電針百會(huì)、大椎、腎俞穴對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的影響

李斐斐，楊珺，楊文丹，駱雍陽(yáng)，陳慧娥，宋長(zhǎng)明，董衛(wèi)國(guó)

電針百會(huì)、大椎、腎俞穴對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的影響

李斐斐1，楊珺2，楊文丹1，駱雍陽(yáng)1，陳慧娥1，宋長(zhǎng)明3，董衛(wèi)國(guó)4

目的 觀察電針百會(huì)、大椎、腎俞穴對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的影響，探討電針治療阿爾茨海默病(AD)的機(jī)制。方法 7月齡SAMP8小鼠24只隨機(jī)分為模型組和電針組，同齡正常老化SAMR1小鼠12只為對(duì)照組。電針組電針百會(huì)、大椎、腎俞穴30 d。Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組織化學(xué)觀察小鼠海馬CA1區(qū)突觸素(SYN)及突觸后致密區(qū)蛋白95(PSD95)的表達(dá)，透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 與模型組相比，電針組逃避潛伏期縮短(p＜0.05)，原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(p＜0.05)，穿越原平臺(tái)次數(shù)增加(p＜0.05)，海馬CA1區(qū)SYN與PSD95表達(dá)顯著提高(p＜0.001)，突觸結(jié)構(gòu)較完整，數(shù)量增加。結(jié)論 電針能提高小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達(dá)，改善突觸的超微結(jié)構(gòu)，從而有效改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

阿爾茨海默病；電針；學(xué)習(xí)記憶；突觸素；突觸后致密區(qū)蛋白95；小鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又稱為老年性癡呆，是一種與年齡相關(guān)、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD的主要病理特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[2]。突觸障礙，包括突觸功能障礙和突觸丟失，是AD早期病理特征[3-4]。AD患者腦組織突觸數(shù)量減少，突觸密度下降，突觸蛋白表達(dá)水平降低，包括突觸前膜蛋白突觸素(synaptophysin,SYN)及突觸后致密區(qū)蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)表達(dá)明顯下降[5]。

我們前期研究表明，益腎調(diào)督法電針能改善快速老化模型小鼠亞系(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6-7]。本研究觀察電針對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬CA1區(qū)SYN及PSD95的表達(dá)、突觸結(jié)構(gòu)的影響，為電針?lè)乐蜛D提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7月齡SAMP8小鼠24只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，由北京維華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)SCXK(京)2014-0004。7月齡抗快速老化小鼠亞系(senescence-accelerated resistant mouse 1,SAMR1)小鼠12只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)SCXK(京)2011-0012。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)學(xué)第23-016號(hào))適應(yīng)性喂養(yǎng)1個(gè)月，溫度(22±2)℃，濕度(55±15)%，12 h明暗交替，自由進(jìn)食與飲水。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按國(guó)際動(dòng)物保護(hù)及使用指南進(jìn)行。

1.2 主要儀器及試劑

華佗牌無(wú)菌針灸針(直徑0.25 mm，長(zhǎng)15 mm)、華佗牌SDZ-Ⅱ電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。Morris水迷宮系統(tǒng)：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。H-7650型透射電鏡：日本HITACHI公司。電鏡CCD相機(jī)-圖像采集分析系統(tǒng)：德國(guó)Soft-Imaging-System公司。

兔SYN單克隆抗體、兔PSD95單克隆抗體：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG超敏試劑盒與DAB試劑盒：福州邁新生物工程有限公司。Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將7月齡SAMP8小鼠分為模型組和電針組，每組12只；SAMR1小鼠作為對(duì)照組。

電針組采用電針治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]取百會(huì)、大椎、雙側(cè)腎俞，百會(huì)向前斜刺2 mm，大椎向下斜刺2～3 mm，腎俞稍向內(nèi)斜刺3～4 mm。大椎、腎俞加電針，腎俞雙側(cè)交替進(jìn)行。自制網(wǎng)兜固定小鼠，進(jìn)針后，不進(jìn)行手法刺激，連接電針儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，電壓2 V，留針20 min[6]。每天1次，8 d為1個(gè)療程。療程間隔2 d進(jìn)行下一個(gè)療程，共3個(gè)療程，30 d。

