四個羅非魚選育品種抗鏈球菌病能力差異研究

祝璟琳 鄒芝英 李大宇 肖 煒 徐 跑 楊 弘 薛良義

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

四個羅非魚選育品種抗鏈球菌病能力差異研究

祝璟琳1,2鄒芝英2李大宇2肖 煒2徐 跑2楊 弘2薛良義1

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

為篩選出抗病力優(yōu)良的羅非魚品種, 以奧利亞羅非魚“夏奧1號”、尼羅羅非魚“99”埃及品系、吉富羅非魚“中威1號”和奧尼羅非魚為研究對象, 33℃水溫暫養(yǎng)7d后分別進(jìn)行無乳鏈球菌人工感染實驗, 連續(xù)7d統(tǒng)計累計死亡率, 并于人工感染后0、24h、48h和72h采集血液和組織樣本, 研究這4個羅非魚選育品種抗鏈球菌病能力的差異。結(jié)果顯示: 感染7d后奧尼羅非魚的累計死亡率最低; 奧尼羅非魚的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)感染前后始終都低于其余3個品種羅非魚(P＜0.05); 埃及尼羅和奧尼在感染72h后球蛋白(GLO)分別顯著升高1.13倍和1.41倍;奧尼羅非魚白蛋白/球蛋白(A/G)在感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05), 而其余3個品種羅非魚A/G比值在感染后都顯著性降低(P＜0.05); 埃及尼羅的堿性磷酸酶(AKP)在感染72h后顯著降低(P＜0.05), 奧利亞和吉富的AKP表現(xiàn)為先上升后下降, 奧尼的AKP感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05); 各品種羅非魚血清中的乳酸脫氫酶(LDH)感染后都顯著升高(P＜0.05); 奧利亞、吉富和奧尼羅非魚的超氧化歧化酶(SOD)感染48h時都顯著升高(P＜0.05); 奧尼羅非魚在感染前后溶菌酶(LZM)活性都顯著高于其余3個品種羅非魚(P＜0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示：吉富和奧尼肝細(xì)胞水腫變性, 而奧利亞和埃及尼羅出現(xiàn)大面積肝細(xì)胞脂肪變性; 每個品種羅非魚均呈現(xiàn)嚴(yán)重的脾炎, 奧利亞、埃及尼羅和吉富的脾臟中大量鐵血黃素沉積; 每種羅非魚呈現(xiàn)不同程度的腎小球萎縮, 腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死。研究表明奧尼羅非魚抗鏈球菌病能力最強, 感染后血清中AST水平與肝受損程度呈一定的正相關(guān), LZM水平和羅非魚抗鏈球菌病能力呈一定的正相關(guān)。

品種; 羅非魚; 無乳鏈球菌; 生化指標(biāo); 溶菌酶; 抗病力; 組織病理

羅非魚(Oreochromisspp.)自1956年開始引進(jìn)我國, 現(xiàn)已成為我國第六大養(yǎng)殖魚類, 吉富羅非魚(Oreochromis niloticus♀×Oreochromis niloticus ♂)和奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂)是目前的主要養(yǎng)殖品種?！爸型?號”新品種是吉富羅非魚的代表性品種之一, 是以2006年從世界漁業(yè)中心新引進(jìn)的60個家系吉富羅非魚為原始親本, 采用家系選育和BLUP育種值評價技術(shù)通過5代連續(xù)選育獲得[1]。奧尼羅非魚通常以尼羅羅非魚♀×奧利亞羅非魚♂通過雜交育種途徑獲得, 其親本尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)以群體選育為主。

