5個紅色釀酒葡萄品種花色苷組成差異分析

楊曉慧，陳為凱，何 非，王 軍

(中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083)

5個紅色釀酒葡萄品種花色苷組成差異分析

楊曉慧，陳為凱，何 非，王 軍

(中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083)

以5個紅色釀酒葡萄品種(‘美樂’‘赤霞珠’‘馬爾貝克’‘小味爾多’‘馬瑟蘭’)為材料，利用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)檢測各品種成熟期果皮的花色苷，并利用主成分分析方法對5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成進行差異分析。結(jié)果表明，‘美樂’的甲基花青素類花色苷的所有比例較高，‘赤霞珠’中的花翠素類和未酰化類花色苷的所有比例最高，‘馬爾貝克’的特征花色苷是花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷和甲基花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷，‘小味爾多’含有較高的甲基花翠素類和花翠素-3-乙酰葡萄糖苷。另外，‘馬瑟蘭’含有較高的香豆酰類花色苷，尤其是二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷，且未檢測到花青素類花色苷。

高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)；釀酒葡萄；主成分分析

花色苷是一類水溶性色素，屬于類黃酮的一個亞類，具有C6-C3-C6骨架的類黃酮花色素和配糖體組成的糖苷[1]，并廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中。此外，由于B環(huán)羥基或者甲氧基取代基團的位置和數(shù)量不同，各類花色苷會呈現(xiàn)不同色調(diào)[2]，這對葡萄和葡萄酒的顏色起到至關(guān)重要的作用[3-4]。在葡萄成熟期，紅葡萄果實中花色苷的積累主要發(fā)生在果皮中，主要有二甲花翠素、甲基花翠素、甲基花青素、花翠素和花青素類花色苷。不同葡萄品種之間花色苷的組成存在顯著差異[5-7]。González-Neves等[6]利用HPLC-MS法分析‘丹那’、‘赤霞珠’和‘美樂’葡萄果皮中花色苷組成，結(jié)果表明‘丹那’葡萄果皮中的花翠素類、甲基花翠素類和未?；惢ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤@著高于‘赤霞珠’和‘美樂’，‘赤霞珠’葡萄果皮中的二甲花翠素類和乙?；惢ㄉ照伎偦ㄉ盏谋壤@著高于‘丹那’和‘美樂’，‘美樂’葡萄果皮中的甲基花青素類和香豆酰類花色苷占總花色苷的比例顯著高于‘丹那’和‘赤霞珠’。Liang等[7]研究歐亞種、歐美雜種、美洲葡萄、山歐雜種、燕山葡萄以及美洲葡萄不同種間的雜交種在內(nèi)的共110個葡萄品種的花色苷，發(fā)現(xiàn)不同種類葡萄果皮中花色苷的組分和含量顯著不同，其中歐亞種葡萄(Vitis.vinifera)一般只含有單葡萄糖苷，美洲葡萄(V.labrusca)和山葡萄(V.armurensis)果皮中既含有單葡萄糖苷又含有雙葡萄糖苷，并且一般雙葡萄糖苷含量較多。

許多研究認為，遺傳因素是決定葡萄品種花色苷組成的決定性因素且不受環(huán)境因素的影響[8-11]。也有研究表明通過疏穗處理可提高葡萄果實中花青素-3-葡萄糖苷和甲基花青素-3-葡萄糖苷占總花色苷的比例且未影響到二甲花翠素-3-葡萄糖苷和乙酰化類花色苷占總花色苷的比例[12]。Downey等[13]對‘西拉’葡萄果穗進行遮光處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遮光處理的葡萄果實中的3，4-羥基取代花色苷占總花色苷的比例較正常曝光組高。以上表明，環(huán)境因素和管理方式也可能影響葡萄果實中花色苷的組成，所以葡萄果實中的花色苷組成需要在不同地方進行評價。

