游離細(xì)胞催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的菌株改造策略

于慧敏，焦松，沈忠耀

清華大學(xué)化學(xué)工程系，教育部工業(yè)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，北京 100084

游離細(xì)胞催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的菌株改造策略

于慧敏，焦松，沈忠耀

清華大學(xué)化學(xué)工程系，教育部工業(yè)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，北京 100084

丙烯酰胺是一種重要的酰胺類化合物，其聚合產(chǎn)物——聚丙烯酰胺被廣泛應(yīng)用于三次采油、水處理、造紙、冶金等領(lǐng)域。以腈水合酶為核心的生物催化法，尤其是游離細(xì)胞催化法，具有轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物純度高以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是目前丙烯酰胺生產(chǎn)的主要方法；而腈水合酶及其生產(chǎn)菌株的性能在丙烯酰胺生產(chǎn)工藝中起著至關(guān)重要的作用。分別從細(xì)胞層次和酶層次對(duì)常用的生產(chǎn)菌株性能改造策略進(jìn)行了簡(jiǎn)介，并重點(diǎn)闡述了目前用于腈水合酶生產(chǎn)菌株改造的基因重組策略。最后介紹了腈水合酶和產(chǎn)酶細(xì)胞的協(xié)同改造策略及改造效果。其中，通過(guò)對(duì)產(chǎn)腈水合酶紅球菌R. ruber TH在酶和細(xì)胞層面的協(xié)同改造，重組游離細(xì)胞TH8實(shí)現(xiàn)了工業(yè)規(guī)模約500g/L高濃丙烯酰胺的三批次水合制備。

丙烯酰胺；腈水合酶；游離細(xì)胞催化；細(xì)胞和胞內(nèi)酶的協(xié)同改造

于慧敏，博士，教授。2001年獲清華大學(xué)化工系生物化工專業(yè)工學(xué)博士學(xué)位；2005～2006年在美國(guó)麻省理工學(xué)院化工系做訪問(wèn)學(xué)者，2012年任職教授。主要從事工業(yè)生物催化及生物納米技術(shù)研究，致力于發(fā)展生物催化劑構(gòu)建技術(shù)與理論、強(qiáng)化生物過(guò)程、構(gòu)筑能夠在工業(yè)環(huán)境中高效穩(wěn)定發(fā)揮作用的生物催化劑和生物催化新工藝。主要研究對(duì)象為生物法生產(chǎn)丙烯酰胺、脂肽類生物表面活性劑、透明質(zhì)酸等多個(gè)大宗和精細(xì)化學(xué)品。2003年獲全國(guó)百篇優(yōu)秀博士論文獎(jiǎng)，2004年獲清華大學(xué)華新杰出學(xué)者獎(jiǎng)，2007年獲北京市科技新星稱號(hào)。2008年入選教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才。2010年和2013年分別獲中國(guó)石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)青年科技突出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)和技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)。2016年獲東營(yíng)市科學(xué)技術(shù)合作獎(jiǎng)。E-mail：yuhm@tsinghua.edu.cn

隨著“綠色發(fā)展”理念越來(lái)越深入人心，以高效、低耗、綠色為典型特征的工業(yè)生物技術(shù)日益受到各國(guó)政府、研究單位和產(chǎn)業(yè)界的高度重視[1]。而隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，諸如羥基乙酸、L-苯丙氨酸、D-對(duì)羥基苯甘氨酸、煙酰胺等越來(lái)越多的化學(xué)品實(shí)現(xiàn)了生物法綠色生產(chǎn)。其中，丙烯酰胺的生物法生產(chǎn)無(wú)疑是其中最為成功的案例之一[2]。丙烯酰胺（AM）是一種重要的化工產(chǎn)品，其聚合產(chǎn)物——聚丙烯酰胺（PAM）廣泛應(yīng)用于石油、水處理、造紙、冶金等領(lǐng)域[3]。尤其在石油開采中，PAM作為一種性能優(yōu)異的絮凝劑、增稠劑、增強(qiáng)劑等，被廣泛應(yīng)用于鉆井、堵水、減阻和驅(qū)油等[4]。