目前魚類的選育指標(biāo)以生長指標(biāo)作為主要衡量指標(biāo), 而對抗逆性和健康狀況指標(biāo)相對考慮較少。很多學(xué)者認(rèn)為血液學(xué)指標(biāo)評價對評估野生和養(yǎng)殖魚類的健康狀態(tài)至關(guān)重要[2—4]。血液學(xué)指標(biāo)因為能提供魚體應(yīng)激程度, 代謝異常, 生殖機能障礙和疾病的基本信息, 可作為魚體生理和病理變化的較好指示指標(biāo)[5]。而對病原菌感染后的魚體進(jìn)行組織病理學(xué)研究, 有利于疾病的診斷, 并為研究病原的感染機制提供依據(jù)[6]。Chen等[7]研究了羅非魚感染創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)后的血清生化指標(biāo)和病理變化之間的關(guān)聯(lián), 發(fā)現(xiàn)肝臟、腸和腎的病理受損嚴(yán)重程度和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)呈正相關(guān), 而和Na+、Cl–、膽固醇和總蛋白呈負(fù)相關(guān)。徐曉津等[8]對大黃魚(Larimichthys crocea)感染哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)后血液生化指標(biāo)的變化及組織病理學(xué)進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)血清指標(biāo)的測定可以作為大黃魚哈維氏弧菌病細(xì)菌感染的指標(biāo), 病魚的肝、腎等發(fā)生了嚴(yán)重病變, 肝、腎功能不全。目前羅非魚高密度、高集約化養(yǎng)殖方式導(dǎo)致鏈球菌病頻繁暴發(fā)[9],其病原菌2008年前以海豚鏈球菌為主, 2008年后以無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)為主[10]。國內(nèi)外研究表明, 羅非魚的生長最適宜溫度是29—31℃,水溫高于32℃時, 羅非魚更容易感染無乳鏈球菌[6,9]。本文以奧尼羅非魚及其親本奧利亞羅非魚和埃及尼羅羅非魚為對象, 并與吉富羅非魚相比較, 研究這4個羅非魚選育品種在水溫33℃時抗鏈球菌能力的差異, 初步篩選出抗病力優(yōu)良的羅非魚品種, 探索羅非魚抗病機理, 并了解選育途徑對魚類抗病力的影響。

1 材料與方法

1.1 無乳鏈球菌

病原菌保存于本實驗室, 編號LB110808-2, 經(jīng)16S rDNA分子鑒定為無乳鏈球菌(GenBank登錄號:JQ990153)。

1.2 實驗用魚

奧利亞羅非魚、埃及尼羅羅非魚、吉富羅非魚和奧尼羅非魚均來自農(nóng)業(yè)部羅非魚遺傳育種中心, 奧利亞羅非魚為“夏奧1號”新品種(登記號: GS-01-002-2006), 魚體質(zhì)量為(60.71±5.63) g; 尼羅羅非魚為1999年引自埃及農(nóng)業(yè)部和農(nóng)墾部水產(chǎn)研究中心實驗室的埃及品系, 魚體質(zhì)量為(59.65±4.59) g;奧尼羅非魚(登記號: GS-02-001-1996)為埃及尼羅♀ד夏奧1號”奧利亞羅非魚♂的雜交子一代, 魚體質(zhì)量為(63.65±4.84) g; 吉富羅非魚為“中威1號”新品種(登記號: GS-01-003-2014), 魚體質(zhì)量為(65.38±5.27) g。人工感染實驗前在實驗室分別于(33±1)℃水溫下暫養(yǎng)7d, 養(yǎng)殖桶體積為360 L, 每天投喂2次。

1.3 人工感染實驗

將經(jīng)鑒定的無乳鏈球菌原種從冰箱中取出, 復(fù)壯后接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基(BHI)中, 28℃200 r/min擴大培養(yǎng)24h后, 4000 r /min離心 5min, 用無菌的8.5 g/L NaCl溶液洗滌后配成1.5×109CFU/mL的菌懸液原液。開展人工感染實驗Ⅰ研究4個羅非魚選育品種對無乳鏈球菌的抗病力差異, 同時開展人工感染實驗Ⅱ研究低濃度腹腔注射無乳鏈球菌后對4個羅非魚選育品種的血清生化指標(biāo)和組織病理的影響。

人工感染實驗Ⅰ: 將菌懸液原液用8.5 g/L無菌NaCl溶液稀釋成1.5×108CFU/mL的菌液, 每個品種設(shè)置3個養(yǎng)殖桶, 每桶10尾, 每尾魚腹腔注射0.3 mL菌液。對照組注射等量的8.5 g/L NaCl溶液。攻毒后連續(xù)7d觀察記錄死亡尾數(shù), 并及時撈出死魚。

人工感染實驗Ⅱ: 將菌懸液原液用8.5 g/L無菌NaCl溶液稀釋成1.5×107CFU/mL的菌液, 每個品種設(shè)置3個養(yǎng)殖桶, 每桶20尾, 每尾魚腹腔注射0.3 mL菌液, 同時設(shè)置相應(yīng)的對照組注射等量的8.5 g/L NaCl溶液。

