馬鈴薯Y病毒對(duì)不同馬鈴薯品種的致病力

白艷菊，韓樹(shù)鑫，高艷玲，張 威，范國(guó)權(quán)，邱彩玲，申 宇，張 抒，尚 慧，聶先舟，文景芝

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3.加拿大農(nóng)業(yè)部弗里得里克頓研究中心，新不倫瑞克 弗雷德里克頓 E3B 4Z7)

馬鈴薯Y病毒對(duì)不同馬鈴薯品種的致病力

白艷菊1,2，韓樹(shù)鑫1，高艷玲1,2，張 威1,2，范國(guó)權(quán)2，邱彩玲2，申 宇2，張 抒2，尚 慧1，聶先舟3，文景芝1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3.加拿大農(nóng)業(yè)部弗里得里克頓研究中心，新不倫瑞克 弗雷德里克頓 E3B 4Z7)

為明確不同馬鈴薯Y病毒(PVY)株系對(duì)馬鈴薯的影響及危害，采用PVYN:O、PVYN-Wi、PVYNTN-NW(SYRⅠ)和PVYNTN-NW(SYRⅡ)株系分離物人工侵染馬鈴薯，并通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察經(jīng)PVY侵染后馬鈴薯植株細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，敏感品種更適用于PVY病毒致病力鑒定，敏感品種‘克新13’和‘克新18’對(duì)PVY不同分離物的反應(yīng)強(qiáng)烈，差異顯著，而‘興加2號(hào)’對(duì)4個(gè)PVY分離株均表現(xiàn)耐病，雖然細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)葉綠體變形、單層膜小囊泡和典型的風(fēng)輪狀內(nèi)含體，但癥狀只表現(xiàn)為不同程度的花葉。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)PVYN-Wi致病力較弱，侵染后，4個(gè)馬鈴薯品種均出現(xiàn)花葉癥狀，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生多膜結(jié)構(gòu)、風(fēng)輪狀內(nèi)含體，引起敏感品種‘克新13’和‘克新18’細(xì)胞變形、葉綠體變形和髓鞘樣結(jié)構(gòu)；PVYNTN-NW致病力最強(qiáng)，感病的‘克新13’和‘克新18’植株受害癥狀明顯加重，且植株早衰、細(xì)胞破壞嚴(yán)重，有些死亡較快的植株甚至未產(chǎn)生特征性?xún)?nèi)含體結(jié)構(gòu)；PVYN:O致病力中等，植株受害癥狀和超微結(jié)構(gòu)變化也介于PVYN-Wi和 PVYNTN-NW之間。不同馬鈴薯品種對(duì)PVY病毒的感病程度有較大差異，‘興加2號(hào)’為耐病品種。

馬鈴薯Y病毒(PVY)；株系；馬鈴薯品種；超顯微結(jié)構(gòu)；癥狀

馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是馬鈴薯生產(chǎn)中最常見(jiàn)的一種馬鈴薯病害，染病馬鈴薯植株常出現(xiàn)品種退化、產(chǎn)量減少、品質(zhì)變差等癥狀。PVY與其他病毒復(fù)合侵染后，可致馬鈴薯最高減產(chǎn)80%，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。PVY屬于單鏈正義RNA病毒，其基因組長(zhǎng)約9.7 kb。侵染馬鈴薯的PVY病毒主要可分為PVYO、PVYC、PVYN、PVYZ和PVYE等5個(gè)株系[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PVYO、PVYN以及兩者重組衍生的新的株系侵染較為普遍[2]，而有關(guān)其他株系侵染的報(bào)道極少。目前，已報(bào)道的PVY重組株系有PVYN:O、PVYN-Wi、PVYNTN-NW，有學(xué)者對(duì)PVY有規(guī)律的重組變化細(xì)化歸類(lèi)為A、B和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ幾種類(lèi)型，本研究只選擇其中有代表性的PVYN:O、PVYN-Wi、PVYNTN-NW(SYRⅠ)和PVYNTN-NW(SYRⅡ)等株系的分離物進(jìn)行研究。

