薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

蘭 韜， 董跟來， 初 僑， 劉 文， 楊 麗， 王鶴妍， 王 尉， 席興軍

（1.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191；2.亞東信基（北京）農(nóng)產(chǎn)品有限公司，北京 100125；3.北京市理化分析測試中心，北京 100089）

薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

蘭 韜1， 董跟來2， 初 僑1， 劉 文1， 楊 麗1， 王鶴妍1， 王 尉3， 席興軍1

（1.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191；2.亞東信基（北京）農(nóng)產(chǎn)品有限公司，北京 100125；3.北京市理化分析測試中心，北京 100089）

按照J(rèn)JF 1006——1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的要求，建立薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方法。采用IR、UV、MS和NMR等方法對薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，以高效液相色譜方法進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)，通過8家實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合定值，完成結(jié)果的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明：該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性良好，定值結(jié)果為98.9%，置信度為95%的不確定度為0.2%。研制出的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于薯蕷產(chǎn)品的檢測和質(zhì)量控制。

薯蕷皂素；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；均勻性；穩(wěn)定性；定值

0 引 言

盾葉薯蕷為我國特有的薯蕷科多年生草本植物[1]。薯蕷皂素（Diosgenin）是盾葉薯蕷的主要化學(xué)成分，在制藥行業(yè)中應(yīng)用較為廣泛，是甾體激素類藥物的重要原料來源，以薯蕷皂素為原料，通過衍生、合成等方法制得多種藥物[2-3]。研究表明，薯蕷皂素具有抗過敏、抗炎[4-5]、抗腫瘤[6-8]等多種醫(yī)學(xué)價(jià)值。提取薯蕷皂素的方法有酸水解法、預(yù)發(fā)酵法、流體萃取法、酶解法、微生物發(fā)酵法和色譜法等[9]。張?jiān)Ｇ涞萚10]運(yùn)用直接酸水解法，通過優(yōu)化酸水解時(shí)間和提取時(shí)間，最后干燥得薯蕷皂素，提取率為44.81%。張雯等[11]采用菌種黑曲霉，氮源為0.5%尿素，盾葉薯蕷發(fā)酵90h后，以氯仿為提取溶劑，回收率達(dá)到1.26%。毛楠等[12]通過發(fā)酵法提取薯蕷皂素，除去部分纖維后使用淀粉酶酶解，發(fā)酵后除去酒精并用硫酸水解提取薯蕷皂素，提取率可達(dá)2.09%。

文獻(xiàn)報(bào)道薯蕷皂素的檢測方法包括薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法[2]等，但這些方法均為相對法，需要薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對照才能準(zhǔn)確定量。目前，國內(nèi)未見薯蕷皂素國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的報(bào)道，薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制滿足了相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測、質(zhì)量控制的需求，保證了產(chǎn)品檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性[13]。本研究采用酸水解法、萃取、除色、減壓濃縮制備薯蕷皂素，通過紅外光譜（IR）、紫外-可見吸收光譜（UV-VIS）、質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）等方法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并開展均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)和定值分析，最終得到純度大于98.5%、擴(kuò)展不確定度小于1.0%的薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盾葉薯蕷（北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司）；石油醚、鹽酸均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水；甲醇為色譜純（美國Fisher Scientific公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)配SPD-M20A檢測器（日本島津公司，LC-20A）；紫外-可見分光光度計(jì)（美國瓦里安公司，Varian cary 100）；傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀（德國珀金埃爾默公司，Spectrum 400）；高效液相色譜-質(zhì)譜儀 （美國安捷倫公司，1100 Series LC/MSD Trap）；超導(dǎo)脈沖傅里葉變換NMR儀（德國Bruker公司，AVANCE 600）；真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，F(xiàn)D-1-50）。

1.3 方法

1.3.1 薯蕷皂素的分離純化

將盾葉薯蕷根莖洗凈，干燥后粉碎，用少量去離子水浸泡干粉，于37℃恒溫箱中發(fā)酵48h。然后用2mol/L鹽酸水解6h，過濾，將濾餅烘干。采用石油醚作為提取溶劑，索氏提取4h。將得到的提取物活性炭脫色，并減壓濃縮除去溶劑。最后，石油醚溶解樣品，結(jié)晶。過濾后，甲醇復(fù)溶樣品，重結(jié)晶，最終獲得純度大于98.5%的高純度化合物。

