吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查及分類鑒定

田萬年 ， 薛書江 ， 賈立軍 ， 張守發(fā)， 李國(guó)江

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002)

吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查及分類鑒定

田萬年1,2， 薛書江3， 賈立軍3， 張守發(fā)3， 李國(guó)江1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002)

為了解吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲病的流行情況，試驗(yàn)采用PCR方法對(duì)采自吉林省部分地區(qū)羊血液樣本235份進(jìn)行羊泰勒蟲檢測(cè)，并對(duì)部分陽性樣本進(jìn)行測(cè)序分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，羊泰勒蟲陽性率為28.08%，為呂氏泰勒蟲單獨(dú)感染，沒有檢測(cè)到尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲感染。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，吉林省呂氏泰勒蟲與青海分離株分布于同一分支，親緣關(guān)系最近，與綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此次調(diào)查為吉林省羊泰勒蟲病的綜合防治提供了理論依據(jù)。

羊泰勒蟲病 ； 流行病學(xué)調(diào)查 ； 聚合酶鏈反應(yīng) ； 18S rRNA ； 系統(tǒng)發(fā)育樹

羊泰勒蟲病是由羊泰勒蟲引起的綿羊和山羊的一種經(jīng)蜱傳染性血液原蟲病[1]。本病呈地方性流行，主要以高熱、貧血和消瘦為主要臨床癥狀，可引起外地引進(jìn)羊大量死亡，慢性發(fā)病的羊產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展[2]。近年來，我國(guó)已報(bào)道的羊泰勒蟲有3個(gè)種，即呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲[3-5]。自然感染病例多為尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲的混合感染，也有少數(shù)病例單一蟲種感染，綿羊泰勒蟲僅在新疆有報(bào)道[6-7]。

目前，血液涂片檢查在流行病學(xué)中大量應(yīng)用，我國(guó)對(duì)羊泰勒蟲的診斷主要以血液涂片為主。吉林省是全國(guó)重要的養(yǎng)羊基地，而吉林省的養(yǎng)羊基地主要集中在白城、松原及四平市所轄的雙遼市。羊產(chǎn)業(yè)是吉林省畜牧產(chǎn)業(yè)中的支柱性產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)羊業(yè)已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)增效的重要支撐。目前，對(duì)吉林省羊泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查較少，也無優(yōu)勢(shì)蟲株及分類研究的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR方法結(jié)合血液涂片檢查，對(duì)采自吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲進(jìn)行檢查，為該地區(qū)羊泰勒蟲病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本的采集 血液樣本共235份分別采自吉林省琿春市90份(2016年5月)，白城市45份(2015年4月)，松原市40份(2015年5月)和雙遼市60份(2016年4月)綿羊或山羊抗凝血，同時(shí)制作了血液涂片，供姬姆薩染色鏡檢。血液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 基因組DNA的提取 將采集的羊抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA用60 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 羊泰勒蟲的PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank上登錄的羊泰勒蟲18S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)種屬特異性引物，引物序列見表1。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠純化PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司序列測(cè)定。

表1 羊泰勒蟲病PCR檢測(cè)引物

1.5 序列比對(duì)與進(jìn)化分析 將測(cè)定的梨形蟲18S rRNA基因序列、以及GenBank上登錄的泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列，建立牛羊梨形蟲的系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列依次為瑟氏泰勒蟲(AF081137、AY661515、JF719834、AB016074)、環(huán)形泰勒蟲(AY524666、FJ426369、EU073963、EU083801)、綿羊泰勒蟲(FJ603460)、萊氏泰勒蟲(AF081135)、呂氏泰勒蟲(AY262117、JF719832)、尤氏泰勒蟲(AY262116、JF719835)以及牛巴貝斯蟲(HQ264111、AY603398)、牛卵形巴貝斯蟲(LC125457、AY081192、AY603400、AY603400)、牛雙芽巴貝斯蟲(KM046917)、羊巴貝斯蟲(AY998123)。