自然界中，對(duì)PVY免疫的馬鈴薯品種較少，抗PVY病毒的品種選育和應(yīng)用則較為普遍。受PVY侵染的馬鈴薯植株常表現(xiàn)出多種不同癥狀，如花葉、皺縮、壞死等，侵染嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株矮化或早衰，癥狀的差異是由于病毒對(duì)植物細(xì)胞功能的破壞產(chǎn)生的。目前，多采用透射電子顯微鏡技術(shù)進(jìn)行病原鑒定和病原致病力研究。自Kausche和Melcher首次通過(guò)電鏡觀(guān)察到煙草花葉病毒(TMV)以來(lái)，電鏡技術(shù)已成為植物病毒研究必不可少的常規(guī)手段之一[3]，Maramorosch和Franchi在其專(zhuān)著中通過(guò)照片的方式為廣大研究者提供病毒診斷的參照，從而使越來(lái)越多的植物病毒在不同植物中被發(fā)現(xiàn)，可以很清楚地觀(guān)測(cè)到病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。另外，病毒在寄主細(xì)胞中的狀態(tài)、寄主細(xì)胞的變化也同樣可以被直觀(guān)發(fā)現(xiàn)和記錄[4-5]。1996年，胡向武等[6]利用透射電子顯微鏡對(duì)受煙草花葉病毒侵染的煙草細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞中葉綠體發(fā)生腫脹、空泡化、片層結(jié)構(gòu)疏松、散失甚至外膜破碎等現(xiàn)象。2004年，彭晏輝等[7]利用透射電鏡技術(shù)對(duì)受PVY侵染的馬鈴薯葉綠體進(jìn)行研究，并以此分析侵染后對(duì)其植物光合作用的影響。

由于PVY為多株系，且分子遺傳多樣性豐富，PVY在基因水平上的差異與其致病能力有一定相關(guān)性，聶碧華[8]鑒定PVYO株系的2個(gè)分離株，在核酸和蛋白同源性分別為97.1%和98.5%的情況下，致病力表現(xiàn)出較大差異。本研究通過(guò)使用不同遺傳背景的PVY對(duì)4個(gè)品種的馬鈴薯進(jìn)行接種，并通過(guò)對(duì)侵染后的馬鈴薯細(xì)胞進(jìn)行超薄切片，然后用透射電鏡進(jìn)行分析，擬通過(guò)表觀(guān)癥狀與超微結(jié)構(gòu)下的表現(xiàn)相對(duì)照，找到不同PVY株系癥狀與超微結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的關(guān)系，同時(shí)通過(guò)病毒對(duì)馬鈴薯細(xì)胞的破壞規(guī)律找到不同株系PVY致病力差異，為PVY的研究及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘克新13’‘克新18’‘費(fèi)烏瑞它’和‘興加2號(hào)’4個(gè)馬鈴薯品種原原種均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)植物脫毒苗木研究所提供，種子大小均勻，質(zhì)量約10 g。接種采用的PVY毒源為遺傳背景不同的4個(gè)PVY不同株系的分離物：HLJ-BDH-2(PVYN-Wi)、IMN-2013-W-369-12[PVYNTN-NW(SYRⅡ)]、HLJ-30-2(PVYN:O)和HLJ-9-4[PVYNTN-NW(SYRⅠ)]，4個(gè)分離株的重組位點(diǎn)見(jiàn)圖1。

以上材料均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所保存并提供。

圖1 不同株系PVY基因結(jié)構(gòu)差異Fig.1 Genetic structure difference of different strains of PVY

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PVY病毒接種 每個(gè)品種的馬鈴薯均種植50株，共計(jì)200株，溫室保持20～26 ℃，每日光照14 h。當(dāng)馬鈴薯植株生長(zhǎng)至4～6葉期時(shí)，采用摩擦接種的方法將4個(gè)PVY分離物分別接種至馬鈴薯葉片，具體方法：將帶有病毒的植物葉片放于磷酸緩沖液(PB)研磨[m(攜病毒葉片)∶V(緩沖液)=1∶10]，研磨后2 000 r/min離心，上清液即為研究所用的病毒混合液。每株植物均使用約300 μL的病毒混合液，每株分別接種2片葉片，4個(gè)馬鈴薯品種均分別接種不同的PVY株系分離物，每處理3次重復(fù)。于接種后第1天即開(kāi)始，每天觀(guān)察癥狀并記錄。接種后的第3天、第6天、第9天和第12天分別取植株新生葉片檢測(cè)，以確定接種是否成功，檢測(cè)采用DAS-ELSIA的方法。