1 丙烯酰胺的生產(chǎn)方法

丙烯酰胺通常由丙烯腈水合得到，其生產(chǎn)工藝經(jīng)歷了從化學(xué)催化法到生物酶催化法的轉(zhuǎn)變。1964年美國(guó)氰氨公司率先開發(fā)了硫酸水合法，實(shí)現(xiàn)了丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)。隨后，以Cu為催化劑的催化水合法被開發(fā)出來(lái)并廣泛應(yīng)用。1985年，日本日東化學(xué)公司開發(fā)了以腈水合酶催化為核心的微生物法生產(chǎn)工藝。生物酶催化法相較于傳統(tǒng)的化學(xué)催化法具有轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物純度高以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)逐漸占據(jù)了主導(dǎo)地位。

在微生物法生產(chǎn)工藝中，丙烯酰胺是通過(guò)腈水合酶催化丙烯腈與水發(fā)生水合反應(yīng)而得到［圖1（a）］。其中，腈水合酶的應(yīng)用形式可以是固定化細(xì)胞、固定化酶、游離細(xì)胞乃至游離酶。目前，游離細(xì)胞催化法由于其工藝簡(jiǎn)單、操作方便、細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)多批次回用等特點(diǎn)，已經(jīng)成為我國(guó)生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的主要工藝，其簡(jiǎn)要工藝過(guò)程如圖1（b）所示。

圖1 游離細(xì)胞法丙烯酰胺生產(chǎn)工藝

整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程主要包含游離細(xì)胞的獲得、水合催化反應(yīng)和AM分離、精制三個(gè)階段。生產(chǎn)菌株通過(guò)種子罐以及發(fā)酵罐的培養(yǎng)，產(chǎn)生高活性的腈水合酶。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心或微濾分離獲得細(xì)胞沉淀，經(jīng)過(guò)洗滌后即可用于水合反應(yīng)。丙烯腈的水合反應(yīng)在水合反應(yīng)釜中進(jìn)行。其中，丙烯腈通常以流加的方式進(jìn)入水合釜的細(xì)胞懸浮液，并通過(guò)攪拌與反應(yīng)釜中均勻分散的細(xì)胞接觸并立即發(fā)生反應(yīng)生成AM產(chǎn)物；當(dāng)AM達(dá)到一定的濃度后，所得反應(yīng)液通過(guò)中空纖維超濾膜將菌體細(xì)胞與AM粗品進(jìn)行分離。菌體細(xì)胞可回收利用進(jìn)行下一批次水合反應(yīng)，而得到的粗品AM經(jīng)過(guò)陰陽(yáng)離子交換樹脂純化后，可獲得30%～50%的AM水劑產(chǎn)品。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)濃縮、結(jié)晶、干燥，即得到最后的AM晶體（粉劑）產(chǎn)品。

2 腈水合酶生產(chǎn)菌株及其改造方法

2.1 腈水合酶生產(chǎn)菌株及其性能需求

催化丙烯腈生成丙烯酰胺的腈水合酶廣泛存在于諾卡氏菌（Nocardia）、紅球菌（Rhodococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）等細(xì)菌中。自1984年以來(lái)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的菌株包括日本日東化學(xué)公司的Rhodococcus sp. N774、京都大學(xué)山田秀明等發(fā)現(xiàn)的Pseudomonas Chlororaphis B23和Rhodococcus rhodochrous J1[5]、上海農(nóng)藥研究所的諾卡氏菌Nocardia sp. 86-163[6]以及清華大學(xué)的Rhodococcus ruber TH[7]等。

