豬源沙門菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析

焦連國 ， 楊貴燕 ， 蘇金輝 ， 朱要宏 ， 趙亞榮 ， 王安如 ， 王九峰

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心 ，北京 海淀 100195 ； 3.飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 北京 海淀 100192)

豬源沙門菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析

焦連國1， 楊貴燕1， 蘇金輝1， 朱要宏1， 趙亞榮2， 王安如3， 王九峰1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心 ，北京 海淀 100195 ； 3.飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 北京 海淀 100192)

沙門菌作為常見的食源性病原菌之一，同時(shí)是引起斷奶仔豬腹瀉的重要病原菌之一，我國每年因沙門菌感染所引起的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。沙門菌感染通常會導(dǎo)致豬副傷寒，主要特征是嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，并且可能會導(dǎo)致腸炎或腹瀉性疾病。本研究通過收集全國范圍內(nèi)仔豬腹瀉樣品，對沙門菌進(jìn)行分離鑒定，了解規(guī)?；i場沙門菌流行情況，同時(shí)對沙門菌抗生素敏感性進(jìn)行分析。從我國16個(gè)省份，84個(gè)豬場，571份樣品中分離得到的128株沙門菌中，發(fā)現(xiàn)最常見的血清型是鼠傷寒沙門菌，其次是德爾卑沙門菌、倫敦沙門菌、嬰兒沙門菌、韋太夫雷登沙門菌和阿貢納沙門菌。這些沙門菌的耐藥情況嚴(yán)重，尤其是復(fù)方新諾明，其耐藥率高達(dá)100%。

沙門菌 ； 分離鑒定 ； 流行率 ； 耐藥性 ； 豬

沙門菌是人和動(dòng)物常見的重要病原菌之一，目前呈全球性的分布。該菌寄居在人和動(dòng)物腸道內(nèi)，是我國常見的細(xì)菌性人獸共患病。沙門菌可分為兩個(gè)種：腸道沙門菌和邦戈沙門菌；腸道沙門菌又可分為6個(gè)亞種：腸道亞種、薩拉姆亞種、雙亞利桑那亞種、亞利桑那亞種、豪頓亞種和英迪加亞種。亞種可以進(jìn)一步分血清型，它是基于體細(xì)胞(O)和鞭毛(H)抗原的存在而彼此分化。

沙門菌病是豬最嚴(yán)重的腸道疾病之一，腸道沙門菌感染在育肥豬和斷奶仔豬的流行率比較高，鼠傷寒沙門菌是最常見的血清型之一[1]。各個(gè)年齡段的豬都可感染腸道沙門菌，但由于仔豬未成熟的腸道功能，并發(fā)其他病原菌以及周圍環(huán)境的改變，比較容易感染沙門菌，尤其是1～4月齡斷奶仔豬。沙門菌病是豬場提高仔豬存活率而重點(diǎn)防范的疫病之一。近幾年，我國規(guī)?；i場發(fā)展迅猛，養(yǎng)殖呈現(xiàn)集約化與規(guī)?；?，這對豬場沙門菌病的防控提出了更高要求，為更好防控我國豬場沙門菌病，迫切需要掌握沙門菌在豬場的流行狀況及藥物的耐藥信息，為此我們進(jìn)行了下面的研究工作。

1 材料與方法

1.1 沙門菌分離及初步鑒定 稱取樣品10 g稀釋于100 mL緩沖蛋白胨水(BPW)培養(yǎng)基中，在搖床中增菌18 h(37 ℃，80 r/min)。吸取300 μL前增菌液分3個(gè)位置滴加于改良MSRV半固體選擇性培養(yǎng)基中，42 ℃± 1℃培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行選擇性增菌。用接種環(huán)從改良MSRV半固體培養(yǎng)基中灰白色區(qū)域周圍挑出一環(huán)，三區(qū)劃線于XLT4培養(yǎng)基，36 ℃± 1 ℃培養(yǎng)18～24 h。XLT4平板上沙門菌菌落中間為黑色，周圍有透明暈環(huán)。

1.2 沙門菌疑似菌落DNA提取 挑取疑似菌落于XLT4瓊脂平板上三區(qū)劃線純化3-4代后，挑取單菌落混勻于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h。采用TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit) 進(jìn)行沙門菌DNA提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 PCR根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)沙門菌的stn基因核苷酸序列為引物，見表1；本研究所使用PCR反應(yīng)體系及循環(huán)設(shè)置見表2、表3。