1.2.2 超薄切片樣品的采集及前固定 馬鈴薯接種24 d后，采集植株自上往下第4片完全展開(kāi)的葉片，并按電子顯微鏡樣品固定的要求裁剪樣品[9]，迅速放入含φ=3%戊二醛的固定液進(jìn)行固定。

1.2.3 超薄切片樣品的制備 將經(jīng)過(guò)前固定處理的樣品，用1 g/mL四氧化鋨固定液在室溫下固定3 h，再經(jīng)濃度梯度酒精及環(huán)氧丙烷等處理后，用820樹(shù)脂進(jìn)行包埋，并于37 ℃孵育4 h，70 ℃ 過(guò)夜聚合。聚合完成后，對(duì)包埋塊進(jìn)行切片，從而獲得可使用透射電子顯微鏡觀(guān)察的超薄切片(厚70 nm)，最后采用醋酸雙氧鈾飽和溶液及檸檬酸鉛2種溶液的雙染法對(duì)超薄切片進(jìn)行染色及觀(guān)察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種馬鈴薯植株受PVY侵染后癥狀差異

DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，各PVY株系分離物均能成功侵染4個(gè)馬鈴薯品種，并使其獲毒，且不同PVY分離物在馬鈴薯品種上表現(xiàn)的生理癥狀差異較大。其中，經(jīng)PVYN-Wi株系侵染的4個(gè)馬鈴薯品種表現(xiàn)的生理癥狀均較輕微，僅表現(xiàn)出花葉癥狀。SYRⅠ和SYRⅡ可致‘費(fèi)烏瑞它’‘克新13’和‘克新18’3個(gè)馬鈴薯品種產(chǎn)生花葉、主莖壞死、莖壞死和葉片黑色點(diǎn)斑等癥狀，且‘克新13’和‘克新18’植株受害癥狀更明顯，出現(xiàn)主莖壞死、葉片大面積黑色點(diǎn)斑、垂葉枯萎以及更快的發(fā)病速度等，甚至植株過(guò)早死亡。其中，SYRⅠ可導(dǎo)致‘克新13’產(chǎn)生花葉、主莖壞死、莖壞死和葉片黑色點(diǎn)斑等癥狀，卻不能致其過(guò)早死亡，但能使‘克新18’過(guò)早死亡；SYRⅡ可導(dǎo)致‘克新13’快速死亡(表1)。PVYN:O可導(dǎo)致‘克新13’‘克新18’及‘費(fèi)烏瑞它’植株主莖壞死、葉脈壞死，并使部分葉片出現(xiàn)黑色點(diǎn)斑，而‘克新13’于接種PVYN:O1個(gè)月后死亡，致病能力比PVYN-Wi強(qiáng)，但弱于PVYNTN-NW(表1，圖2)。

表1 接種不同PVY株系后馬鈴薯植株癥狀Table 1 Symptoms of different potato varieties inoculated with different strains of PVY

注：接種時(shí)間為2015-09-04。M.花葉；SSN.主莖壞死；VN.葉脈壞死；BSL.葉片黑色點(diǎn)斑；DPL.垂葉干枯；DP.植株死亡；PTNRD .薯塊環(huán)斑壞死。a.植株死亡時(shí)間為接種后30 d；b.植株死亡時(shí)間為接種后15 d；c 植株死亡時(shí)間為接種后25 d。

Note：Infect time is 2015-09-04.M.Mosaic; SSN.Stem streak necrosis; VN. Necrosis on leaves veins; BSL.Black spots on leaves; DPL.Dry and pendulous leaves; DP.Dead plants; PTNRD.Potato tuber necrotic ringspot disease.a.Time of plant death is 30 days after inoculated with virus; b.Time of plant dead is 15 days after inoculated with virus; c.Time of plant dead is 25 days after inoculated with virus.