雖然以腈水合酶為核心的生物催化法生成AM已經(jīng)有30多年的歷史，相關(guān)的生產(chǎn)技術(shù)也已越來(lái)越成熟，但在生產(chǎn)過(guò)程中仍然存在諸多問(wèn)題，包括：①部分生產(chǎn)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)絮凝沉降的現(xiàn)象，導(dǎo)致所得細(xì)胞生物量低，腈水合酶酶活也明顯下降，無(wú)法正常地用于后續(xù)催化水合過(guò)程；②游離細(xì)胞催化水合反應(yīng)過(guò)程中會(huì)有少量的副產(chǎn)物丙烯酸生成，這不僅導(dǎo)致了丙烯腈的單耗較高，還提高了后續(xù)的精制工藝成本；③在水合反應(yīng)過(guò)程中，游離細(xì)胞內(nèi)的腈水合酶受到流加的丙烯腈和高濃度AM溶液抑制作用以及不穩(wěn)定的反應(yīng)溫度的影響，其催化活性會(huì)迅速下降，因此，無(wú)法在一批次水合反應(yīng)中獲得較高的AM產(chǎn)物濃度。目前工廠水合反應(yīng)后AM的濃度一般僅為30%左右。為了獲得高濃度的AM水劑（40%～50%）和粉劑（60%以上AM降溫結(jié)晶），必須進(jìn)一步通過(guò)高溫濃縮工序?qū)崿F(xiàn)，這樣便導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的顯著提高。為了解決AM產(chǎn)物濃度不高的問(wèn)題，必須顯著提升用于AM生產(chǎn)的游離細(xì)胞和胞內(nèi)腈水合酶的穩(wěn)定性（抗逆性）。

2.2 重組菌株的細(xì)胞層次性能改造策略

菌株的性能對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物或者目標(biāo)酶的生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。為了得到理想的生產(chǎn)菌株，研究者往往通過(guò)代謝工程、基因工程和蛋白質(zhì)工程等手段來(lái)改善生產(chǎn)菌株的性能。表1總結(jié)列出了近幾年來(lái)開發(fā)的針對(duì)不同目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行的各種有效的菌株性能改造策略，其中包括了針對(duì)sigma因子[8]、cAMP受體蛋白[9]等的全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程方法、分子伴侶過(guò)表達(dá)加強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)[10]、合成強(qiáng)化對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物獲得具有重要作用的中間產(chǎn)物[11]以及敲除與目標(biāo)產(chǎn)物代謝產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用的代謝途徑[12]等。

表1 近幾年典型的菌株性能改造策略

其中，在丙烯酰胺生產(chǎn)菌株的性能改造方面，為了解決紅球菌細(xì)胞在大罐發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生絮凝沉降的問(wèn)題，Jiao等[13]發(fā)現(xiàn)了紅球菌細(xì)胞在一定條件下的光滑型-粗糙型菌落分型現(xiàn)象，并將這一現(xiàn)象與發(fā)酵過(guò)程中的菌體細(xì)胞絮凝沉降現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)；發(fā)現(xiàn)了只有光滑型菌落的菌體可用于大罐發(fā)酵，而粗糙型菌落的菌體則會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞沉降；關(guān)聯(lián)了紅球菌菌落分型與細(xì)胞表面親疏水性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了疏水性強(qiáng)的細(xì)胞具有高沉降速率；闡明了影響細(xì)胞表面親疏水性的關(guān)鍵分子是胞外多糖，還解決了企業(yè)在10t及以上大罐發(fā)酵過(guò)程中不時(shí)發(fā)生細(xì)胞絮凝沉降現(xiàn)象、無(wú)法實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的問(wèn)題。

Ma等[7]則通過(guò)敲除R. ruber TH中主要的酰胺酶基因，解決了重組細(xì)胞在AM生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物丙烯酸生成的問(wèn)題，得到了高酶活、低副產(chǎn)物的基因工程紅球菌R. ruber TH3。