實驗期間溶解氧保持在5 mg/L以上, 水溫(33±1)℃, 實驗期間不投喂。人工感染3d后每個羅非魚選育品種隨機取瀕死的羅非魚解剖, 無菌操作取腦和腎臟組織在血平板上分離、純化病原菌, 并用梅里埃API 20 Strep試劑條進(jìn)行快速鑒定。

1.4 采樣與處理

在人工感染實驗Ⅱ中, 魚感染0、24h、48h和72h分別從每個養(yǎng)殖桶中取2尾魚, 每個時間點每個羅非魚選育品種共6尾魚用MS-222(200 mg/L)快速麻醉, 進(jìn)行尾靜脈取血, 室溫靜置2h后4000 r/min離心10min分離血清, 保存于–20℃冰箱中。同時取感染72h后4個羅非魚選育品種的肝臟、脾臟和腎臟用波恩氏液固定后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.5 血清生化指標(biāo)測定

每個品種的血清在日立7600全自動生化分析儀上檢測下列指標(biāo): 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自日本和光純藥工業(yè)株式會社, 堿性磷酸酶(AKP, 試劑盒購自四川邁克生物科技股份有限公司, 超氧化歧化酶(SOD)試劑盒購自寧波美康生物科技有限公司。溶菌酶(LZM)試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 具體操作按照使用說明進(jìn)行。

1.6 組織病理學(xué)觀察

[11]的方法, 將組織從固定液里取出,用70%酒精洗滌至無色; 組織依次進(jìn)行梯度脫水;二甲苯透明; 石蠟包埋; KD2258型切片機連續(xù)切片,厚度為4—7 μm; 脫蠟和水化; 蘇木精-伊紅(HE)染色后將切片放入梯度酒精里脫水和透明; 中性樹膠封片后用尼康80i顯微鏡觀察并拍照保存。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2007軟件進(jìn)行初步處理, 再用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析, Duncan’s法多重比較檢驗差異性, 用Origin 8.0軟件作圖,P＜0.05表明差異顯著。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 四個羅非魚選育品種抗鏈球菌病能力差異比較

在人工感染后, 4個品種的瀕死羅非魚都表現(xiàn)出全身發(fā)黑, 游姿失衡等鏈球菌病的典型癥狀, 在感染3d后一些瀕死羅非魚顯示角膜混濁, 突眼等現(xiàn)象, 解剖魚體后發(fā)現(xiàn)肝臟充血、脾臟充血腫大等,無菌操作分離的細(xì)菌經(jīng)API 20 Strep鑒定為無乳鏈球菌。人工感染實驗Ⅰ中, 對照組均沒有發(fā)現(xiàn)羅非魚死亡, 而試驗組感染3d后奧尼羅非魚的累計死亡率(40%)和奧利亞羅非魚(50%)差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于吉富羅非魚(76.67%)和埃及尼羅羅非魚(96.67%)(P＜0.05)。感染4d后奧利亞羅非魚累計死亡率為73.33%, 顯著高于奧尼羅非魚(46.67%)(P＜0.05)。感染7d后奧尼羅非魚的累計死亡率(53.33%)顯著低于吉富羅非魚(86.67%)、奧利亞羅非魚(90%)和埃及尼羅羅非魚(96.67%)(P＜0.05), 而奧利亞羅非魚、埃及尼羅羅非魚和吉富羅非魚之間的累計死亡率差異不顯著(P＞0.05)(圖1)。

2.2 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的變化

由表1可知, 埃及尼羅羅非魚和奧尼羅非魚的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05), 而奧利亞羅非魚表現(xiàn)為先上升后下降, 吉富羅非魚卻一直保持上升趨勢, 但埃及尼羅羅非魚的ALT在感染前就顯著高于其余3個品種(P＜0.05),感染72h后奧利亞羅非魚和奧尼羅非魚的ALT活力顯著低于埃及尼羅和吉富羅非魚(P＜0.05)。奧利亞和吉富羅非魚在感染24h時AST就顯著升高(P＜0.05), 而埃及尼羅和奧尼羅非魚的AST在感染48h后才顯著升高(P＜0.05), 但埃及尼羅羅非魚的AST在感染前就顯著高于其余3個品種的羅非魚(P＜0.05), 而奧尼羅非魚的AST活力在感染前后每個時間點都比其余3個品種羅非魚要低(P＜0.05)。

2.3 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清球蛋白和白蛋白/球蛋白的變化

圖1 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后的累計死亡率Fig. 1 The cumulative mortality of four Oreochromis spp. bleeding species infected by S. agalactiae

