雌二醇激素對大鼠生理功能的影響

劉傳志，張莉，劉振瑤，李曉，宮平

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

雌二醇激素對大鼠生理功能的影響

劉傳志，張莉，劉振瑤，李曉，宮平

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

雌二醇激素是人體重要的性激素之一，如果其在機體代謝異常，會造成內(nèi)分泌紊亂，局部水腫，激素累積，受孕率低，甚至引起高血壓及肝功能病變。探究雌二醇激素對大鼠生理生化功能的影響，將為人服用激素含量較多的食物或藥品等帶來的疾病，提供實驗參考。通過人工注射雌二醇激素，測定對SD大鼠的生理功能影響，通過檢測大鼠的血常規(guī)，肝臟器官的病變狀況，Y-迷宮實驗。結(jié)果表明，大鼠出現(xiàn)了嚴重的炎癥反應(yīng)，在肝臟形成的水腫，在血檢中大鼠白細胞（WBC）數(shù)目是正常值的5.2倍，淋巴細胞數(shù)（LY）達到24.86±4.61 X109/L，在肝臟的HE染色中發(fā)現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，其記憶力能力下降。大量的雌二醇激素攝入將會對機體的生理功能產(chǎn)生嚴重性的破壞。

雌激素；雌二醇；SD大鼠

隨著社會的發(fā)展，物質(zhì)文化極大豐富的今天，人們對生活的要求也越來越高，科技帶來的研究成果亦被廣泛的應(yīng)用到人們的生活中。避孕藥物、激素美容、追求高產(chǎn)的畜牧類產(chǎn)品中無不有著性激素的身影。它們在生物體內(nèi)發(fā)揮作用的有效濃度極低，一般僅為皮克/毫升，但其調(diào)節(jié)控制的部位靶器官卻有很多，卵巢、子宮、肝臟、腎臟等，甚至在神經(jīng)系統(tǒng)都能檢測到雌激素受體的存在，下丘腦、松果體等神經(jīng)調(diào)節(jié)中樞［1-3］。機體激素穩(wěn)態(tài)失衡，機體會產(chǎn)生各種疾?。?，5］。例如，大劑量的雌二醇攝入可引起高血脂、高膽固醇、高血壓，引發(fā)肥胖身體機能失衡，心血管疾病的病發(fā)率增高［6-9］。2010年，Kulkarni SR在研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟組織中雌二醇對水、鹽分子的保留，鈣平衡的維持也都有一定影響，對神經(jīng)信號的傳導(dǎo)產(chǎn)生阻礙［10］。雌激素相關(guān)受體E2的研究中發(fā)現(xiàn)過量的雌激素將會干擾正常性激素的代謝［11-12］。總之，探究雌激素對大鼠生理生化指標的影響以及相關(guān)行為臟器等造成的損害，對過量作用雌激素所產(chǎn)生的影響有著重要的借鑒意義。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選購8-10周齡的SD大鼠25只，全部為雌性大鼠，體重200～220g，合格證號：京檢證字：2014A156，實驗動物飼養(yǎng)在吉林大學(xué)實驗動物中心。實驗組進行人工注射雌二醇激素，驗證大鼠對激素的耐受閾值，注射雌二醇濃度分為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，每只注射 2ml，即 0.2μg、2μg、20μg、200μg，連續(xù)注射7天。空白組注射等計量的酒精。

1.2 實驗藥品

醫(yī)用1ml注射器、70%的醫(yī)用酒精、大鼠固定器、自制Y迷宮（每臂尺寸為長450mm，寬145mm，高125mm）、秒表。雌二醇激素（購置于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司），雌二醇檢測試劑盒Elisa試劑盒專業(yè)（上海閎巨生物科技有限公司）。甲基纖維素、多聚甲醛、蔗糖、Tris、EDTA、NaOH、Na2HPO4·12H2O、Na2HPO4·12H2O、吐溫-20、NaCl、KCl、KH2PO4、明膠、明礬、Hoechst33342染色液（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2 實驗方法

2.1 Y-迷宮實驗

Y迷宮實驗（Y-maze）是一種研究大鼠空間辨識能力，記憶食物所在位置，回避刺激的實驗。實驗大鼠在進行Y-迷宮前一天不給食物，實驗前將大鼠放入迷宮中熟悉環(huán)境10min，每次實驗開始更換墊料（攪動墊料避免因氣味記憶），放入大鼠，記錄其活動狀態(tài)，跑到食物臂一側(cè)，記為完成一次記憶過程，若跑到刺激臂的一側(cè)，記錄為一次錯誤記憶。如此反復(fù)直到大鼠的訓(xùn)練過程中9次都正確的找到食物臂的一側(cè)，即為完成了記憶食物臂的位置。記錄大鼠完成9次所需的訓(xùn)練總次數(shù)，訓(xùn)練次數(shù)越少，說明記憶能力越強。18小時后進行記憶維持能力的檢測，查看激素對大鼠記憶能力的影響。其中A組是SD大鼠注射有0.2μg的雌二醇激素，C組為空白組，實驗對每組大鼠進行Y-迷宮檢測，記錄大鼠在1分鐘內(nèi)找到有利臂（食物臂）的一側(cè)的次數(shù)。