制備好的薯蕷皂素單體置于潔凈室內(nèi)進(jìn)行分裝，用百萬分之一天平稱量，以每瓶5 mg的稱樣量將薯蕷皂素樣品分裝于2 mL的棕色樣品瓶中。得到薯蕷皂素共180瓶，以1～180號計(jì)。將分裝好的樣品置于能夠密封的塑料盒中，并置于4℃冰箱中長期保存。

1.3.2 定性分析

采用UV、IR、MS和NMR方法對薯蕷皂素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。UV的掃描范圍是200～400nm；IR的掃描范圍是400～4000cm-1；MS采用正離子模式，脫氣溶劑為氮?dú)?；NMR測試溶劑為CDCl3。

1.3.3 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)JJF 1343——2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[14]的要求，對研制的樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的180個(gè)包裝中隨機(jī)抽取10個(gè)包裝，每個(gè)包裝取3個(gè)子樣做瓶間和瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)。每瓶最小取樣量為1 mg，溶解于1 mL 85%色譜甲醇中。通過方差分析測試結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。

1.3.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性分為短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。對薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性進(jìn)行考察，選取 25℃避光保存，分別 1，4，10 h，1，2，3，4，7d 進(jìn)行檢測，采用HPLC法檢驗(yàn)，每次隨機(jī)取3份樣品，測定2次。

對薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察，選取 4℃避光保存，分別在第 0，3，6，9，12 月進(jìn)行穩(wěn)定性檢測，檢驗(yàn)方法為HPLC法，每次隨機(jī)取3份樣品，測定2次。

1.3.5 定值

根據(jù)JJF 1006——1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的要求對研制的樣品進(jìn)行純度定值。采用8個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作的方式進(jìn)行定值，從全部包裝中隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個(gè)定值單位送3瓶，每瓶測定2次。定值單位將樣品配成一定濃度的溶液，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值，經(jīng)檢驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，估算不確定度。

1.3.6 不確定度評定

定值結(jié)果的不確定度包括樣品的不均勻性引入的不確定度、不穩(wěn)定性引入的不確定度、定值過程引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度分析

HPLC條件：流動相為甲醇（A）-水（B），0～20min，85%A；流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：30min；ELSD條件如下：漂移管溫度40℃，增益值6，載氣壓力350 kPa。色譜柱為Waters XTerra RP18（150mm×4.6mm，5 μm）柱，扣除溶劑峰，對色譜峰進(jìn)行面積歸一化定量，所得薯蕷皂素的純度分析結(jié)果為99.64%，如圖1所示。

圖1 薯蕷皂素純化前及純化后HPLC色譜圖

2.2 定性分析

經(jīng)UV、IR、MS和NMR等方法進(jìn)行鑒定，數(shù)據(jù)如下：UV：波長為 216nm，如圖2 所示；IR：3514，3265，1 459，1 378，1 052，981，962，920，900，864 cm-1；MS：m/z415.320 3[M+H]+；氫譜、碳譜數(shù)據(jù)見表 1、表 2。綜合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫對比，確定該化合物為薯蕷皂素。

圖2 薯蕷皂素紫外光譜圖

表1 薯蕷皂素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

表2 薯蕷皂素的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)

2.3 均勻性檢驗(yàn)

均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)、每瓶的平均值、方差見表3，均勻性研究的方差分析見表4。

表3 均勻性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)

表4 均勻性研究的方差分析表

查F臨界值表，得F0.05（9，20）=2.39，F(xiàn)=MS瓶間/MS瓶內(nèi)=1.26＜F0.05（9，20），說明薯蕷皂素樣品符合正態(tài)分布，所以本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是均勻的。