表1 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化Tab. 1 The comparison on serum glutamic-pyruvic transaminase and glutamic-oxaloacetic transamnase activities of four Oreochromis spp.bleeding species infected by S. agalactiae (n=6; x±SD)

表2 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清的球蛋白和白蛋白/球蛋白的變化Tab. 2 The comparison on serum globulin and albumin/globulin activities of four Oreochromis spp. bleeding species infected by S.agalactiae (n=6; x±SD)

由表2可知, 埃及尼羅羅非魚和奧尼羅非魚在感染72h后血清GLO水平分別顯著升高1.13倍和1.41倍(P＜0.05), 但感染前奧尼羅非魚GLO水平顯著低于埃及尼羅羅非魚(P＜0.05), 而奧利亞羅非魚和吉富羅非魚GLO水平在感染前后沒有顯著性差異(P＞0.05), 感染72h后各品種之間GLO水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05); 奧尼羅非魚A/G在感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05), 而奧利亞羅非魚在感染48h后顯著降低(P＜0.05), 埃及尼羅羅非魚和吉富羅非魚A/G在感染72h后顯著性降低(P＜0.05)。

2.4 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的變化

由表3可知, 埃及尼羅羅非魚的AKP在感染72h后顯著降低(P＜0.05), 奧利亞和吉富羅非魚的AKP表現(xiàn)為先上升后下降, 在感染24h時達(dá)到峰值,但在感染72h時和感染前沒有顯著性差異(P＞0.05),奧尼羅非魚的AKP感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05), 并且在感染前后各時間點都顯著低于其余品種羅非魚(P＜0.05)。感染前和感染48h后吉富和奧尼羅非魚的LDH顯著低于埃及尼羅和奧利亞羅非魚(P＜0.05)。奧利亞羅非魚的LDH感染后一直持續(xù)顯著升高(P＜0.05), 在感染后72h其值為感染前的3.22倍, 而埃及尼羅、吉富和奧尼羅非魚的LDH卻先升高后降低, 感染48h后達(dá)到峰值, 分別為感染前的2.31倍、6.53倍和7.28倍。

2.5 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清超氧化物歧化酶和溶菌酶的變化

由表4可知, 奧利亞和奧尼羅非魚的SOD感染48h后顯著升高(P＜0.05), 吉富羅非魚的SOD在感染48h時顯著升高(P＜0.05), 感染72h后恢復(fù)到感染前水平, 埃及尼羅羅非魚的SOD感染前后沒有顯著性變化(P＞0.05), 但其值都顯著高于其余各品種(P＜0.05)。奧利亞羅非魚LZM在感染48h后顯著降低(P＜0.05), 感染72h后又顯著升高到感染前水平,埃及尼羅和奧尼羅非魚在感染48h后顯著升高(P＜0.05), 而吉富羅非魚在感染72h后才顯著升高(P＜0.05), 奧尼羅非魚在各時間點LZM活性都顯著高于其余品種羅非魚(P＜0.05)。

2.6 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后的組織病理學(xué)變化

在人工感染無乳鏈球菌后, 4個羅非魚選育品種的肝臟、脾臟和腎臟均表現(xiàn)出顯著的病理學(xué)變化。奧利亞羅非魚: 與對照組肝臟相比(圖版Ⅰ-1),感染組肝臟脂肪變性, 見許多大小不等的脂肪空泡,肝索排列紊亂(圖版Ⅰ-2); 與對照組脾臟相比(圖版Ⅰ-3), 感染組脾臟含鐵血黃素沉積, 脾實質(zhì)細(xì)胞水腫, 淋巴細(xì)胞, 單核細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-4); 與對照組腎臟相比(圖版Ⅰ-5), 感染組腎小球輕微萎縮, 腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性, 并見少量淋巴細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-6)。埃及尼羅羅非魚: 與對照組肝臟相比(圖版Ⅰ-7), 感染組肝臟嚴(yán)重脂肪變性、壞死, 淋巴細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-8); 與對照組脾臟相比(圖版Ⅰ-9),感染組脾臟含鐵血黃素沉積, 周圍見淋巴細(xì)胞浸潤,血漿蛋白滲出呈淀粉樣變性(圖版Ⅰ-10); 與對照組腎臟相比(圖版Ⅰ-11), 感染組腎小球嚴(yán)重萎縮空泡化, 腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死(圖版Ⅰ-12)。吉富羅非魚: 與對照組肝臟相比(圖版Ⅰ-13), 感染組肝細(xì)胞水腫, 細(xì)胞內(nèi)玻璃樣變, 血管壁見淋巴細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-14), 與對照組脾臟相比(圖版Ⅰ-15),感染組脾充血呈淀粉樣變性, 含鐵血黃素沉積和巨噬細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-16), 與對照組腎臟相比(圖版Ⅰ-17), 感染組腎小球萎縮空泡化, 腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-18); 奧尼羅非魚: 與對照組肝臟相比(圖版Ⅰ-19), 感染組肝索排列紊亂, 肝細(xì)胞水腫顆粒變性, 靜脈周圍見纖維樣變性(圖版Ⅰ-20), 與對照組脾臟相比(圖版Ⅰ-21), 感染組脾充血呈淀粉樣變性, 大量巨噬細(xì)胞浸潤(圖版Ⅰ-22), 與對照組腎臟相比(圖版Ⅰ-23), 感染組腎小球萎縮, 腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性(圖版Ⅰ-24)。