更多的研究關(guān)注于如何提高菌體對(duì)外界不利環(huán)境的耐受性。在細(xì)胞中，酶與其他蛋白的作用過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，既有一些輔助蛋白負(fù)責(zé)酶的正確折疊，也有一些輔助蛋白負(fù)責(zé)酶失活后的再生。在對(duì)腈水合酶生產(chǎn)菌株的研究中，Ma等[14]通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程的方法，克隆并隨機(jī)突變了紅球菌R.ruber TH3的SigA因子，通過(guò)隨機(jī)突變的方法，篩選得到的突變菌在40%丙烯酰胺溶液浸泡條件下，酶活半衰期延長(zhǎng)了1.6倍。通過(guò)轉(zhuǎn)座體插入突變和等離子體誘變的方式，孫云鵬等[15]得到的改造菌在40%的丙烯酰胺浸泡時(shí)，半衰期提高30min。以上兩種方式均是通過(guò)隨機(jī)突變、定向進(jìn)化方式從而得到穩(wěn)定性更好地生產(chǎn)菌株。Tian等[16]則通過(guò)分子伴侶過(guò)表達(dá)的方式，利用分子伴侶對(duì)于酶失活后的保護(hù)和修復(fù)作用，在紅球菌R. ruber TH3中過(guò)表達(dá)E. coli的分子伴侶GroEL-ES，不僅使得腈水合酶的酶活有了明顯提升，而且當(dāng)在50%的丙烯酰胺溶液中浸泡時(shí)，改造后菌體的腈水合酶剩余酶活是原始菌體的3.8倍。最后利用該改造菌體，催化生成的丙烯酰胺溶液濃度由原始的49%提升至64%。而通過(guò)在有機(jī)溶劑耐受性更強(qiáng)的菌株中重組表達(dá)腈水合酶則是另一種方式，通過(guò)將R. rhodochrous M33中的腈水合酶基因在Corynebacterium glutamicum中表達(dá)，丙烯酰胺溶液濃度在催化6h后達(dá)到42.5%[17]。

2.3 酶分子層次的性能改造策略

游離細(xì)胞的催化性能，歸根結(jié)底取決于胞內(nèi)酶自身的活性和穩(wěn)定性。以酶的穩(wěn)定性改造為例，酶分子層次的改造策略一般集中在定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)兩個(gè)方面。如前文表1所示，在定向進(jìn)化方法中，研究者往往通過(guò)易錯(cuò)PCR、DNA shuf fl ing等手段構(gòu)建突變酶后，再利用高效的篩選方法得到耐受性提高的酶[18]。在理性設(shè)計(jì)方法中，研究者則往往通過(guò)改變酶的分子內(nèi)或者分子間作用力來(lái)提高酶的穩(wěn)定性，其中包括引入二硫鍵、鹽橋、氫鍵，改變疏水作用[19]，嗜熱酶的同源重組[19]，以及引入SpyTag/SpyCatcher使酶環(huán)化[20]、引入自組裝兩親性短肽使酶形成聚集體[21]等方式。定向進(jìn)化方式需要構(gòu)建大量的突變庫(kù)，并進(jìn)行大量且高效的篩選，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往適用于酶的結(jié)構(gòu)未知時(shí)的改造；而理性設(shè)計(jì)則一般是在已知酶的三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。

對(duì)于腈水合酶而言，由于大量的腈水合酶的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，因此更多的研究集中于理性設(shè)計(jì)的方法，如圖2所示。

