固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中4種磺胺類抗生素*

李柳毅，范輝，范磊，黃志，黎鳳霞

（南寧市環(huán)境保護監(jiān)測站，南寧 530012）

固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中4種磺胺類抗生素*

李柳毅，范輝，范磊，黃志，黎鳳霞

（南寧市環(huán)境保護監(jiān)測站，南寧 530012）

建立固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、醋磺胺甲惡唑4種磺胺類抗生素。樣品采用HLB柱進行萃取富集，流動相為甲醇-水(體積比為20∶80)，流量為0.5 mL／min，用SPD檢測器檢測，檢測波長為270 nm；采用外標法定量。4種磺胺類抗生素質(zhì)量濃度在4～160 ng／L范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.998 2，方法檢出限為1.0～1.7 ng／L，樣品加標回收率為75.2%～97.4%，測定結(jié)果的相對標準偏差為2.8%～6.1%（n=7）。該方法操作簡便，靈敏度高，可用于地表水中磺胺類抗生素的檢測。

固相萃??；高效液相色譜法；地表水；磺胺類抗生素

磺胺類藥物作為一類廣譜抗生素，可用于細菌性感染疾病的預(yù)防和治療。磺胺類藥物被大量使用后，主要以代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外，通過多種途徑進入土壤、河水、地表水甚至飲用水中［1-3］，造成環(huán)境污染。環(huán)境介質(zhì)中抗生素藥物的分布、遷移、代謝及其毒性已經(jīng)成為環(huán)境科學研究人員關(guān)注的熱點之一［4-9］。

地表水中的磺胺類抗生素多為痕量級別，國內(nèi)外較多采用液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定［10-11］，該法對實驗條件要求比較苛刻，且成本較高，難以普及。建立簡單、快速且低成本的方法檢測環(huán)境樣品中的磺胺類抗生素，不僅有利于推廣普及，而且也將成為研究其環(huán)境效應(yīng)的關(guān)鍵。筆者采用HLB固相萃取柱富集4種磺胺類抗生素，用甲醇-水(體積比為20∶80)等度洗脫，高效液相色譜法測定，實現(xiàn)了3 min內(nèi)有效分離并檢測4種磺胺類抗生素的含量。該方法操作簡便、靈敏度高、準確性好，能夠滿足地表水樣品中磺胺類抗生素的分析要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AD型，配備SPD檢測器，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；

半自動固相萃取儀：Visiprep DL型，美國Supelco公司；

氮吹濃縮儀：TurboVapⅡ型，美國Biotage公司；

超純水儀：Milli-Qacademic型，美國Millipore公司；

電子天平：MS204S型，感量為0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；

HLB固相萃取柱：500 mg／(6 mL)，美國Waters公司；

C18固相萃取柱、SCX固相萃取柱：均為1 000 mg／(6 mL)，美國安捷倫科技公司；

Si固相萃取柱：1 000 mg／(6 mL)，美國 Supelco公司；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、醋磺胺甲惡唑標準樣品：純度均大于99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

實驗用水為Milli-Qacademic制備的超純水。

1.2 樣品處理

1.2.1 采集

采集地表水樣品于棕色玻璃瓶中，充滿至溢流后，蓋上用錫紙包裹的磨口瓶塞，再用錫紙包裹瓶口。采集后的樣品應(yīng)盡快進行前處理，若不能及時分析，于4℃條件下冷藏不超過7 d。

1.2.2 凈化

依次用12 mL甲醇、12 mL超純水活化小柱。提取地表水樣品500 mL，以8 mL／min流量上樣，用HLB小柱進行萃取富集。富集完成后，用6 mL超純水清洗小柱，用氮吹20 min至干，再用12 mL甲醇淋洗，于35℃下用氮吹濃縮儀吹至近干，用甲醇定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3 標準溶液配制

混合標準溶液：分別稱取0.005 0 g磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、醋磺胺甲惡唑標準樣品，于100 mL容量瓶中，加入少量甲醇，待完全溶解后，用甲醇定容至標線，配制成4種磺胺類抗生素的混合標準溶液，質(zhì)量濃度均為500 mg／L，待用；