2 結(jié)果

2.1 血液樣本PCR檢測(cè) 通過對(duì)235份羊血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，呂氏泰勒蟲特異性引物擴(kuò)增特異條帶，而尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲特異引物未擴(kuò)增出條帶(結(jié)果見圖1)，羊泰勒蟲PCR檢測(cè)陽性率為28.08%(66/235)。血液涂片染色鏡檢陽性率為12.76%(30/235)。

圖1 呂氏泰勒蟲特異引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果

呂氏泰勒蟲特異引物擴(kuò)增的M：DL-2000 DNA Marker ； 1～5： 部分羊樣本PCR 產(chǎn)物 ； 6：空白對(duì)照

圖2 尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲特異引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果

2.2 不同地區(qū)羊群感染羊泰勒蟲病情況 采用PCR方法對(duì)分別采自琿春、白城、松原和雙遼4個(gè)地區(qū)的235份血液樣本進(jìn)行羊泰勒蟲感染情況的比較，其結(jié)果見表1。

表1 不同地區(qū)羊感染羊泰勒蟲的情況

*：平均感染率，下表同

從表1可見，不同地區(qū)羊均可感染羊泰勒蟲病。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，琿春地區(qū)感染率顯著高于其他3個(gè)地區(qū)，差異極顯著(Plt;0.01)。

2.3 不同品種羊群感染羊泰勒蟲病情況 將PCR檢測(cè)的235份羊血液樣本的檢測(cè)結(jié)果，按不同品種分組進(jìn)行比較，其結(jié)果見表2。

表2 不同品種羊群感染羊泰勒蟲病情況

從表2可見，綿羊和山羊均可感染羊泰勒蟲病。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同品種間羊泰勒蟲感染率差異不顯著(Pgt;0.05)。

2.4 不同飼養(yǎng)方式羊群感染羊泰勒蟲病情況 將PCR檢測(cè)的235份羊血液樣本的檢測(cè)結(jié)果，按不同飼養(yǎng)方式分組進(jìn)行比較，其結(jié)果見表3。

表3 不同飼養(yǎng)方式羊感染羊泰勒蟲的情況

從表3可見，不同飼養(yǎng)方式的羊均感染羊泰勒蟲病。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同飼養(yǎng)方式羊泰勒蟲感染率差異顯著(Plt;0.05)。

2.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 為了進(jìn)一步分析吉林省羊群感染羊泰勒蟲優(yōu)勢(shì)蟲種及遺傳進(jìn)化關(guān)系，將本試驗(yàn)測(cè)得的羊泰勒蟲18S rRNA基因序列與GenBank登錄的巴貝斯蟲和泰勒蟲序列進(jìn)行對(duì)比分析，應(yīng)用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖4)。結(jié)果顯示，本次流行病學(xué)調(diào)查檢測(cè)到的泰勒蟲位于呂氏泰勒蟲分支上，T.luwenshuniJilin分離株與T.luwenshuni青海分離株處在同一分支，與國(guó)內(nèi)流行的尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，吉林省羊群流行羊泰勒蟲優(yōu)勢(shì)蟲株為呂氏泰勒蟲。