2.2 大鼠血常規(guī)

對注射有十天的雌二醇激素大鼠進行心臟采血，將大鼠固定在固定器上，將采血針插入大鼠第5～6根肋骨處，采血針管處出現(xiàn)回血，連接負壓采血管收集血液，大約4～6ml。將收集到的各組大鼠血液標記，靜置，于校醫(yī)院進行檢測分析。各項數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，各組間差異顯著性統(tǒng)計采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行分析。

2.3 血液中雌二醇激素測定

將血常規(guī)檢測的剩余血量離心收集，測定大鼠雌二醇的血液含量，24℃±2℃室溫靜置2h后于3000r min離心5min，取血清于2ml EP管中。采用測定血清中雌二醇檢測試劑盒，具體操作參看試劑盒說明。

2.4 大鼠肝臟檢測

取實驗組SD大鼠的肝臟免疫組化檢測細胞凋亡情況，將取出的組織經(jīng)放置在冰浴的多聚甲醛溶液固定30min，然后浸泡在5%、15%、35%的蔗糖溶液脫水10min，包埋，切片，洗滌，封閉，進行HE染色，觀察臟器組織細胞的凋亡狀況，借以評估雌二醇激素對大鼠組織生理功能造成的影響。

3 實驗結(jié)果

3.1 Y-迷宮檢測結(jié)果

圖1是記錄平均7天找到食物的次數(shù)，A1、A2、A3、A4、A5是SD大鼠注射有100μg/ml雌二醇，C1，C2，C3，C4，C5為注射有生理鹽水的空白組。

圖1 大鼠1min內(nèi)找到食物的次數(shù)

由上圖記錄的結(jié)果可以看出注射有100μg/ml雌二醇的實驗組，發(fā)現(xiàn)食物平均2次/min，空白組平均1分鐘內(nèi)發(fā)現(xiàn)食物是實驗組的2.8倍。這表明過量的雌激素攝入可能會影響大鼠的記憶能力，對大鼠的空間辨識、神經(jīng)的調(diào)節(jié)造成影響。

3.2 血常規(guī)檢測

從檢驗的報告單上可以看出：大鼠出現(xiàn)了嚴重的炎癥反應(yīng)，形成了局部的水腫，在血檢中大鼠白細胞（WBC）數(shù)目是正常值的5.2倍，淋巴細胞數(shù)（LY）達到24.86±4.61×109/L，新生紅細胞數(shù)目增加，且平均體積較小，血小板數(shù)目、體積等都有不同程度的降低。

表1 SD大鼠血常規(guī)檢測

3.3 血液中雌二醇激素含量

利用雌二醇檢測試劑盒檢測SD鼠血清，隨著注射雌二醇激素量的增加，檢測到血清中雌二醇激素的含量也增高。大鼠在飼養(yǎng)的7天時間里，實驗組和空白組相比較體重增加不明顯。實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠活動量降低，進食量減少，對外界刺激反應(yīng)不敏感。實驗組中雌二醇激素的含量要比空白組高出2-13倍，表明當大量雌激素進入生物體，其生物降解較為緩慢。

表2 雌二醇血液中的含量檢測

3.4 大鼠肝臟凋亡檢測

如圖2所示,選取雌二醇激素注射100μg/ml組為例，選取的SD大鼠肝臟組織做石蠟切片，通過Hoechst 33342核酸染色，利用伊紅復(fù)染。圖2（a）即雌二醇激素注射100μg/ml組肝臟組織切片，含有大量的細胞碎片，肝細胞彌散性分部，細胞形態(tài)發(fā)生形變，復(fù)染的伊紅標記出含有死亡的細胞較多。圖2（b）即實驗對照組，肝臟切片提示相對細胞完整性較好，均勻，細胞緊密，碎片較少。從圖2的結(jié)果中提示雌二醇激素的代謝主要發(fā)生在肝臟，這與前人研究的結(jié)果相一致，性激素主要在肝中代謝。當大量雌二醇激素的攝入對大鼠的肝臟組織造成了較為嚴重的損傷，肝細胞出現(xiàn)大量死亡。