A.接種PVYN:O后，‘克新13’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after ‘Kexin 13’ inoculated with PVYN:O；B.接種PVYN:O后，‘克新13’主莖壞死 Stem streak necrosis after ‘Kexin 13’ inoculated with PVYN:O；C.接種PVYNTN-NW(SYRⅠ)后，‘費(fèi)烏瑞它’葉片葉脈壞死 Veins necrosis after ‘Favorita’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；D.接種PVYNTN-NW(SYRⅡ)后，‘克新13’葉片出現(xiàn)黑色點(diǎn)斑 Black spots after ‘Kexin 13’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅡ) on leaves；E.接種PVYNTN-NW(SYRⅠ)后，‘克新18’植株葉片垂葉干枯 Dry and pendulous leaves after ‘Kexin 18’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；F.接種PVYNTN-NW(SYRⅡ)后，‘克新13’植株死亡 Plants was dead after ‘Kexin 13’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅡ)；G.接種PVYNTN-NW(SYRⅠ)后，‘克新18’薯塊產(chǎn)生環(huán)斑壞死 Potato tuber necrotic ringspot disease (PTNRD) in the tuber after ‘Kexin 18’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；H.未接種病毒的對(duì)照植株 Negative control that not inoculated with PVY

圖2接種PVY后馬鈴薯植株癥狀
Fig.2SymptomsofdifferentpotatovarietiesinoculatedwithdifferentstrainsofPVY

4個(gè)品種，‘中克新13’‘克新18’ 和‘費(fèi)烏瑞它’均較敏感，感染不同株系后發(fā)病癥狀差異明顯，致病力弱的癥狀溫和，致病力強(qiáng)的壞死嚴(yán)重，甚至植株死亡；而‘興加2號(hào)’耐病性較好，感染后僅出現(xiàn)花葉癥狀，不同PVY類(lèi)型造成的癥狀差異也僅是花葉輕重程度的差異。

2.2透射電子顯微鏡觀(guān)察受侵染植株細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異

PVY侵染后，馬鈴薯細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不同PVY株系病毒對(duì)不同馬鈴薯品種的細(xì)胞傷害有較大差異，這些差異體現(xiàn)在多個(gè)方面，不僅對(duì)植物細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)有影響，對(duì)各細(xì)胞器也有不同程度的破壞。其中，‘克新13’的細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)中，風(fēng)輪狀內(nèi)含體的數(shù)量較多，且細(xì)胞中表現(xiàn)較為明顯，這種現(xiàn)象在PVYN-Wi、PVYN:O、PVYNTN-NW(SYRⅠ)株系侵染后的馬鈴薯細(xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)。其他2個(gè)品種則與‘克新13’相反，相同研究條件下，受PVY侵染后，‘費(fèi)烏瑞它’植株細(xì)胞中幾乎未觀(guān)察到有產(chǎn)生風(fēng)輪狀內(nèi)含體的獨(dú)特標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。另外，在其他2個(gè)品種植株細(xì)胞中觀(guān)察到風(fēng)輪狀內(nèi)含體的數(shù)量則與侵染的PVY分離物有關(guān)， PVYNTN-NW(SYRⅡ)和PVYN-Wi會(huì)導(dǎo)致‘費(fèi)烏瑞它’和‘興加2號(hào)’植株細(xì)胞中出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，并較明顯，而其他品種則未在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有這種特異性結(jié)構(gòu)(表2和圖3)。

表2 接種不同PVY株系后馬鈴薯細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Table 2 Different symptoms of cellular ultrastructure after PVY infected with different strains of PVY

注：PW .風(fēng)輪狀內(nèi)含體；LIC.線(xiàn)狀內(nèi)含體；CD.細(xì)胞變形；ChD.葉綠體變形；ChDe.葉綠體裂解；MB.髓鞘樣結(jié)構(gòu)；M.多泡體結(jié)構(gòu)；PM.多膜結(jié)構(gòu)。

Note： PW.Pinwheels; LIC.Laminate inclusion components; CD.Cell deformation; ChD.Chloroplast deformation; ChDe.Chloroplast degradation; MB.Myeloid body; M.Multivesicular; PM.Proliferated membranes.