3 討論

3.1 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后抗病力差異分析

目前我國羅非魚具有穩(wěn)定遺傳性狀的品種有11個, 生產(chǎn)上常用的尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚、“新吉富”羅非魚(NEW GIFT tilapia,O. niloticus♀×O. niloticus♂)等養(yǎng)殖品種采用群體選育路線, 吉富羅非魚采用家系選育路線。由于羅非魚種間雜交后代在一些生產(chǎn)性狀上表現(xiàn)出明顯雜種優(yōu)勢, 生產(chǎn)中也被廣泛采用, 如奧尼雜交羅非魚。強俊等[12]研究表明, 感染海豚鏈球菌4d后吉富羅非魚和“新吉富”羅非魚累積死亡率顯著高于紅羅非魚(Red tilapia,Oreochromisspp.)和埃及尼羅羅非魚(O. niloticusEgypt strain), 而本文研究表明感染3d后吉富羅非魚的累積死亡率顯著低于埃及尼羅羅非魚, 但感染4d后兩者之間的累積死亡率沒有顯著性差異,這可能是因為不同的品種對不同鏈球菌的易感性不同, 或者不同鏈球菌毒力差異所致。Huang等[13]比較了新吉富羅非魚, 奧尼羅非魚和吉奧羅非魚(NEW GIFTO. niloticus♀×O. aureus♂)對無乳鏈球菌的抗病力差異, 發(fā)現(xiàn)奧尼羅非魚抗病力最強。柯劍等[14]用嗜水氣單胞菌浸泡感染奧利亞、尼羅、奧尼、吉富、莫荷(O. mossambica♀×O. hornorum♂)5個品種羅非魚, 表明奧利亞和奧尼羅非魚抗病力相對較好, 本實驗顯示感染無乳鏈球菌7d后奧尼羅非魚的累計死亡率最低。結(jié)果表明雜交育種獲得的奧尼雜交魚抗病力不僅超過親代埃及尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚, 而且超過了家系選育獲得的吉富羅非魚, 證明了雜交育種是行之有效的品種培育的手段之一, 能顯著增強魚體抗病力。

表3 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清的堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的變化Tab. 3 The comparison on serum alkaline phosphatasel activity and lactic dehydrogenase of four Oreochromis spp. bleeding species infected by S. agalactiae (n=6; x±SD)

表4 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清的超氧化物歧化酶和溶菌酶的變化Tab. 4 The comparison on serum superoxide dismutase and lysozyme activities of four Oreochromis spp. bleeding species infected by S.agalactiae (n=6; x±SD)

3.2 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后血清生化指標(biāo)的變化

血液生化指標(biāo)是反映魚類的生理代謝狀態(tài)變化和魚體對病原菌生理響應(yīng)的有力指標(biāo), 能評估魚體的健康狀態(tài)[5]。已有研究表明, 魚體被病原菌感染后血清中ALT和AST含量都會顯著增加, 如羅非魚被創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和海豚鏈球菌感染后[7], 大黃魚(Pseudosciaena crocea)被哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后[8], 鯰(Silurus asotus)被愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染后[15]。ALT、AST是肝臟受損傷重要的指示酶[16], 本試驗中奧利亞羅非魚和吉富羅非魚的ALT和AST在感染12h后就顯著上升, 埃及尼羅和奧尼羅非魚的AST在感染48h后才顯著升高, 而埃及尼羅和奧尼的ALT感染前后沒有顯著性變化, 奧尼羅非魚的AST在感染前后始終都低于其余3個品種羅非魚, 說明奧尼羅非魚的抗病力較強, 肝臟受損較輕, 但埃及尼羅的ALT和AST在攻毒前就顯著高于其余3個品種的羅非魚, 可能是因為埃及尼羅羅非魚相比較其余3種羅非魚對高溫的耐受性較差, 在暫養(yǎng)1周的時候受到高溫應(yīng)激肝臟就已經(jīng)受損[17]。