3 討論

羊泰勒蟲病是一類經(jīng)蜱傳播的血液原蟲病，本病呈世界性流行，我國(guó)羊泰勒蟲病流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，國(guó)內(nèi)有多個(gè)省份報(bào)道該病的流行及優(yōu)勢(shì)蟲株[8-11]。目前，羊產(chǎn)業(yè)是吉林省畜牧產(chǎn)業(yè)中的支柱性產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)增效的重要支撐。為了解吉林省羊群羊泰勒蟲病的感染情況，本試驗(yàn)應(yīng)用血液涂片和PCR技術(shù)對(duì)該地區(qū)羊泰勒蟲的感染率及優(yōu)勢(shì)蟲種類進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，血液涂片鏡檢陽性率為12.76%，PCR檢測(cè)陽性率為28.08%，高于血液涂片鏡檢，感染的優(yōu)勢(shì)蟲種為呂氏泰勒蟲，沒有檢測(cè)到尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，羊泰勒蟲呈單一病原感染，未出現(xiàn)呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲混合感染，這一結(jié)果與孟林明等[12]報(bào)道的呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲多呈混合感染存在差異，可能由于所處地理位置不同及傳播該病的媒介蜱有關(guān)。對(duì)PCR檢測(cè)的235份血液樣本進(jìn)行了不同地區(qū)、不同品種及不同飼養(yǎng)方式的比較分析。結(jié)果顯示，不同地區(qū)及不同飼養(yǎng)方式差異顯著，吉林省琿春地區(qū)感染率為45.56%，明顯高于其他地區(qū)(Plt;0.05)，存在較大差異，可能與地理生態(tài)環(huán)境和跨境交易運(yùn)輸頻率等導(dǎo)致感染率存在差異。放牧羊的感染率為34.53%，顯著高于舍飼18.75%(Plt;0.05)，分析原因可能為放牧羊與蜱的接觸幾率比舍飼羊高一些。

圖3 基于泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

本試驗(yàn)對(duì)吉林省流行羊泰勒蟲陽新樣本的18S rRNA基因序列進(jìn)行了克隆和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，本次檢測(cè)到羊泰勒蟲位于呂氏泰勒蟲分支上，無陽性樣本位于尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲分支，表明吉林流行的羊泰勒蟲為呂氏泰勒蟲，豐富了羊泰勒蟲流行病學(xué)資料，進(jìn)一步證實(shí)了殷宏等[13]認(rèn)為國(guó)內(nèi)羊泰勒蟲存在新種的觀點(diǎn)。遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，本次檢測(cè)的呂氏泰勒蟲和青海分離株處于同一分支，而區(qū)別于甘肅和湖北分離株，這一結(jié)果與楊菊鳳等[10]報(bào)道的我國(guó)羊泰勒蟲存在地區(qū)差異性結(jié)果相一致。本次調(diào)查明確了吉林省羊泰勒蟲的優(yōu)勢(shì)蟲株和流行情況，但尚未對(duì)該地區(qū)蜱的種類進(jìn)行調(diào)查，下一步加大檢測(cè)樣本數(shù)量，確定蜱的種類，為吉林省羊泰勒蟲病的防控提供詳實(shí)數(shù)據(jù)。

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EpidemiologicalsurveyandidentificationoftheileriosisingoatsandsheepinJilinProvince

TIAN Wan-nian1,2, XUE Shu-Jiang3, JIA Li-jun3, ZHANG Shou-fa3， LI Guo-jiang1,2

(1.College of Animal Science, Jilin Agricultural Scienceand Technology College, Jilin 132101, China； 2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin 132101, China； 3.College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

In order to study the prevalence of theileria parasites in ovine infections in sheep. A total of 235 peripheral blood samples of sheep were collected from Jilin and detected by microscopic examination and PCR. The 18S rRNA gene was cloned from part of positive samples and used for phylogenetical analysis. As a result, Theileriosis in goats and sheep was positive in 28.08% of the samples. Phylogenetic tree analysis confirmedTheileriaspp. was most closely related toTheilerialuwenshuniQinghai strains, but more distantly related toTheileriauilenbergiandTheileriaovis. The results provide important information for prevention and control of Piroplasma of Cattle and Sheep in the region.

ovine and caprine theileriosis ； epidemiological investigation ； PCR ； 18S rRNA ； phylogenetic tree

s：ZHANG Shou-fa ； LI Guo-jiang

S852.72

A

0529-6005(2017)10-0013-04

2016-11-10

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150623004TC)；吉林省重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2015]第x030號(hào))；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2014]第Z07號(hào))

田萬年(1980-)，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究，E-mail:wannian2000@hotmail.com

張守發(fā)，E-mail:shoufazhang@sina.com；李國(guó)江，E-mail:illiguojiang@126.com