系列混合標準工作溶液：取4種磺胺類抗生素混合標準溶液，用甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為4，8，16，40，80，160 ng／L 的系列混合標準工作溶液，臨用前配制。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Shim-Pack XR-ODSⅡC18柱[2.0 mm×75 mm，2.2 μm，島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；柱溫：40℃，保持4.0 min；流動相：甲醇-水(體積比為20∶80)，等度洗脫，流量為0.5 mL／min；進樣體積：5 μL；檢測器：SPD檢測器；檢測波長：270 nm，采用色譜峰的保留時間定性，峰面積外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1 固相萃取小柱

考察了HLB，SCX，Si，C184種固相萃取柱對4種磺胺類抗生素的富集效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種固相萃取柱對地表水樣品中4種磺胺類抗生素的萃取效果有明顯差別。HLB柱的回收率明顯高于其它固相萃取柱，且HLB柱操作簡便，回收率不受小柱干涸的影響。因此選擇HLB固相萃取柱進行樣品中磺胺類抗生素的萃取富集。

2.1.2 樣品pH值

由于磺胺類抗生素pKa在5～8之間，樣品的pH值對富集效率存在一定影響，且文獻［12］中證實了樣品pH值的調(diào)節(jié)對富集效率的影響較大，故比較了 pH 值為 2.0，3.0，5.0，7.0，9.0 時，空白加標樣品在HLB柱的萃取效率。結(jié)果表明，不同的pH值對4種磺胺類抗生素的富集效率影響不大?？紤]到天然地表水的pH值均在7左右，故對地表水樣品的pH值不做調(diào)節(jié)。

2.1.3 洗脫溶劑用量

比較了8，12，16 mL的甲醇對4種磺胺類抗生素的洗脫效率，結(jié)果表明，目標化合物在3種用量的洗脫方式下回收率相當。綜合考慮洗脫效率以及后續(xù)處理的方便，試驗選用12 mL甲醇洗脫。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

分別選用乙腈-水和甲醇-水作為流動相體系進行對比試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種體系分離效果相當，考慮到乙腈毒性相對較大，因此選用甲醇-水作為流動相體系。

在等度洗脫條件下，試驗考察了甲醇-水的體積比為 80∶20，50∶50，20∶80時，流動相對 4種磺胺類抗生素保留時間及峰形的影響。結(jié)果表明，4種磺胺類抗生素隨流動相比例的變化而有所變化，當甲醇-水溶液體積比為20∶80時，分離效果最佳，4種磺胺類抗生素混合標準溶液的色譜圖見圖1。由圖1可知，4種磺胺類抗生素在3 min內(nèi)可實現(xiàn)較好的分離，且色譜峰形尖銳，有良好的對稱性。

2.2.2 檢測波長選擇

圖1 混合標準溶液的色譜圖

通過SPD檢測器檢測掃描，分析4種磺胺類抗生素的光譜，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)在250～280 nm波長范圍內(nèi)有較大的紫外吸收。為了兼顧各抗生素均有較高的靈敏度，試驗選擇270 nm為吸收波長［13-15］。

2.3 線性方程及檢出限

取1.3配制的系列混合標準工作溶液，按照1.4色譜條件進行測定，分別以各抗生素質(zhì)量濃度X為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知，各抗生素質(zhì)量濃度在4～160 ng／L范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998 3。以3倍信噪比(S／N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，計算得各抗生素的檢出限在1.0～1.7 ng／L之間，見表1。

表1 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 精密度試驗

取某地表水斷面樣品按1.2方法處理，在1.4色譜條件下進行連續(xù)測定7次，結(jié)果見表2。由表2可知，4種磺胺類抗生素測定結(jié)果的相對標準偏差為2.8%～6.1%，表明該方法具有良好的精密度。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.5 加標回收試驗

按照1.3方法處理某地表水斷面樣品，在1.4色譜條件下進樣分析，結(jié)果均未檢測出磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、醋磺胺甲惡唑4種磺胺類抗生素。在此空白樣品中分別加入定量的混合標準工作溶液，進行加標回收試驗，結(jié)果見表3。由表3可知，樣品的加標回收率為75.2%～97.4%。表明該法準確度較高，能滿足樣品分析要求。

表3 加標回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用固相萃取處理樣品，建立了高效液相色譜法測定地表水中磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、醋磺胺甲惡唑4種磺胺類抗生素的含量。該方法可在3 min內(nèi)實現(xiàn)分離檢測，具有操作簡單、準確度高且易推廣等優(yōu)點，可用于實際環(huán)境樣品的分析。

［1］馬麗麗，郭昌勝，胡偉，等.固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定土壤中氟喹諾酮、四環(huán)素和磺胺類抗生素［J］.分析化學，2010，38(1)： 21-26.