球蛋白(GLO)主要在肝的淋巴組織生成, 參與機體免疫反應(yīng), 較高的血清球蛋白含量對應(yīng)著較強的免疫力[18]。強俊等[12]研究表明, 不同品系羅非魚感染海豚鏈球菌96h后, 埃及尼羅與紅羅非魚GLO顯著上升(P＜0.05), 而吉富羅非魚與新吉富羅非魚的GLO沒有顯著變化(P＞0.05)。本試驗中埃及尼羅羅非魚和奧尼羅非魚在感染72h后GLO分別顯著升高1.13倍和1.41倍, 而奧利亞和吉富羅非魚GLO在感染前后沒有顯著性差異, 說明奧尼羅非魚對應(yīng)著較強的免疫力。A/G比值可以衡量機體正常的蛋白質(zhì)維持程度[12,17]。強俊等[12]研究表明埃及尼羅與紅羅非魚隨感染時間的延長, A/G比值基本呈下降趨勢。我們之前的研究表明埃及尼羅羅非魚在高溫應(yīng)激下無乳鏈球菌感染后A/G的比值攻毒后呈下降趨勢[17]。本試驗中奧尼羅非魚A/G在感染前后沒有顯著性變化, 而奧利亞羅非魚, 埃及尼羅羅非魚和吉富羅非魚A/G比值在感染后都顯著性降低, 說明感染無乳鏈球菌后奧尼羅非魚體內(nèi)的蛋白維持程度最好, 能較好地抵抗病原菌的侵染。

非特異性免疫防御機制作為魚類抵抗病原的第一道屏障, 在維持魚類機體健康和抗病原防御中具有重要的作用[19]。AKP和LDH是除SOD和LZM之外魚體血清中的重要的非特異免疫酶。AKP是一種重要的代謝調(diào)控酶, 參與鈣磷代謝和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移, 并且能夠通過改變病原體的表面結(jié)構(gòu)提高機體對病原體的識別和吞噬能力, 有助于增強魚體的抗病力[12,17]。不同品系羅非魚感染海豚鏈球菌96h血清中AKP顯著降低[12], Yu等[15]報道患遲緩愛德華菌病的鲇血清中AKP降低, 推測可能與貧血相關(guān), 這通常是代謝活動減弱的結(jié)果。我們之前研究表明高溫應(yīng)激下羅非魚感染無乳鏈球菌后AKP表現(xiàn)為先上升后下降[17]。本研究中埃及尼羅羅非魚的AKP在感染72h后顯著降低, 奧利亞和吉富羅非魚的AKP表現(xiàn)為先上升后下降, 奧尼羅非魚的AKP感染前后沒有顯著性變化, 說明無乳鏈球菌感染對埃及尼羅羅非魚代謝活動影響最大, 對奧尼羅非魚影響最小。LDH含量增高, 是病魚肌肉組織受損的表征[20]。金珊等[21]報道加州鱸(Micropterus salmoides)患白云病后血液中LDH顯著上升, 但大黃魚感染哈維氏弧菌后LDH卻沒有顯著性變化[8],這可能是因為哈維氏弧菌感染對大黃魚的肌肉損傷影響較小。本試驗中感染無乳鏈球菌后各品種羅非魚血清中的LDH都顯著升高, 感染前和感染48h后吉富和奧尼羅非魚的LDH顯著低于埃及尼羅和奧利亞羅非魚, 說明無乳鏈球菌感染對各品種羅非魚的肌肉都造成了損傷, 而埃及尼羅和奧利亞羅非魚在試驗前暫養(yǎng)階段高水溫就對魚體肌肉有了一定的損傷。