PVY病毒對(duì)馬鈴薯細(xì)胞的破壞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，會(huì)導(dǎo)致植株產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀，用來(lái)分析PVY對(duì)馬鈴薯植株的危害。研究發(fā)現(xiàn)，所有受PVY侵染的馬鈴薯植株均會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生或多或少、或大或小的改變。如在‘克新13’和‘克新18’中，無(wú)論受到何種PVY分離物侵染后，該品種的細(xì)胞均會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞變形(CD)、葉綠體變形(ChD)或多膜結(jié)構(gòu)(PM)。而當(dāng)‘克新13’受SYRⅡ侵染后，該品種的細(xì)胞變化更加明顯，葉綠體發(fā)生大面積的變形及裂解(ChDe)，同時(shí)，細(xì)胞中其他細(xì)胞器的形態(tài)也發(fā)生改變(如線(xiàn)粒體聚集、多泡體結(jié)構(gòu)、多膜結(jié)構(gòu)等)，說(shuō)明細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到破壞。與‘克新13’相似的是，在‘費(fèi)烏瑞它’和‘興加2號(hào)’植株細(xì)胞中，均可發(fā)現(xiàn)由PVY侵染引起的各種現(xiàn)象，如葉綠體變形、結(jié)構(gòu)被破壞、出現(xiàn)單層膜結(jié)構(gòu)小泡等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象或多或少的出現(xiàn)在各品種的馬鈴薯細(xì)胞中(表2)。

2.3 生理癥狀與超顯微結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

觀(guān)察馬鈴薯植株癥狀及其細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，植株表現(xiàn)出較嚴(yán)重的癥狀時(shí)，其細(xì)胞器的受害表現(xiàn)更為嚴(yán)重，有些細(xì)胞的細(xì)胞器甚至出現(xiàn)破裂、消融、不完整，且細(xì)胞形態(tài)不正常，并且在部分馬鈴薯細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較多的風(fēng)輪狀內(nèi)含體、線(xiàn)狀內(nèi)含體等，這是僅有在PVY病毒侵染后才能發(fā)現(xiàn)的特異性結(jié)構(gòu)；當(dāng)植株受害癥狀表現(xiàn)較輕微時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)均較為完整，同時(shí)，很少在這些馬鈴薯細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體、線(xiàn)狀內(nèi)含體等標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。‘克新13’‘克新18’和‘費(fèi)烏瑞它’對(duì)PVYN:O、PVYNTN-NW(SYR I)、PVYNTN-NW(SYRⅡ)3個(gè)株系的侵染表現(xiàn)較敏感，受害后植株發(fā)病嚴(yán)重。觀(guān)察它們對(duì)應(yīng)的細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)僅在PVYN:O和PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染‘克新13’，PVYNTN-NW(SYRⅡ)侵染‘克新18’和‘費(fèi)烏瑞它’ 的植株細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體(圖4)，而不是所有樣品中均能觀(guān)察到風(fēng)輪狀內(nèi)含體等較為明顯的特征結(jié)構(gòu)(表2)。經(jīng)4個(gè)不同PVY株系侵染后，‘興加2號(hào)’植株均未表現(xiàn)出明顯的生理癥狀，而僅出現(xiàn)花葉。觀(guān)察‘興加2號(hào)’細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)，也未發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞器受到較嚴(yán)重的破壞，同時(shí)僅在受PVYN-Wi侵染的植株細(xì)胞中觀(guān)察到風(fēng)輪狀內(nèi)含體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明植株癥狀表現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)觀(guān)察結(jié)果密切相關(guān)。

A.PVYN-Wi侵染后，‘克新13’產(chǎn)生風(fēng)輪狀內(nèi)含體，×20 000 After being infected by PVYN-Wi,‘Kexin 13’ was found to be with pinwheel inclusion in leaf cells,×20 000；B.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘克新13’細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，×5 000 Cellular morphology of ‘Kexin 13’ after being infected by PVYNTN-NW,×5 000；C.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘克新13’葉綠體變形并裂解，×30 000 Cellular chloroplast morphology changes and lysis of ‘Kexin 13’ after being infected by PVYNTN-NW(SYRⅠ),×30 000；D.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘興加2號(hào)’細(xì)胞內(nèi)的髓鞘樣結(jié)構(gòu)，×20 000 After being infected by PVYNTN-NW,‘Xingjia 2’ was found to be with myeloid body inclusion in leaf cells,×20 000；E.PVYN-Wi侵染后，‘克新13’及‘費(fèi)烏瑞它’細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多膜結(jié)構(gòu)，×40 000 After being infected by PVYN-Wi,cells of ‘Kexin 13’ and ‘Favorita’ have multi-film structure,×40 000,；F. PVYN-Wi侵染后，‘克新13’及‘費(fèi)烏瑞它’細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多膜結(jié)構(gòu)，×30 000 After being infected by PVYN-Wi,cells of Kexin 13 and Favorita have multi-film structure,×30 000；G,I.未接種PVY的正常馬鈴薯植株細(xì)胞結(jié)構(gòu)，×25 000 The negative control that did not inoculated with PVY,×25 000；H.未接種PVY的正常馬鈴薯植株細(xì)胞結(jié)構(gòu)，×5 000 The negative control that did not inoculated with PVY,×5 000