圖2 腈水合酶性能改造策略

在對(duì)腈水合酶的鹽橋引入改造中，Chen等[22]利用分子模擬方法，在R. ruber TH3的腈水合酶中引入了嗜熱腈水合酶1UGQ和1V29的穩(wěn)定區(qū)域，通過(guò)增加鹽橋結(jié)構(gòu)使酶穩(wěn)定性有所提升。而Cui等[23]則利用位點(diǎn)靶定氨基酸重組技術(shù)和分子模擬來(lái)確定同源交換的蛋白片段，從而提高酶的穩(wěn)定性。Sun等[24]則通過(guò)直接將嗜熱腈水合酶PtNHase的C末端直接引入熱敏性腈水合酶BpNHase的C末端的方式來(lái)提高腈水合酶的穩(wěn)定性。在這些改造過(guò)程中，酶的穩(wěn)定性與酶的剛性程度息息相關(guān)，無(wú)論是嗜熱酶的同源重組，還是引入二硫鍵、鹽橋、氫鍵，其往往是通過(guò)增強(qiáng)酶的剛性來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性的提升?；谶@樣的原理，Yu等[19]介紹了剛性化柔性位點(diǎn)的方法，結(jié)合腈水合酶的三維結(jié)構(gòu)，利用B-FITTER等方法找到該結(jié)構(gòu)中的柔性位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)引入鹽橋、二硫鍵等方式來(lái)增強(qiáng)腈水合酶的穩(wěn)定性。除了在酶本身引入突變，使柔性位點(diǎn)的剛性增強(qiáng)外，Liu等[25]通過(guò)在腈水合酶柔性結(jié)構(gòu)更強(qiáng)的β亞基N末端引入自組裝兩親性短肽的方式使腈水合酶形成有序的納米結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成水凝膠的方式來(lái)提高酶的穩(wěn)定性。

2.4 酶和細(xì)胞協(xié)同改造策略

對(duì)于腈水合酶而言，酶分子一直是工業(yè)生物技術(shù)的重要對(duì)象，其活性和穩(wěn)定性是其在工業(yè)環(huán)境中高效穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵要素。然而單純的在酶層次上的改造有時(shí)難以得到理想的效果，充分利用細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境中分子伴侶等輔助分子對(duì)于酶的保護(hù)作用，實(shí)現(xiàn)重組酶和細(xì)胞的協(xié)同強(qiáng)化，是實(shí)現(xiàn)腈水合酶生產(chǎn)菌株性能提升的有效方式。清華大學(xué)化工系進(jìn)行性能改造的出發(fā)菌株是R. ruber TH，經(jīng)過(guò)48h發(fā)酵培養(yǎng)后其腈水合酶的酶活可達(dá)到300U/mg菌干重（1440萬(wàn)工廠單位），表現(xiàn)出了優(yōu)良的丙烯酰胺生產(chǎn)性能[7]。然而，如圖3所示，該菌株細(xì)胞中的酰胺酶會(huì)催化部分丙烯酰胺轉(zhuǎn)化為丙烯酸，導(dǎo)致了副產(chǎn)物的生成，造成了原料的浪費(fèi)和后續(xù)的精制成本提高。因此，通過(guò)酰胺酶基因的敲除，得到的重組菌R. ruber TH3副產(chǎn)物生成量減少了87%[7]。而過(guò)表達(dá)分子伴侶GroEL-GroES來(lái)協(xié)助腈水合酶新生肽鏈折疊和腈水合酶失活后的修復(fù)，則顯著提高了重組紅球菌細(xì)胞的有機(jī)溶劑耐受性和熱穩(wěn)定性[16]。在酶分子改造層次，為了進(jìn)一步提升該生產(chǎn)菌株的腈水合酶催化穩(wěn)定性，根據(jù)“木桶原理”提出了對(duì)酶熱敏感區(qū)“短板”進(jìn)行搜索并在該“短板”結(jié)構(gòu)區(qū)（熱不穩(wěn)定區(qū)域和亞基末端）引入嗜熱酶鹽橋模塊、強(qiáng)化鹽橋網(wǎng)絡(luò)提高酶穩(wěn)定性的新方法[4]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用分子模擬輔助，成功構(gòu)建了腈水合酶亞基界面間的二硫鍵，獲得了穩(wěn)定性顯著提高的“雙橋”強(qiáng)化腈水合酶。將該重組酶基因采用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化光滑型菌落的副產(chǎn)物基因敲除型宿主細(xì)胞TH3，獲得了染色體-質(zhì)粒載體“雙源”高表達(dá)、性能優(yōu)異的新一代產(chǎn)業(yè)化工程菌TH8。TH8菌株的構(gòu)建策略如圖3所示。