本研究以北京市海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站智能溫室2013年定植的5個紅色釀酒葡萄品種(‘美樂’‘赤霞珠’‘馬爾貝克’‘小味爾多’‘馬瑟蘭’)為材料，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)方法檢測5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成，通過主成分分析對5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成進行差異分析，以期為國內(nèi)有針對性的種植葡萄品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試葡萄果實于2015年秋季采自中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站智能溫室，品種分別為‘美樂’‘赤霞珠’‘馬爾貝克’‘小味爾多’‘馬瑟蘭’。于2013年定植，自根苗，栽植行穴距為4 m×1 m，整枝為高干(2.2 m)龍干形，水平葉幕，每穴2株，2株葡萄的龍干分別垂直于行向反向向行間延伸，每株保留20～24個新梢，每個新梢上平均保留2穗果實。

在葡萄果實成熟期進行采樣，每個品種重復(fù)3次，每次重復(fù)隨機取樣100粒漿果。樣品采集后放入冰盒帶回實驗室。剝?nèi)」?，將果皮放入液氮中速凍，然后用研缽研成粉末，放入真空冷凍干燥機中-40 ℃下冷凍干燥24 h,干燥后的葡萄果皮粉保存在-40 ℃冰箱內(nèi)，備用。

分析純無水甲醇與甲酸購自北京化工廠，色譜純乙腈、甲酸、甲醇試劑購于Fisher(美國)，二甲花翠素-3-葡萄糖苷標準品購自Sigma-Aldrich(美國)。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

GL-20G-Ⅱ離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FD-1C-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；Agilent 1100系列LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent)。

1.3 試驗方法

1.3.1 果皮花色苷的提取 果皮中花色苷提取方法參照He等[14]的方法：準確稱取0.500 g葡萄果皮凍干粉于50 mL離心管，加入10 mLφ=2%甲酸的甲醇溶液，20 ℃避光超聲提取10 min，20 ℃ 130 r/min避光搖床震蕩后，于8 000 r/min離心10 min，然后轉(zhuǎn)移上清液至100 mL圓底燒瓶中，如此重復(fù)提取5次，合并上清液。28 ℃條件下于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用花色苷定溶劑(φ=2%甲酸，φ=10.8%乙腈)定容至10 mL后于-80 ℃冰箱保存，以備上機檢測。

1.3.2 果皮花色苷的定性和定量 花色苷物質(zhì)檢測采用Agilent 1100系列LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有二極管陣列檢測器(DAD)進行樣品的定性和定量分析。色譜柱為Kromasil100-5 C18 (250 mm×4.6 mm)，柱溫50 ℃，0.22 μm水系膜過濾，進樣量為30 μL，檢測波長為525 nm，流速為1 mL/min。流動相A(體積比)：水∶甲酸∶乙腈=92∶2∶6；流動相B(體積比)：水∶甲酸∶乙腈=44∶2∶54。洗脫程序：0～1 min，0～10% B；1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子掃描范圍為100～1 500m/z；霧化器壓力為207 KPa；干燥器流速為10 L/min；干燥氣溫度為325 ℃。每個樣品重復(fù)進樣2次。

花色苷的定性根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點實驗室建立的葡萄花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫?；ㄉ斩恳远谆ù渌?3-葡萄糖苷為外標物做標準曲線，檢測出花色苷類物質(zhì)均以二甲花翠素-3-葡萄糖苷的相對質(zhì)量分數(shù)計。標準曲線：Y=56.938X+90.206，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。果皮中的花色苷質(zhì)量分數(shù)的單位為mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件(美國)中的Duncan’s單因素分析對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析,顯著性水平5%。主成分分析由代謝組學數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站http://www.metaboanalyst.ca/完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷的組分和質(zhì)量分數(shù)