瓶間方差用下式計(jì)算：

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差是該方差的平方根：

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢測的數(shù)據(jù)如圖3所示，由圖可知，在一周的時(shí)間內(nèi)薯蕷皂素在25℃避光保存條件下具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)如表5所示，由表中數(shù)據(jù)可知，測得的平均值在測定時(shí)間內(nèi)沒有隨時(shí)間的變化而明顯的升高或下降，說明薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在1年內(nèi)穩(wěn)定。

表5 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察斜率值是否有顯著變化，以此對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性變化進(jìn)行預(yù)測。斜率可用下式計(jì)算：

直線上點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由下式計(jì)算：

取其平方根s=0.043。

與斜率相關(guān)的不確定度用下式計(jì)算：

自由度為n-2和p=0.95（95%置信水平）的分布因子t=3.18， 由于|b|＜t0.95，n-2·s（b1）=3.18×0.0045=0.014 3，故斜率是不顯著的，因而未觀測到該樣品的不穩(wěn)定性。t=12個(gè)月的長期穩(wěn)定性的不確定度為u穩(wěn)=sb1·t=0.0045×12=0.06%

2.5 定值結(jié)果

采用格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)法對采集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，定值結(jié)果如表6所示。

表6 純度定值結(jié)果

總平均值：

由液相色譜定值引起的不確定度等于：

水分含量：根據(jù)卡爾費(fèi)休法測定水分平均值為0.07%；元素含量：采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜測定總元素平均值為0.06%，換算成碳酸鹽的含量為0.14%，其中：

溶劑殘留：根據(jù)中華人民共和國藥典（2015年版）四部通則0861，采用氣相色譜頂空進(jìn)樣法總?cè)軇埩魷y定平均值為0.12%（如表7所示），其中：

因此：

表7 水分、元素含量及溶劑殘留匯總表

由于HPLC定值過程中沒有包含水分、無機(jī)元素和溶劑殘留。因此，最終定值方法為扣除響應(yīng)的水分、灰分之后的結(jié)果。故薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的標(biāo)準(zhǔn)值為（1-0.07%-0.14%-0.12%）×99.2%=98.9%。

2.6 不確定度的評定

薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度計(jì)算公式為

故UCRM=0.08%。

擴(kuò)展不確定度為

薯蕷皂素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度定值結(jié)果表達(dá)為98.9%±0.2%（k=2）。

3 結(jié)束語

本研究針對國內(nèi)缺乏薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的狀況，研制了薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，創(chuàng)建了該物質(zhì)的分離純化方法。通過定性分析和均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果表明該物質(zhì)的均勻性與穩(wěn)定性均滿足國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值及其不確定度為98.9%±0.2%。研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為薯蕷皂素產(chǎn)品及相關(guān)領(lǐng)域的成分分析、產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證。

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（編輯：徐柳）

Preparation of Diosgenin certified reference materials

LAN Tao1， DONG Genlai2， CHU Qiao1， LIU Wen1， YANG Li1， WANG Heyan1， WANG Wei3， XI Xingjun1
（1.China National Institute of Standardization，Beijing 100191，China；2.Yadongxinji（Beijing） Agricultural Products Co.，Ltd.，Beijing 100125，China；3.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China）

The preparation method of Diosgenin reference materials was established according to thetechnicalnormofprimaryreferencematerial（JJF 1006-1994）.Qualitative analysisof Diosgenin was carried out by UV， IR， MS and NMR spectrum and high-performance liquid chromatography was carried out for homogeneity and stability inspection.A cooperative certification was conducted with eight laboratories and the certification data were analyzed.The results showed that the homogeneity and stability of Diosgenin were excellent and the certified value was 98.9%with the expand uncertainty of 0.2%in confidence coefficient of 95%.The reference material of Diosgenin can be used for inspection and quality control of related products.

Diosgenin； reference material； homogeneity； stability； certification

A

1674-5124（2017）11-0042-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.11.009

2017-03-18；

2017-05-10

中央基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（562016Y-4687，562016Y-4492，562017Y-5284）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201510048-4）

蘭 韜（1984-），男，安徽馬鞍山市人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)樣品研制。

席興軍（1973-），男，廣西橫縣人，副研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)樣品研究。