圖2 肝臟細胞凋亡HE染色檢測左圖（a）為100μg/ml雌二醇注射SD大鼠肝臟切片圖，右圖（b）為空白組SD大鼠肝臟檢測切片圖

4 結(jié)論

雌激素的代謝一直受到人們的普遍關(guān)注，因其能通過與其受體結(jié)合或影響細胞信號途經(jīng)信號的傳遞，進而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。過量的雌激素進入機體將破壞機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，體內(nèi)內(nèi)分泌紊亂。實驗通過對SD大鼠注射大量雌二醇激素，構(gòu)造大鼠雌激素過度累積模型，雌激素對大鼠的代謝活動明顯下降、反應(yīng)遲鈍、空間辨識能力、產(chǎn)生抑郁性情緒。血液中雌二醇含量增加，白細胞和血紅細胞含量較空白組數(shù)量明顯增多，實驗組大鼠肝臟出現(xiàn)凋亡，大量激素沉積在肝臟組織中對肝臟造成了巨大的代謝負荷，影響肝功能和肝細胞的健康狀況。本研究還將繼續(xù)探討雌二醇激素對SD大鼠的相關(guān)生理生化的影響，雌二醇激素代謝相關(guān)脫氫酶在不同組織中的表達，包括過量激素誘導(dǎo)下的肝臟凋亡途徑的研究，如線粒體誘導(dǎo)的Caspase酶發(fā)生的變化或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣離子的調(diào)控時常，以及雌二醇激素代謝相關(guān)神經(jīng)類疾病的探索，為雌二醇激素異常代謝與動物自身生理生化狀況的改變提出更多的研究。

［1］鄒移海，徐志偉，蘇剛強.實驗動物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：65-72.

［2］方琳麗，王魯華，奚寶珊.女性不孕癥患者血清性激素水平的變化［J］.放射免疫學(xué)雜志，2001，13（5）：298-301.

［3］戴麗軍，廖軍，黃月玲.Fmr1基因敲除小鼠血清雌性激素含量的比較研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（8）：459-462.

［4］Liu X，Gao Y，Li M，et al.Sirt1 mediates the effect of the heme oxygenase inducer，cobalt protoporphyrin，on ameliorating liver metabolic damage caused by a high-fat diet［J］.J Hepatol，2015，63（3）：713-721.

［5］Hsu CP，Zhai P，Yamamoto T，et al.Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion［J］.Circulation，2010，122（21）：2170-2182.

［6］張紅艷，岑加萍，黃堅.雌激素對去勢大鼠SIRT1表達的影響［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志2015，34（2）：119-122.

［7］高建明，侯文元，焦占海.小鼠超數(shù)排卵效果分析［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，15（1）：25-28.

［8］張夏微，張丹參，薛貴平.雌二醇對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)氨基酸水平的影響［J］.神經(jīng)藥理學(xué)報，2011，10（5）：8-14.

［9］戴麗軍，黃月玲，葉炳飛.雌性Wistar大鼠、NIH小鼠性周期血清激素含量分析［J］.實驗動物科學(xué)，2007，4（24）：11-13.

［10］Kulkarni SR，Donepudi AC，Xu J，et al.Fasting induces nuclear factor E2-related factor 2 and ATP-binding Cassette transporters via protein kinase A and Sirtuin-1 in mouse and human［J］.Antioxid Redox Signal，2014，20（1）：15-30.

［11］Mich，Li Y，Chou MM，et al.SIRT1 is essential for normal cognitive function and synaptic plasticity［J］.Neurosci，2010，30（29）：9695-9707.

［12］劉傳志.環(huán)境雌激素對大鼠視網(wǎng)膜17β-羥基固醇脫氫酶的功能研究［D］.長春：長春理工大學(xué)，2004.

The Effects of Oestrogen Hormone on The Physiological Function in Rats

LIU Chuanzhi，ZHANG Li，LIU Zhenyao，LI Xiao，GONG Ping
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Estrogen is one of the most important endogenous hormones in human body，metabolic abnormalities in the body，It will cause the endocrine disorder，local edema，hormone，infertility，even lead to high blood pressure and liver lesions.Explore oestrogen hormone influence on physiological and biochemical function of rats，this will provide experimental reference about diseases by taking hormone food or medicine.Through artificial injected oestrogen hormone，determination of physiological function of SD rats，blood routine，liver organ lesions，Y- maze experiment.Results show that the rats appeared serious inflammation，the liver has edema，the number of white blood cells（WBC）is 5.2 times higher then normal，lymphocyte count （LY） at 24.86±4.61 X109/L，the liver HE staining has apoptosis，the memory capacity decline.a lot of oestrogen hormone intake will be damaged to the physiological function of the body.

female hormone；estradiol；SD rat

Q956

A

1672-9870（2017）05-0125-03

2017-04-11

吉林省科技廳科研項目（20170309009YY）

劉傳志（1987-），男，博士研究生，助教，E-mail：duguchuanzhi@163.com