SOD作為抗氧化酶, 能夠清除有危害性的活性氧, 使機體防御過氧化損害, 并與免疫水平相關(guān), 有助于增強機體的免疫功能和抗病能力[17]。高溫應(yīng)激下無乳鏈球菌感染96h內(nèi)SOD表現(xiàn)為先升高后降低, 升高的原因可能是魚體遭到無乳鏈球菌侵襲后,激活了該誘導(dǎo)酶, 下降則可能是因為病原菌感染而導(dǎo)致活性氧自由基的水平超過了魚體自身的清除閡值, SOD活性受到了抑制[17]。本試驗中奧利亞、吉富羅非魚和奧尼羅非魚的SOD感染48h時都顯著升高, 說明無乳鏈球菌感染誘導(dǎo)了SOD的表達(dá), 只有埃及尼羅羅非魚的SOD感染前后沒有顯著性變化, 但其值都顯著高于其余各品種的值, 我們之前的研究表明埃及尼羅羅非魚在33℃SOD水平顯著高于29℃, 說明高溫應(yīng)激造成埃及尼羅機體損傷,使魚體SOD升高以抵御損傷[17]。LZM由白細(xì)胞釋放, 作為是魚類最常見的體液免疫指標(biāo)之一, 在抗菌活動中起著重要作用[22]。Huang等[13]報道LZM水平和魚體抵抗無乳鏈球菌侵染的能力有一定的相關(guān)性, 奧尼羅非魚比新吉富羅非魚和吉奧羅非魚LZM水平更高, 對鏈球菌感染也有更高的抵抗力,LZM水平可作為抗鏈球菌品系的選育指標(biāo)。與此類似的是, 具有更高LZM水平的虹鱒和鯉魚家系對嗜水氣單胞菌具有更強的抵抗力[23,24]。本試驗中奧尼羅非魚在各時間點溶菌酶活性都顯著高于其余各品種羅非魚, 說明奧尼羅非魚對無乳鏈球菌的抗病力最強。

3.3 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后組織病理的變化

對魚體進(jìn)行組織病理學(xué)檢查, 有利于疾病的診斷[6,17]。我們之前的研究表明羅非魚感染無乳鏈球菌后會引起各內(nèi)臟器官的廣泛充血、水腫、變性和炎性細(xì)胞浸潤, 嚴(yán)重的細(xì)胞壞死[11]。高溫應(yīng)激會對魚體的肝臟、脾臟和腎臟造成輕微病變, 無乳鏈球菌感染12h后脾臟就發(fā)生了嚴(yán)重充血, 感染24h后脾臟呈淀粉樣變性, 壞死, 感染48h后腎小球均發(fā)生萎縮, 腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死[17]。在本試驗中,人工感染無乳鏈球菌后, 4個品種羅非魚的肝臟、脾臟和腎臟均出現(xiàn)不同程度的病理變化, 其中吉富羅非魚和奧尼羅非魚肝索排列紊亂, 肝細(xì)胞水腫變性,而奧利亞羅非魚和埃及尼羅羅非魚肝臟中大面積肝細(xì)胞脂肪變性, 最終使肝代謝受到阻礙, 引起肝功能障礙, 其病理學(xué)變化程度與血清中AST值有一定的相關(guān)性, 感染72h后奧利亞羅非魚和埃及尼羅羅非魚血清中的AST值顯著高于吉富羅非魚和奧尼羅非魚, Chen等[7]也研究表明了羅非魚感染創(chuàng)傷弧菌與海豚鏈球菌后肝和腎的病理學(xué)變化嚴(yán)重程度與血液中的ALT和AST呈正相關(guān)。每個品種的羅非魚感染無乳鏈球菌后都引起了嚴(yán)重的脾炎, 大量巨噬細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤, 這可能是因為脾臟作為免疫器官, 優(yōu)先響應(yīng)吞噬鏈球菌[25]。此外, 奧利亞、埃及尼羅和吉富羅非魚的脾臟中大量鐵血黃素沉積, 說明這3種羅非魚明紅細(xì)胞大量被破壞, 溶血嚴(yán)重, 造成脾臟造血功能較低, 導(dǎo)致貧血以及免疫功能降低, 致使機體抵抗力降低[11]。病原菌產(chǎn)生的毒素致使奧利亞羅非魚和奧尼羅非魚腎小球輕微萎縮, 腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性, 埃及尼羅羅非魚和吉富羅非魚腎小球嚴(yán)重萎縮空泡化,腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死, 說明鏈球菌感染造成羅非魚腎功能障礙。海豚鏈球菌的感染也能引起羅非魚腎小管上皮細(xì)胞的相似的病變, 造成腎小球的濾過及腎小管的重吸收作用減弱, 腎臟機能降低, 以致體內(nèi)滲透壓及水鹽失衡。