［2］蘇丹丹，劉惠玲，王夢夢.施用糞肥蔬菜基地抗生素殘留的研究進展［J］.環(huán)境保護科學，2015，41(1)： 117-120.

［3］曲翊.大連水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素殘留風險及其檢測方法研究進展［J］.環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2015，40(3)： 175-177.

［4］王曼霞，林黎明，劉心同，等.高效液相色譜法測定動物組織中8種磺胺類藥物殘留量［J］.化學分析計量，2004，13(2)： 14-16.

［5］閆正，任孟偉，張麗冰，等.超快速液相-質(zhì)譜法同時測定液體奶和奶粉中磺胺和喹諾酮類藥物殘留［J］.化學分析計量，2016，25(1)： 5-9.

［6］饒桂維，李成平，王倩，等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法測定禽蛋中磺胺嘧啶［J］.化學分析計量，2017，26(1)： 20-24.

［7］王軍淋，許嬌嬌，蔡增軒，等.固相萃取富集-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定源水和自來水中的40種多類別抗生素［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016(17)： 2 443-2 449.

［8］尹燕敏，沈穎青，顧海東，等.固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法同時測定水中的喹諾酮類和磺胺類抗生素［J］.化學分析計量，2013，22(3)：29-32.

［10］Kim S C, Carlson K. Quantification of human and veterinary antibiotics in water and sediment using SPE／LC／MS／MS［J］.Analytical amp; Bioanalytical Chemistry, 2007, 387(4)： 1 301-1 315.

［11］金明，周圍，劉紅衛(wèi)，等.超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定牛肝中七種磺胺類藥物［J］.分析試驗室，2009，28(2)： 16-20.

［12］秦宏兵，顧海東.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲用水源水中磺胺類抗生素［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，2013，29(1)： 98-102.

［13］陳吉之，閆超.飼料中9種磺胺類藥物的HPLC法快速分離與檢測［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2015，46(8)： 892-894.

［14］陳卿卿，金遷，林靈超.固相萃取-高效液相色譜法同時測定飼料中 4 種磺胺類藥物殘留［J］.化學分析計量，2017，26(3)： 84-87.

［15］張寧.高效液相色譜法測定雞肉中磺胺類藥物研究［J］.天津農(nóng)學院學報，2017，24(1)： 34-37.

Determination of Four Sulfonamide Antibiotics in Surface Water by High Performance Liquid Chromatography with Solid Phase Extraction

Li Liuyi, Fan Hui, Fan Lei, Huang Zhi, Li Fengxia
(Nanning Environmental Protection Monitoring Station, Nanning 530012, China)

A method was established for determining sulfadiazine, sulfadimidine, sulfachloropyridazine,acetylsulfamethoxazole in surface water by high performance liquid chromatography with solid phase extraction. The sample was extracted and enriched by Oasis HLB column. The mobile phase was methanol-water(volum rate was 20∶80)with flow rate of 0.5 mL／min.The sample was detected by SPD detector on detecting wavelengths of 270 nm. External standard method was used for quantitative analysis. The mass concentration of four sulfonamide antibiotics showed good linear relationships with the chromatography peak area in the range of 4-160 ng／L, the correlation coefficients were not less than 0.998 2. The method detection limits were 1.0-1.7 ng／L. The average recoveries for four sulfonamide antibiotics were 75.2%-97.4%, the relative standard deviations of determinition results were 2.8%-6.1%(n=7). The method is simple and sensitive, which can be applied to the analysis of sulfonamide antibiotics in surface water.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; surface water; sulfonamide antibiotics

O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：1008-6145(2017)06-0038-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.06.009

*南寧市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（20133324）；南寧市新世紀學術(shù)和技術(shù)帶頭人專項項目(2014009)

聯(lián)系人：范磊；E-mail： funly100@163.com

2017-08-22