表1 stn基因引物合成序列

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置

1.4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 配置1%瓊脂凝膠，用微波爐高火加熱煮沸讓瓊脂溶解，取出待其溫度降至55 ℃左右時(shí)，加入核酸染料EB(5 μL/100 mL)，混勻后倒板待其凝固后使用。每孔加入6 μL PCR產(chǎn)物。連接電源后，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳 30 min。使用Alpha Imager 2000紫外凝膠成像儀進(jìn)行顯影。

1.5 生化鑒定 采用法國梅里埃公司的腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒(API-20E) 進(jìn)行沙門菌生化鑒定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 血清型鑒定 本次試驗(yàn)使用的是購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司沙門菌屬診斷血清試劑盒，參考GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—沙門菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)，采用玻片凝集法進(jìn)行鑒定。

1.7 耐藥性分析 采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的肉湯法對得到的沙門菌分離株進(jìn)行耐藥性檢測，共選用18種抗菌藥物，藥物選取原則為文獻(xiàn)中報(bào)道較多，在我國應(yīng)用也較普遍且CLSI所推薦的藥物。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌分離結(jié)果 本次研究針對全國范圍內(nèi)16個(gè)省份84家豬場腸內(nèi)容物、糞便進(jìn)行采集，共采集571份樣品，經(jīng)過分離鑒定，共有66份陽性樣本，分離沙門菌128株，沙門菌分離陽性率為11.56%。

2.2 選擇性培養(yǎng)基鑒定結(jié)果 XLT4培養(yǎng)基可以抑制非沙門菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門菌純菌落的識別。在XLT4瓊脂平板上菌落為中間黑色，周圍為透明暈環(huán)。見圖1。

圖1 沙門菌在XLT4瓊脂平板的生長情況

2.3 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 將疑似沙門菌DNA樣品通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，通過紫外凝膠成像儀顯示結(jié)果。結(jié)果如圖2。

圖2 沙門菌瓊脂凝膠電泳圖

2.4 沙門菌生化鑒定結(jié)果 參照API-20生化試劑條操作說明書和判定標(biāo)準(zhǔn)對沙門菌分離株進(jìn)行生化鑒定。經(jīng)鑒定，128株疑似沙門菌均為沙門菌屬。整體來說生化譜可以分為3種：6 7 0 4 7 5 2、6 7 0 4 5 5 2和7 5 0 4 5 1 2。將所得的生化譜結(jié)果用APIWEB軟件進(jìn)行比對，3種生化譜結(jié)果并不能直接得出對應(yīng)的沙門菌菌種名稱，需配合血清型鑒定。結(jié)果如中插彩版圖3。

2.5 血清型鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)所分離的128株沙門菌經(jīng)血清型鑒定后有6種不同的血清型。數(shù)量最多的為鼠傷寒沙門菌，其次是德爾卑沙門菌、倫敦沙門菌、嬰兒沙門菌、韋太夫雷登沙門菌和阿貢納沙門菌。鼠傷寒沙門菌廣泛分布于各個(gè)省份，并且本次分離的鼠傷寒沙門菌有兩種血清型：1,4,[5],12∶i∶1,2和1,4,[5],12∶i∶-，而且鼠傷寒1,4,[5],12∶i∶-占絕大多數(shù)。結(jié)果如表4、表5。

表4 各省份沙門菌血清型鑒定結(jié)果

表5 沙門菌各血清型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.6 耐藥性分析結(jié)果 本試驗(yàn)中所用質(zhì)量控制菌株-大腸桿菌ATCC 25922對所選18種藥物的最小抑菌濃度均處于質(zhì)量控制允許范圍之內(nèi)，結(jié)果真實(shí)可信。沙門菌的耐藥性結(jié)果具體見表6。總體來說，沙門菌的耐藥情況還是比較嚴(yán)重的，尤其是復(fù)方新諾明，其耐藥率高達(dá)100%。另外，氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和氟苯尼考的耐藥率也都在60%以上。幸運(yùn)的是，沙門菌分離株對阿米卡星都是敏感的。