綜上所述, 奧尼羅非魚在4個羅非魚選育品種中抗鏈球菌病能力最強; 4個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后肝臟、脾臟和腎臟均出現(xiàn)不同程度的病理變化, 血清中AST水平與肝受損程度呈一定的正相關(guān), LZM水平和羅非魚抗鏈球菌病能力呈一定的正相關(guān)。

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STUDY ON RESISTANT DIFFERENCE AMONG FOUR BLEEDING SPECIES OF TILAPIA OREOCHROMIS SPP. FOLLOWING STREPTOCOCCUS AGALACTIAE CHALLENGE

ZHU Jing-Lin1,2, ZOU Zhi-Ying2, LI Da-Yu2, XIAO Wei2, XU Pao2, YANG Hong2and XUE Liang-Yi1
(1. College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

The aim of this paper was to identify a tilapia strain that is the most resistant to the infection ofStreptococcus agalactiae. The serum biochemical parameters and histopathology of Blue tilapia (Oreochromis aureus) “Xia’ao No.1”, Nile tilapia (Oreochromis niloticus) “99 strain”, GIFT tilapia (Oreochromis niloticus♀×Oreochromis niloticus♂) “Zhongwei No.1”, Hybrid tilapia (Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂) infected byS. agalac

tiaewere investigated. They were cultured on (33±1) ℃. All fish were acclimated to the laboratory conditions for one week then artificially inducedS. agalactiaeto the fish. The cumulative mortality was recorded at different time points.Blood and tissue samples were collected at 0, 12h, 24h, 48h and 72h after infection. The result showed that the cumulative mortality of Hybrid tilapia was significantly lower than that of other species; Glutamic-oxaloacetic transamnase(AST) activity of Hybrid tilapia was consistently lower than that of other three strains (P＜0.05); compared with initial measurement, globulin of Nile tilapia and Hybrid tilapia increased by 1.13 times and 1.41 times respectively at 72h after infection. Albumin/globulin (A/G) index of Hybrid tilapia showed no significantly difference (P＞0.05), while that of other three species was significantly lower after infection (P＜0.05); Alkaline phosphatase (AKP) activity of Nile tilapia decreased significantly at 72h after infection (P＜0.05) while AKP levels of Blue tilapia and GIFT tilapia increased first followed by decrease, and AKP of Hybrid tilapia showed no significantly difference (P＞0.05). Lactic dehydrogenase (LDH) of all four strains increased significantly on the progress of disease after infection (P＜0.05). Superoxide dismutase (SOD) activities of Blue tilapia, GIFT tilapia and Hybrid tilapia increased significantly at 48h after infection (P＜0.05). Lysozyme (LZM) activities of Hybrid tilapia were consistently higher than that of other three strains(P＜0.05). Hepatocytes of GIFT and Hybrid tilapia showed hydropic degeneration, while hepatocytes of Blue tilapia,Nile tilapia showed highly vacuolation and macrovesicular steatosis. The spleen of all challenged strains showed had serious splenitis while the spleen of Blue tilapia, Nile tilapia and GIFT tilapia contained a large number of hemosiderin deposition. Renal glomerular atrophy, degeneration and necrosis in renal tubule epithelial cell were apparent after infection. The results indicated that Hybrid tilapia was the most resistant toS. agalactiae; AST in serum was correlated positively with liver damage; LZM level was correlated positively with the anti-Streptococcusability.

Species;Oreochromisspp.;Streptococcus agalactiae; Biochemical parameters; Lysozyme (LZM);Resistance to disease; Histopathology

S941

A

1000-3207(2017)06-1232-10

2016-09-30;

2017-05-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-49); 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2015JBFM27、2017JBFZ03、2015JBFM08)資助 [Supported by the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-49); the Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2015JBFM27, 2017JBFZ03,2015JBFM08)]

祝璟琳(1983—), 男, 浙江省武義縣人; 博士研究生; 研究方向為羅非魚育種與病害防治。E-mail: zhujl@ffrc.cn

楊弘, 研究員；E-mail: yangh@ffrc.cn; 薛良義, 教授；E-mail: xueliangyi@nbu.edu.cn

10.7541/2017.153

圖版Ⅰ 四個羅非魚選育品種感染無乳鏈球菌后肝臟、脾臟和腎臟的組織病理變化PlateⅠ Histopathological changes in liver, spleen and kidney of four Oreochromis spp. bleeding species infected by Streptococcus agalactiae