如表1所示，成熟期5個紅色釀酒葡萄品種共檢測到17種花色苷。‘美樂’和‘小味爾多’分別檢測到17和15種花色苷，‘赤霞珠’和‘馬爾貝克’共檢測到16種花色苷且均未檢測到甲基花青素-3-順式香豆酰葡萄糖苷，‘馬瑟蘭’檢測到的花色苷僅有14種且未檢測到花青素類花色苷。這5個紅色釀酒葡萄品種檢測到的總花色苷質(zhì)量分數(shù)為277.33～1 380.93 mg/kg，其中‘馬爾貝克’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)最高，并顯著高于Fanzone等[15]的研究結(jié)果?！R爾貝克’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)是‘赤霞珠’的2.6倍，‘小味爾多’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)是‘赤霞珠’的2.1倍。另外‘美樂’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)遠小于‘赤霞珠’，這與文獻[16-17]報道一致。‘馬瑟蘭’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)與‘赤霞珠’之間無顯著差異，但是‘馬瑟蘭’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)較‘赤霞珠’高出12.7%，這與艾麗麗等[18]研究的結(jié)果相似。與之相反，李琪等[19]研究結(jié)果表明，‘馬瑟蘭’的總花色苷質(zhì)量分數(shù)較‘赤霞珠’高49.97%，這可能與葡萄栽植地的土壤和氣候條件有關(guān)。

表1 5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷質(zhì)量分數(shù)Table 1 Anthocyanin mass fraction of five red winegrape varieties mg/kg

注：“-”代表未檢測到。同列不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)。下同。

Note：“-”Not detected.Different lowercase letters within the same column mean significant differences (Plt;0.05). The same below.

2.2 花色苷的組成

5個紅色釀酒葡萄品種花色苷所占的比例如表2所示。對于這5個紅色釀酒葡萄品種的未?；惢ㄉ諄碚f，花青素-3-葡萄糖苷所占的比例最低，二甲花翠素-3-葡萄糖苷所占的比例最高，這與文獻報道一致[20-21]?！罉贰汀嘞贾椤幕ㄇ嗨?3-葡萄糖苷所占的比例顯著高于其他品種，且二者間無顯著差異。而Dimitrovska等[21]研究結(jié)果顯示，‘美樂’的花青素-3-葡萄糖苷所占的比例約是‘赤霞珠’的3倍，這為環(huán)境因素影響花色苷的組成提供依據(jù)?！嘞贾椤亩谆ù渌?3-葡萄糖苷所占的比例最高，為33.84%，這與文獻報道一致[21]?！罉贰c‘馬瑟蘭’的二甲花翠素-3-葡萄糖苷所占的比例較低，且二者間無顯著差異。除二甲花翠素-3-葡萄糖苷之外，‘馬瑟蘭’的其余4種未?；惢ㄉ账急壤∮?%。對于‘美樂’‘赤霞珠’‘馬爾貝克’和‘小味爾多’來說，甲基花翠素-3-葡萄糖苷所占的比例相差不大(2.17%～3.89%)，甲基花青素-3-葡萄糖苷所占的比例在這5個品種之間存在顯著性差異?！罉贰募谆ㄇ嗨?3-葡萄糖苷的所占比例顯著高于其余4個品種，可以認為‘美樂’是甲基花青素-3-葡萄糖苷所占比例較高的品種，這與Ortega-Regules等[16]結(jié)果一致。對于花翠素-3-葡萄糖苷來說，5個葡萄品種所占比例大小順序是‘赤霞珠’gt;‘小味爾多’gt;‘馬爾貝克’gt;‘美樂’gt;‘馬瑟蘭’。

表2 5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成Table 2 Anthocyanin profiles of five red winegrape varieties %

對于這5個紅色釀酒葡萄品種的乙?；惢ㄉ諄碚f，花青素-3-乙酰葡萄糖苷所占比例最小，二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷所占比例最高，這與文獻報道一致[16, 21]?！嘞贾椤亩谆ù渌?3-乙酰葡萄糖苷所占比例是二甲花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷(Mvcp+Mvtp：9.51%)的3倍。與之相反，‘馬爾貝克’的二甲花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷所占比例(37.04%)大約是二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷的3.4倍。然而Fanzone等[15]結(jié)果表明，‘馬爾貝克’的二甲花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷所占比例與二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷近似相等，這可能與土壤和氣候條件有關(guān)。二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷是最主要的香豆?；惢ㄉ?，其次是甲基花青素-3-反式香豆酰葡萄糖苷。‘赤霞珠’的二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷所占比例顯著低于其他品種，此外‘馬瑟蘭’和‘馬爾貝克’的二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷所占比例較高。因此‘馬瑟蘭’和‘馬爾貝克’可以認為是二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷所占比例較高的品種。