圖3PVY侵染后馬鈴薯植株細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)
Fig.3PerformanceofmicrostructurewithdifferentpotatovarietiesinoculatedwithdifferentstrainsofPVY

3 討 論

PVY作為最常見(jiàn)的馬鈴薯病毒病，受到高度關(guān)注。大多數(shù)研究者通過(guò)觀(guān)察寄主植物受病原侵染后產(chǎn)生的癥狀及相應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，從而判斷馬鈴薯植株受病原侵害的情況。如Ali等[10]利用薯塊癥狀及對(duì)PVY全序列測(cè)序，確定新的PVY株系，Nie[11]利用多種方式測(cè)試PVY的侵染途徑，并通過(guò)癥狀判斷及血清學(xué)檢測(cè)確定PVY的侵染方式為機(jī)械摩擦傳播。目前，采用電子顯微鏡技術(shù)研究PVY病毒的文獻(xiàn)較少[11]。徐玲等[12]觀(guān)察經(jīng)煙草假單胞桿菌侵染的煙草細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)侵染后植株細(xì)胞葉綠體破壞嚴(yán)重，接種2 d后甚至出現(xiàn)葉綠體完全裂解的現(xiàn)象。另外，在接種后期，細(xì)胞中大量的細(xì)胞器也發(fā)生解體，甚至細(xì)胞僅留有空腔。劉國(guó)順等[13]采用電子顯微鏡等技術(shù)進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)花葉病毒侵染后的煙草植株及葉片細(xì)胞的保護(hù)酶活性及細(xì)胞中細(xì)胞器發(fā)生變化，電鏡技術(shù)為病理研究提供一條直觀(guān)的路徑。

A.PVYN:O侵染后，‘克新13’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after ‘Kexin 13’ inoculated with PVYN:O；B.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘克新18’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after ‘Kexin 18’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；C.PVYNTN-NW(SYRⅡ)侵染后，‘費(fèi)烏瑞它’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after Favorita inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅡ)；D.PVYN-Wi侵染后，‘興加2號(hào)’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after ‘Xingjia 2’ inoculated with PVYN-Wi；E.PVYN:O侵染后，‘克新13’主莖壞死 Stem streak necrosis after‘ Kexin 13’ inoculated with PVYN:O；F.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘克新18’主莖壞死、垂葉干枯 Stem streak necrosis and dry and pendulous leaves after ‘Kexin 18’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；G.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘費(fèi)烏瑞它’葉片葉脈壞死 Veins necrosis after ‘Favorita’ inoculated with PVYNTN-NW(SYRⅠ)；H.PVYN:O侵染后，‘興加2號(hào)’葉片出現(xiàn)花葉 Mosaic after ‘Xingjia 2’ inoculated with PVYN:O；I.PVYN:O侵染后，‘克新13’葉片細(xì)胞出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，×30 000 After infected by PVYN:O,‘Kexin 13’ was found to be with pinwheel inclusion in leaf cells,×30 000；J.PVYNTN-NW(SYRⅡ)侵染后，‘克新18’葉片細(xì)胞出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，×30 000 After infected by PVYNTN-NW(SYRⅡ),‘Kexin 18’ was found to be with pinwheel inclusion in leaf cells,×30 000；K.PVYNTN-NW(SYRⅡ)侵染后，‘費(fèi)烏瑞它’葉片細(xì)胞出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，×30 000 After infected by PVYNTN-NW(SYRⅡ),‘Favorita’ was found to be with pinwheel inclusion in leaf cells,×30 000；L.PVYN-Wi侵染后，‘興加2號(hào)’細(xì)胞出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，×25 000 After infected by PVYN-Wi,‘Xingjia 2’ was found to be with pinwheel inclusion in leaf cells,×25 000；M.PVYN:O侵染后，‘克新13’細(xì)胞形態(tài)，×3 000 Cellular morphology of ‘Kexin 13’ after infected by PVYN:O,×3 000；N.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘克新18’細(xì)胞出現(xiàn)多膜結(jié)構(gòu)，×15 000 After infected by PVYNTN-NW(SYRⅠ),cells of ‘Kexin 18’ have multi-film structure,×15 000；O.PVYNTN-NW(SYRⅠ)侵染后，‘費(fèi)烏瑞它’細(xì)胞葉綠體形態(tài)發(fā)生改變，×25 000 Change of cellular chloroplast morphology in ‘Favorita’ infected by PVYNTN-NW(SYRⅠ),×25 000；P.PVYN:O侵染后，‘興加2號(hào)’細(xì)內(nèi)葉綠體形態(tài)改變，×25 000 Cellular chloroplast morphology changes in ‘Xingjia 2’ infected by PVYN:O,×25 000