模型組與對(duì)照組不進(jìn)行電針治療，只進(jìn)行相同方式、相同時(shí)間和相同程度的抓取和固定。

1.4 Morris水迷宮

Morris水迷宮為直徑120 cm、高60 cm、水深15 cm圓形水池；控制水溫為(25±2)℃；圓形平臺(tái)直徑8 cm，置于第3象限，沒(méi)于水下1 cm；圓形水池側(cè)面均表面光滑。

電針治療結(jié)束后開始定位航行實(shí)驗(yàn)。每天上、下午各訓(xùn)練小鼠4次，將小鼠分別從4個(gè)入水點(diǎn)(各象限池壁中點(diǎn))面向池壁放入水中，記錄小鼠爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期；如90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，記錄逃避潛伏期為90 s。連續(xù)訓(xùn)練5 d。

第6天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。小鼠從第1象限池壁中點(diǎn)放入池中，自由游泳90 s后。記錄小鼠在原平臺(tái)區(qū)域停留的時(shí)間與跨越平臺(tái)次數(shù)。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法

水迷宮測(cè)試結(jié)束后，各組取6只小鼠，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開右心耳?？焖僮⑷?7℃生理鹽水80 ml沖洗，后注入4%多聚甲醛80 ml灌流固定。

取全腦修塊后迅速放入4%多聚甲醛內(nèi)，4℃固定24～48 h。常規(guī)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。自上丘至視交叉節(jié)段作連續(xù)冠狀切片，厚4 μm。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，將黏附腦組織的載玻片置于0.01 mol/L檸檬酸修復(fù)液(pH=7.4)中，微波爐法修復(fù)7 min，降至室溫。分別加入SYN抗體(1∶700)、PSD95抗體(1∶200)，4℃濕盒孵育過(guò)夜。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG的二抗，DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)海馬CA1區(qū)SYN及PSD95的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算SYN及PSD95的平均光密度(mean optical density,MOD)。

1.6 透射電鏡觀察

另6只小鼠同法取腦組織，置于2.5%戊二醛固定液中，分離出海馬，切取左右側(cè)海馬CA1區(qū)約1 mm3各3～4塊，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d，1%四氧化餓后固定2 h，梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋，37℃、45℃、60℃分別聚合，常規(guī)半薄切片，美蘭-天青染色，光鏡輔助觀察并定位。常規(guī)超薄切片，銅網(wǎng)撈片，切片2%醋酸鈾水溶液染色20 min，檸檬酸鉛染色15 min。透射電鏡先在低倍下定位和觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞，再在高倍下觀察突觸形態(tài)。電鏡CCD相機(jī)進(jìn)行圖像采集。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用(xˉ±s)表示，均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

定位航行實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組逃避潛伏期明顯短于模型組(p＜0.01)；與模型組比較，電針組逃避潛伏期縮短(p＜0.05)。見(jiàn)表1。

空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短(p＜0.01)，跨越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(p＜0.01)。與模型組相比，電針組原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(p＜0.05)，跨越平臺(tái)的次數(shù)增多(p＜0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

光鏡下小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元SYN主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)。對(duì)照組SYN陽(yáng)性表達(dá)最明顯，平均光密度值顯著高于模型組(p＜0.001)。與模型組相比，電針組平均光密度顯著增高(p＜0.001)。

PSD95主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜。對(duì)照組PSD95平均光密度顯著高于模型組(p＜0.001)，電針組平均光密度顯著高于模型組(p＜0.001)。見(jiàn)表3、圖2、圖3。

2.3 透射電鏡

對(duì)照組突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸前、后膜分界清晰，突觸小泡密集。模型組可見(jiàn)突觸間隙增大或消失，前后膜不清晰，突觸小泡減少，突觸后致密物質(zhì)變薄。與模型組相比，電針組突觸結(jié)構(gòu)較完整，突觸前、后膜分界較清晰，突觸小泡較多。見(jiàn)圖4。

表1 各組定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較(s)

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)原平臺(tái)停留的時(shí)間及跨越平臺(tái)次數(shù)比較

表3 各組小鼠海馬CA1區(qū)SYN與PSD95比較(MOD)

圖1 空間探索實(shí)驗(yàn)各組小鼠游泳軌跡

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)SYN的表達(dá)(免疫組化染色，bar=50 μm)