用不同分類方式對花色苷進行分類，結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)合表2和表3看出，‘馬瑟蘭’未檢測到花青素類花色苷。對于這5個紅色釀酒葡萄品種而言，二甲花翠素類花色苷的所占比例最高，可能因為它是花色苷合成過程的終端化合物[21]，另外，5個紅色釀酒葡萄品種的二甲花翠素類花色苷所占比例之間存在顯著性差異并且‘馬瑟蘭’的二甲花翠素類花色苷所占比例最高。5個紅色釀酒葡萄品種的花青素類花色苷所占比例均最低，一些研究者認為，這是因為它是其他花色苷合成的前體物質(zhì)[22]?！罉贰汀嘞贾椤幕ㄇ嗨仡惢ㄉ账急壤@著高于‘馬爾貝克’和‘小味爾多’，可以利用花青素類花色苷所占比例將這5個品種分為兩類。值得注意的是，‘美樂’含有較高的甲基花青素類花色苷，可以認為它是‘美樂’的特征花色苷，這與文獻報道一致[6]。

表3 5個紅色釀酒葡萄品種不同花色素類花色苷所占的比例Table 3 The proportion of different types of anthocyanin hydroxylation in five red winegrap varieties %

不同?；幕ㄉ账急壤绫?所示?！嘞贾椤歹；惢ㄉ账急壤罡?，是‘馬瑟蘭’的1.6倍。而‘赤霞珠’中的香豆?；惢ㄉ账急壤畹?，大約是‘馬瑟蘭’的28.3%，‘馬爾貝克’的26.4%，‘小味爾多’的49.4%。另外，‘美樂’的香豆?；惢ㄉ账急壤@著高于有關(guān)報道[16]，這為環(huán)境因素影響酰化花色苷的組成提供依據(jù)。對于乙?；惢ㄉ眨嘞贾椤急壤罡?，這與文獻報道一致[23-24]，其次是‘小味爾多’。另外，‘美樂’‘赤霞珠’和‘馬爾貝克’的乙酰化類花色苷所占比例存在極顯著的差異，這驗證了乙?；惢ㄉ湛梢詤^(qū)分葡萄品種的推測[21]。值得注意的是，對于‘美樂’，乙?；惡拖愣辊；惢ㄉ账急壤葡嗟龋∥稜柖唷奈歹；鸵阴；惢ㄉ账急壤葡嗟?。

2.3 5個紅色釀酒葡萄品種花色苷的主成分分析

為了進一步分析5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成，本研究對它們的花色苷所占比例進行主成分分析(圖1)。由主成分分析散點圖(圖1-A)可以看出，主成分1(PC1)解釋總方差的39.6%，主成分2(PC2)解釋總方差的35.9%。它們共同解釋總方差的75.5%，可以用于解釋變量的總體變化情況。主成分1將這5個品種分為兩大類，一類是‘馬瑟蘭’和‘馬爾貝克’，另一類是‘美樂’‘赤霞珠’和‘小味爾多’。主成分 2 又進一步將這5個品種分在四個象限，‘小味爾多’與‘赤霞珠’均在第三象限，但是‘小味爾多’緊鄰著主成分2的負坐標軸。以上結(jié)果說明，主成分1和主成分2能將這5個品種明顯地區(qū)分開。

表4 5個紅色釀酒葡萄品種不同?；绞交ㄉ盏乃急壤齌able 4 The proportion of different types of antho cyanin acylation in five red winegrape varieties %

圖1 5個紅色釀酒葡萄品種花色苷的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of anthocyanin five red winegrape varieties

