-0020-03

2017-04-12

四川省省級科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2017YSZH0008)

姜俊慶(1961-)，男，助理研究員，本科，主要從事經(jīng)濟動物研究，E-mail：419332680@qq.com

羅燕，E-mail：lycjg@163.com