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)PSD95的表達(dá)(免疫組化染色，bar=50 μm)

圖4 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，50,000×)

3 討論

AD在中醫(yī)學(xué)中屬于“癡呆”“健忘”“呆病”“癲狂”“郁證”“虛勞”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為引起本病的根本原因是肝腎虧虛、氣血不足、經(jīng)脈失養(yǎng)髓海不充。人至老年，腎衰髓虛，髓減則腦消，神機(jī)失用而成癡呆。羅磊等[9]發(fā)現(xiàn)，益腎調(diào)督針灸法可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體分裂與融合蛋白的失衡，改善線粒體動(dòng)力學(xué)異常，從而改善線粒體損傷，保護(hù)線粒體功能。何勛等[10]研究表明，益腎調(diào)督針灸法能夠通過(guò)改善AD發(fā)病過(guò)程中線粒體動(dòng)力學(xué)異常，達(dá)到防治AD的目的。崔翔等[11]發(fā)現(xiàn)，益腎調(diào)督針灸法可以有效抑制海馬線粒體Cyp D表達(dá)，從而阻滯線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的形成，減少線粒體損傷。陳陽(yáng)陽(yáng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，益腎調(diào)督針加灸法可能通過(guò)減少或抑制AD大鼠血清內(nèi)Aβ水平，降低大鼠海馬CA1區(qū)淀粉樣前體蛋白的表達(dá)，延緩AD的病理進(jìn)程。

根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]和我們前期研究[7,13]，本實(shí)驗(yàn)中我們以益腎調(diào)督為電針治療的基本原則，選擇大椎、百會(huì)、腎俞為治療腧穴。百會(huì)和大椎屬督脈穴，兩穴結(jié)合可使諸經(jīng)通調(diào)，促進(jìn)經(jīng)氣運(yùn)行，增強(qiáng)聯(lián)絡(luò)各臟腑經(jīng)絡(luò)的功效，濡養(yǎng)腦髓氣血，促進(jìn)陰陽(yáng)平衡。腎俞為腎的背俞穴，腎中精氣匯集于此；腎經(jīng)與督脈相連，入髓連絡(luò)腦海。三穴相配共奏益腎調(diào)督的作用。

SAMP8小鼠由日本京都大學(xué)竹田俊男培育成功[14]，主要特征是學(xué)習(xí)記憶功能隨增齡進(jìn)行性快速衰退[15]，與AD臨床表現(xiàn)非常相似。另外，SAMP8小鼠具有多種與人類AD相類似的病理改變[16]，被公認(rèn)為較理想的AD模型[17]，已廣泛應(yīng)用于AD的研究。SAMR1具有與SAMP8相似的遺傳背景，但沒(méi)有表現(xiàn)衰老相關(guān)的神經(jīng)顯型，被廣泛用于AD模型的對(duì)照。

Morris水迷宮是目前最常用的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力的裝置[18]。Li等[19]對(duì)SAMP8小鼠進(jìn)行水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)電針組平均逃避潛伏期明顯縮短。李向宇等[20]對(duì)APP/PS1小鼠進(jìn)行水迷宮測(cè)試，結(jié)果顯示電針組平均逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)增加。與本研究結(jié)果一致，提示電針治療可以有效提高SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

突觸是神經(jīng)元傳遞信息的主要結(jié)構(gòu)，是學(xué)習(xí)與記憶形成的重要形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)[21]。SYN是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白，位于突觸囊泡膜上，是突觸前膜特異性標(biāo)記物，可反映突觸的分布、數(shù)量和密度，與突觸的可塑性密切相關(guān)[22]。PSD95是突觸后膜上最重要、最豐富的腳手架蛋白，在突觸結(jié)構(gòu)、功能和可塑性方面發(fā)揮重要作用[23]。SYN與PSD95作為突觸的特異性標(biāo)志蛋白，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用，也是治療干預(yù)的重要靶點(diǎn)。AD患者及AD模型動(dòng)物海馬SYN與PSD95表達(dá)均減少[5,24]。海馬結(jié)構(gòu)中CA1區(qū)是學(xué)習(xí)記憶、信息處理和信息傳遞的重要部位[25]。