主成分分析的散點圖(圖1-A)和載荷圖(圖1-B)反映葡萄品種與各類花色苷的對應(yīng)關(guān)系。香豆?；惢ㄉ瘴挥贚oading1正半軸，結(jié)合主成分分析散點圖說明，‘馬瑟蘭’的香豆酰化類花色苷所占比例較高，尤其是二甲花翠素-3-反式香豆酰葡萄糖苷。除甲基花青素-3-順式香豆酰葡萄糖苷外，其余的甲基花青素類花色苷都位于第二象限，結(jié)合圖1-A，說明甲基花青素類花色苷是‘美樂’的特征花色苷。除花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷外，花翠素類花色苷和未酰化類花色苷均位于第三象限，結(jié)合主成分分析散點圖，說明‘赤霞珠’的花翠素類和未?；惢ㄉ盏乃急壤^高，尤其是花翠素-3-葡萄糖苷。花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷和甲基花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷位于第四象限，結(jié)合圖1-A，說明‘馬爾貝克’的花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷和甲基花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷所占比例較高。載荷圖(圖1-B)中甲基花翠素類、花翠素-3-乙酰葡萄糖苷靠近Loading2的負半軸，結(jié)合圖1-A說明，‘小味爾多’的甲基花翠素類、花翠素-3-乙酰葡萄糖苷所占比例較高。

3 結(jié) 論

本研究以北京市海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站智能溫室2013年定植的5個紅色釀酒葡萄品種(‘美樂’‘赤霞珠’‘馬爾貝克’‘小味爾多’‘馬瑟蘭’)為材料，分析成熟時期果皮的花色苷組成，共檢測到17種花色苷。‘馬瑟蘭’果皮中含有較高的香豆酰類花色苷且未檢測到花青素類花色苷。‘美樂’的特征花色苷是甲基花青素類花色苷，‘赤霞珠’的花翠素類和未酰化類花色苷所占比例最高。對于‘馬爾貝克’來說，其果皮中的花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷和甲基花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷所占比例最高?！∥稜柖唷募谆ù渌仡?、花翠素-3-乙酰葡萄糖苷所占比例較高。5個紅色釀酒葡萄品種的花色苷組成差異較大，該研究結(jié)果為國內(nèi)有針對性地種植葡萄品種提供參考。

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CorrespondingauthorWANG Jun, male, Ph.D,professor.Research area: grapes resources evaluation and appraisal, nursery stock production. E-mail:jun_wang@cau.edu.cn

(責任編輯：史亞歌Responsibleeditor:SHIYage)

VarietalDifferentiationofFiveVitisviniferaRedWinegrapesBasedonTheirAnthocyanicComposition

YANG Xiaohui, CHEN Weikai, HE Fei and WANG Jun

(Center for Viticulture and Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The presence of anthocyanins in fiveVitisviniferared winegrapes taken from intelligent greenhouse in Shangzhuang experimental vine yards of China Agricultural University was investigated by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) at technological stage of ripening. Meanwhile,anthocyanic composition of five varieties were classified by a principal component analysis (PCA). Merlot had higher percentage of peonidins; Cabernet Sauvignon had the highest percentage of delphinidins and nonacylated anthocyanins; Malbec had higher percentage of delphinidin- and petunidin-3-O-coumarylglucoside; Petit Verdot had higher percentage of petunidins and delphinidin-3-O-acetylglucoside. In addition, Marselan had the higher percentage of coumaroyl anthocyanins, especially malvidin-3-O-(6-O-trans-p-coumaryl) glucoside and cyanidins was not detected.

High-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS); Vitis vinifera winegrape;Principal component analysis

2016-08-02

2016-10-25

Special Fund for Constructing National Technology System of Modern Agricultural Industry(No.CARS-30).

YANG Xiaohui, female, master student. Research area: grape cultivation, grapes phenolics metabolism. E-mail:yangxiaohui1128@163.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.022.html

2016-08-02

2016-10-25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-30)。

楊曉慧，女，碩士研究生，研究方向為葡萄栽培及葡萄果實酚類物質(zhì)的代謝。E-mail:yangxiaohui1128@163.com

王 軍，男，博士，教授，研究方向為葡萄資源評價與鑒定及葡萄苗木生產(chǎn)。E-mail:jun_wang@cau.edu.cn

S323

A

1004-1389(2017)11-1648-07