圖4不同品種馬鈴薯接種后癥狀及超微結(jié)構(gòu)差異
Fig.4DifferencesamongdifferentpotatovarietiesinoculatedwithdifferentstrainsofPVY

本研究通過(guò)觀(guān)察不同株系PVY侵染后馬鈴薯植株癥狀及超顯微結(jié)構(gòu)的差異，從而掌握不同株系PVY對(duì)馬鈴薯品種的危害。結(jié)果顯示，經(jīng)SYRⅡ株系侵染后，‘克新13’植株受害癥狀表現(xiàn)最為明顯，整株植株提前死亡。通過(guò)透射電鏡觀(guān)察‘克新13’細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該植株細(xì)胞的葉綠體變形，且裂解程度明顯較其他品種及株系侵染后要嚴(yán)重，這可能是導(dǎo)致該品種提前死亡的原因之一。彭晏輝等[7]研究認(rèn)為，經(jīng)PVY侵染后，馬鈴薯細(xì)胞的葉綠體會(huì)出現(xiàn)過(guò)早成熟和早衰，進(jìn)而導(dǎo)致植株光合作用能力下降；郭興啟等[14]利用PVY侵染煙草以研究PVY與其他病毒的協(xié)生作用，發(fā)現(xiàn)PVYN株系單獨(dú)侵染后會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞中出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，而受損的細(xì)胞還會(huì)出現(xiàn)葉綠體嚴(yán)重?fù)p傷、髓鞘樣結(jié)構(gòu)、多膜結(jié)構(gòu)等明顯特征。本研究中，在經(jīng)不同PVY株系侵染的馬鈴薯植株中也觀(guān)察到與上述研究相同的現(xiàn)象；但不同的是，并不是在所有的植株細(xì)胞中均能發(fā)現(xiàn)這種受PVY侵染后的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)——風(fēng)輪狀內(nèi)含體，這可能是由于不同品種的抗PVY能力有差異；同時(shí)，不同遺傳背景的PVY分離物的致病能力也有差異，不同PVY病毒分離物與不同馬鈴薯品種的發(fā)病的速度、癥狀與細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化建立某種聯(lián)系。

本研究中，未出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體結(jié)構(gòu)的樣品主要有‘克新13’，其僅在接種SYRⅡ時(shí)，發(fā)病迅速，出現(xiàn)細(xì)胞器裂解、細(xì)胞膜破裂等現(xiàn)象，植株快速死亡，這是因?yàn)榻臃N的時(shí)期為苗期，植株抗性較弱，反應(yīng)比較強(qiáng)烈。在其他品種中，植株表現(xiàn)出不同的發(fā)病程度，細(xì)胞中出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體、多泡(多膜)結(jié)構(gòu)和髓鞘狀結(jié)構(gòu)。尤其是‘興加2號(hào)’，植株長(zhǎng)勢(shì)正常，癥狀輕微，細(xì)胞破壞也比其他品種輕微。內(nèi)含體和多膜、多泡狀結(jié)構(gòu)的形成很可能是對(duì)PVY病毒抗性的一種反映，這一系列變化過(guò)程，可能將病毒毒力部分化解、轉(zhuǎn)移，使病毒的致病力弱化，也是細(xì)胞內(nèi)病毒與細(xì)胞防御體系斗爭(zhēng)的結(jié)果。接種SYRⅡ的‘克新13’則是由于病毒對(duì)細(xì)胞的危害巨大，導(dǎo)致其細(xì)胞迅速衰亡，細(xì)胞內(nèi)尚未產(chǎn)生有效的防御反應(yīng)；植株只表現(xiàn)受害癥狀而未死亡的，是因?yàn)榧?xì)胞正常代謝雖受到影響，但尚能維持病毒破壞與光合作用的平衡。