表6 沙門菌耐藥性檢測結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)共采集到全國16個(gè)省份，84家養(yǎng)殖場的571份樣本，其中陽性樣本66份，陽性率為11.56%，主要分布在河北、山東、湖南、湖北等省份。豬源沙門菌的流行率與其他研究結(jié)果相一致，山東省2009年豬源沙門菌分離率是10%[2]，歐盟豬源沙門菌分離率是6.3%[3]，美國豬源沙門菌分離率為10.34%[4]。但是本試驗(yàn)的豬源沙門菌分離率明顯低于四川省的16.4%分離率[5]。這表明區(qū)域不同、樣本類型、采集季節(jié)、培養(yǎng)方式、分離方式以及環(huán)境條件都有可能影響到分離率。所以我國建立一個(gè)規(guī)范的沙門菌長期監(jiān)測體系是非常必要的。本試驗(yàn)分離得到的128株沙門菌來自10個(gè)省份，分為6種血清型，數(shù)量最多的為鼠傷寒沙門菌，其次是德爾卑沙門菌、倫敦沙門菌、嬰兒沙門菌、韋太夫雷登沙門菌和阿貢納沙門菌。鼠傷寒沙門菌廣泛分布于我國豬場，而且鼠傷寒1,4,[5],12∶i∶-占絕大多數(shù)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的全球食源性感染網(wǎng)絡(luò)提供的數(shù)據(jù)表明，我國最常見的血清型是德爾卑沙門菌，而美國和日本流行率最高的血清型則分別是鼠傷寒沙門菌和嬰兒沙門菌。本試驗(yàn)的血清型結(jié)果與其他研究結(jié)果還是比較一致的。所有沙門菌分離株進(jìn)行18種抗生素耐藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，分離株對復(fù)方新諾明高度耐藥，耐藥率達(dá)到100%，而對阿米卡星卻是敏感的。另外，沙門菌對氨芐西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氯霉素以及氟苯尼考的耐藥率都比較高。這個(gè)結(jié)果與我國其他地方的研究結(jié)果相一致[2,5-7]。耐藥結(jié)果與地域結(jié)合在一起分析，可以得出遼寧、吉林等地的抗生素耐藥比較樂觀，但山東、河南、湖南等省份，耐藥形勢比較嚴(yán)峻。造成各地區(qū)耐藥情況不一致的原因可能是各省份在使用抗生素方面有區(qū)別。另外，山東、河南、湖北、湖南等地作為我國生豬養(yǎng)殖大省，在疾病治療與預(yù)防方面更多的使用抗生素也是造成抗生素耐藥的重要因素。

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PrevalenceandantimicrobialsusceptibilityofSalmonellaisolatesfrompigsinChina

JIAO Lian-guo1, YANG Gui-yan1, SU Jin-hui1,ZHU Yao-hong1, ZHAO Ya-rong2, WANG An-ru3, WANG Jiu-feng1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China;2.Animal Medicine Research Center of DaBeiNong Group, Beijing 100195, China;3.State Key Laboratory of Direct-Fed Microbial Engineering, Beijing 100192, China)

Salmonellaas one of the common foodborne pathogens is also one of the pathogens in causing diarrhea in weaned piglets. China is a great country in pig industry, and the economic loss due to salmonellosis in pigs is severe. The symptoms ofSalmonellainfection in pigs are usually typhoid, characterized by severe systemic disease, and intestinal inflammation and diarrheal disease. This study collected samples from pigs with diarrhea in different farms of China to investigate the prevalence and drug resistance ofSalmonella. From the 128Salmonellastrains isolated from 571 samples from 84 farms in 16 provinces of China, we found that the most prevalent serotype wasS. Typhimurium, thenS. Derby,S. London,S. Infantis,S. Weltevreden andS. Agona. The antibiotics resistance ofSalmonellaisolates was severe, and all of the isolates were resistant to trimethoprim/sulfamethoxazole.

Salmonella; isolation and identification ; prevalence ; antimicrobial susceptibility ; pig

WANG Jiu-feng

S852.61

A

0529-6005(2017)10-0017-04

2017-05-10

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0502200)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403054)；國家自然科學(xué)基金(21026089)

焦連國(1978-)，男，博士生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，E-mail：26682488@qq.com

王九峰，E-mail：jiufeng_wang@hotmail.com