在30t水合釜中，TH8重組新菌株不僅單批次細(xì)胞催化生產(chǎn)AM的產(chǎn)物濃度可從320g/L（32%）提高到480g/L（48%）以上的高濃度水平，而且實(shí)現(xiàn)了重組細(xì)胞在大釜中生產(chǎn)高濃度AM的連續(xù)3批次回用；此外，無(wú)需后續(xù)高溫濃縮（90～94℃）工序，精制后即可出售AM水劑產(chǎn)品（40%～50%）；顯著降低生產(chǎn)晶體產(chǎn)品（60%濃度降溫結(jié)晶）提濃工序的能耗，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

圖3 腈水合酶和生產(chǎn)細(xì)胞協(xié)同改造策略

3 總結(jié)與展望

工業(yè)酶的活性和穩(wěn)定性是其在工業(yè)環(huán)境中高效穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵要素。對(duì)于已經(jīng)或接近實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的高活性工業(yè)酶，其穩(wěn)定性（包括熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性等）強(qiáng)化是工業(yè)生物催化的迫切需求，也是最普遍的共性科學(xué)問(wèn)題之一。因此，發(fā)展胞內(nèi)酶分子穩(wěn)定性強(qiáng)化的有效方法，并實(shí)現(xiàn)重組酶和細(xì)胞的協(xié)同強(qiáng)化，是游離細(xì)胞生物催化法工業(yè)應(yīng)用的迫切需求。

聚丙烯酰胺作為重要的驅(qū)油劑、水處理劑，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有重要地位，而作為其單體的丙烯酰胺的需求仍在不斷增長(zhǎng)。微生物法作為丙烯酰胺生產(chǎn)的主要方法，其生產(chǎn)菌株的性能對(duì)于生產(chǎn)效率的提升和節(jié)能、降耗、減排具有重要意義。而通過(guò)酶分子水平和細(xì)胞層面各種基因工程方法的協(xié)同改造，我國(guó)的腈水合酶生產(chǎn)菌株性能已經(jīng)有了巨大的提升。

今后，全新的高活性、高穩(wěn)定性目標(biāo)酶的發(fā)掘與改造、高性能游離酶催化新工藝、固定化酶催化新工藝以及微反應(yīng)器生物催化新工藝[26-28]等新型反應(yīng)過(guò)程的開發(fā)與強(qiáng)化，都是生物法生產(chǎn)丙烯酰胺乃至其他高附加值化學(xué)品生產(chǎn)新工藝的重要發(fā)展方向。

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Genetic strategies to engineer recombinant strains for acrylamide production using free resting cells as biocatalysts

YU Huimin，JIAO Song，SHEN Zhongyao
Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Key Laboratory of Industrial Biocatalysis（Ministry of Education）,Beijing 100084, China

Acrylamide is one kind of important amide compounds. Polyacrylamide, the polymerized product of acrylamide, has been widely used in enhanced oil recovery, water treatment, papermaking industry, metallurgy and so on.Because of the advantages such as high productivity, high product purity and environmental-friendly, biocatalysis approach using the free resting cells harboring nitrile hydratase as the biocatalysts is the main method to produce acrylamide so far. As a result, the performances of nitrile hydratase and its producing strains play a vital role in the whole process. In this paper,we summarized the strategies commonly used to evolve the engineered strains from both the cell level and the enzyme level;and especially highlighted the superior engineered strains harboring nitrile hydratase for acrylamide production. Finally,we introduced a synergistic evolution strategy for the cells of Rhodococcus and in-cell nitrile hydratases. With this method,we obtained the engineered strain R. ruber TH8. During the industrial scale bioproduction of acrylamide through free-cell catalysis of TH8, about 500 g/L acrylamide were obtained and the recombinant cells could be reused for three batches.

acrylamide; nitrile hydratase; free-cell catalysis; synergistic evolution of cells and in-cell enzymes

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.007

國(guó)家973計(jì)劃（2013CB733600），國(guó)家自然科學(xué)基金（21476126，21776157）