張亢亢等[26]研究表明，電針治療能有效提高AD大鼠海馬神經(jīng)元SYN和PSD-95蛋白的表達(dá)。余曙光等[27]研究發(fā)現(xiàn)，電針組大鼠海馬CA1區(qū)突觸密度增大，突觸面平均面積減小，提示電針治療可在一定程度上修復(fù)AD模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，抑制海馬神經(jīng)元突觸退變，從而發(fā)揮治療AD的作用。王威等[28]研究表明，電針治療明顯增加突觸面積與體積密度，突觸素表達(dá)水平提高。宋長(zhǎng)明等[29]研究表明，電針增加CA1區(qū)神經(jīng)元的突觸數(shù)量，改善突觸超微結(jié)構(gòu)。

本研究顯示，電針既能增強(qiáng)海馬CA1區(qū)SYN和PSD95蛋白表達(dá)，又有利于保持突觸結(jié)構(gòu)的完整，增加突觸小泡。提示電針既能改善SAMP8小鼠突觸結(jié)構(gòu)又能提高突觸功能。

綜上所述，本研究顯示，電針百會(huì)、大椎、腎俞穴能有效改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達(dá)，改善突觸的超微結(jié)構(gòu)?？赡芘c電針改善海馬突觸的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。下一步我們將進(jìn)一步研究電針改善AD突觸功能的分子機(jī)制，為AD的治療提供靶點(diǎn)。

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Effects of Electroacupuncture at Baihui,Dazhui and Shenshu Acupoints on Ability of Learning and Memory and Synapses of Neurons in Hippocampal CA1 in SAMP8 Mice

LI Fei-fei1,YANG Jun2,YANG Wen-dan1,LUO Yong-yang1,CHEN Hui-e1,SONG Chang-ming3,DONG Wei-guo4
1.College of Acupuncture and Moxibustion,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2.Lanzhou Hospital of Gansu Provincial Prison Administration,Lanzhou,Gansu 730000,China;3.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;4.College of Integrated Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China

DONG Wei-guo.E-mail:fjdwg601@163.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture(EA)at Baihui(GV20),Dazhui(GV14)and Shenshu(BL23)acupoints on cognitive function and the synapse of neurons in hippocampal CA1 in SAMP8 mice,to explore the mechanism of EA in the treatment of Alzheimer's disease(AD).Methods A total of 24 seven-month-old SAMP8 mice were randomly divided into model group(n=12)and EA group(n=12),and the same age SAMR1 mice were as control group(n=12).The EA group accepted EA at Baihui,Dazhui and Shenshu for 30 days.They were assessed with Morris maze test.The expression of synaptophysin(SYN)and postsynaptic density protein 95(PSD95)in hippocampal CA1 region were detected with immunohistochemistry.The morphology and density of synapse in hippocampal CA1 region was observed with transmission electron microscopy.Results Compared with the model group,the latency of Morris maze decreased in EA group(p＜0.05),the time staying in the quadrant of the platform increased(p＜0.05),as well as the number passing the original platform(p＜0.05),with the more expression of SYN and PSD95 in hippocampal CA1 region(p＜0.001),and more and completed synapse.Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice by increasing the expression of SYN and PSD95 to protect the ultrastructure of synapses in hippocampal CA1 region.

Alzheimer's disease;electroacupuncture;learning and memory;synaptophysin;postsynaptic density protein 95;mice

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.008

R749.1

A

1006-9771(2017)11-1278-06

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81102625)；2.福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2017J01541)；3.福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.2017FJZYJC102)；4.2015年度福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州市350122；2.甘肅省監(jiān)獄管理局蘭州醫(yī)院，甘肅蘭州市730000；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)學(xué)院，福建福州市350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州市350122。作者簡(jiǎn)介：李斐斐(1990-)，女，漢族，福建龍巖市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸防治老年性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者：董衛(wèi)國(guó)(1977-)，男，漢族，湖北紅安縣人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：針灸防治老年性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:fjdwg601@163.com。

[本文著錄格式] 李斐斐，楊珺，楊文丹，等.電針百會(huì)、大椎、腎俞穴對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(11):1278-1283.

CITED AS:Li FF,Yang J,Yang WD,et al.Effects of electroacupuncture at Baihui,Dazhui and Shenshu acupoints on ability of learning and memory and synapses of neurons in hippocampal CA1 in SAMP8 mice[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1278-1283.

2017-06-16

2017-08-01)