本研究通過(guò)對(duì)不同馬鈴薯品種及不同PVY株系的病毒癥狀和超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，很好地揭示品種抗性的原因，發(fā)現(xiàn)在不同PVY株系作用下，馬鈴薯植株的表觀(guān)癥狀與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)間有密切聯(lián)系。且發(fā)現(xiàn)所研究的4個(gè)品種有明顯的抗性異， ‘克新13’在苗期高感PVY，在其他資料里‘克新13’均表現(xiàn)為PVY田間過(guò)敏抗性[15]，‘克新18’和‘費(fèi)烏瑞它’也表現(xiàn)為感病品種，而‘興加2號(hào)’表現(xiàn)出顯著的耐病性。該結(jié)果為進(jìn)一步研究PVY致病機(jī)理提供有關(guān)病毒與寄主互作的細(xì)胞病理學(xué)資料，并為PVY的防治及鑒定提供一定的生物學(xué)及影像學(xué)參考。

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CorrespondingauthorWEN Jingzhi,female,professor,doctoral supervisor.Research area:plant pathology.E-mail: jzhwen2000@163.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)

PathogenicityofPotatoVirusYStrainsinDifferentPotatoVarieties

BAI Yanju1,2,HAN Shuxin1,GAO Yanling1,2,ZHANG Wei1,2, FAN Guoquan2,QIU Cailing2,SHEN Yu2,ZHANG Shu2, SHANG Hui1,NIE Xianzhou3and WEN Jingzhi1

(1.College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Virus-free Seeding Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China; 3.Fredericton Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada,Fredericton,New Brunswick E3B 4Z7)

Potato virus Y (PVY) is one of the most common and worldwide destructive viruses that affects potato production.To unveil the effects and the pathogenicity of different strains of PVY in different potato varieties,four natural recombinant PVY strains including PVYN:O,PVYN-Wi,PVYNTN-NW(SYR-Ⅰ) and PVYNTN-NW(SYR-Ⅱ) were mechanically inoculated onto four potato varieties.In addition to the visual foliar and tuber symptom observations,the ultrastructure and cellular morphology changes were also monitored by electron microscopy.Generally,PVYN-Wicaused mild symptoms (mainly mosaic) on all varieties,whereas the remaining strains caused severe foliar and/or tuber symptoms.The variety ‘Xingjia 2’ exhibited mild foliar symptoms compared with other varieties especially ‘Kexin 13’ and ‘Kexin 18’ upon infection with different strains of PVY.Interestingly,in spite of the fact that PVYN-Wionly caused mild symptoms in all varieties,it induced cellular morphological in varying-degrees and changed ranging from pinwheel formation in ‘Xingjia 2’ to pinwheel formation,chloroplast degradation,membrane proliferation and cell deformation in ‘Kexin 18’.The pathogenicity of PVYNTN-NW(SYR-Ⅰ and SYR-Ⅱ) was the strongest in the tested strains,which not only caused serve foliar symptoms in ‘Kexin 13’,‘Kexin 18’ and ‘Favorita’,but also incited necrotic ringspots in tubers of at least two varieties (i.e.,‘Kexin 13’ and ‘Xingjia 2’).The pathogenicity of PVYN:Ofalled between PVYN-Wiand PVYNTN-NW,and it caused intermediate level of symptoms in plants and intermediate degree of changes in ultrastructure.This study illuminated the interactions between different PVY strains and different potato varieties in both whole-plant and ultrastructural levels,thus this provided insights for better management of this destructive virus in potato crops.

Potato virus Y (PVY); Potato varieties; Strains; Symptoms; Ultrastructure

2017-01-18

2017-04-06

Modern Agriculture Potato Industry Technology System(No.CARS-10-P14).

BAI Yanju,female,research fellow,doctoral student.Research area:plant pathology.E-mail: yanjubai@163.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.036.html

2017-01-18

2017-04-06

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-10-P14)。

白艷菊，女，研究員，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±?。E-mail:yanjubai@163.com

文景芝，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊±?。E-mail:jzhwen2000@163.com

S435.32

A

1004-1389(2017)11-1713-08