柞蠶微孢子蟲的研究進(jìn)展

劉中文 徐 欣 張英華 楊新峰 郭 劍 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院， 河南鄭州 450008)

柞蠶微孢子蟲的研究進(jìn)展

劉中文 徐 欣 張英華 楊新峰 郭 劍 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院， 河南鄭州 450008)

隨著柞蠶微孢子蟲(NosemapernyiWen et Ding)cDNA文庫及EST(expressed sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)測(cè)序的完成，基因克隆測(cè)序、功能蛋白分析、抗體免疫等研究手段也逐漸應(yīng)用于柞蠶微孢子蟲的研究，并在病原的分離檢測(cè)、感染發(fā)病規(guī)律、傳播途徑、綜合防治等方面取得較大進(jìn)展。介紹了柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測(cè)、感染傳播規(guī)律及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展和柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展，展望了柞蠶微孢子蟲的研究方向和內(nèi)容。

柞蠶； 微孢子蟲； 微粒子病； 分離檢測(cè)； 垂直傳播

柞蠶生產(chǎn)上的重要病害——柞蠶微粒子病，是由柞蠶種生產(chǎn)中的唯一檢疫對(duì)象柞蠶微孢子蟲(NosemapernyiWen et Ding)誘發(fā)的，易造成絲繭生產(chǎn)減產(chǎn)，并經(jīng)柞蠶卵垂直傳播影響種繭生產(chǎn)，威脅種質(zhì)資源的保育及生產(chǎn)的安全[1]。一直以來，關(guān)于柞蠶微孢子蟲的分離檢測(cè)、感染發(fā)病規(guī)律、傳播途徑、綜合防治等方面的研究不斷有新的進(jìn)展，直到2011年重慶師范大學(xué)XU等[2]初步鑒定了其核型，并對(duì)全基因組進(jìn)行組裝，但由于組裝結(jié)果差異較大，全基因組草圖還需進(jìn)一步研究確定；2014年，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)完成了柞蠶微孢子蟲cDNA文庫的構(gòu)建及EST(expressed sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)測(cè)序[3]，使得柞蠶微孢子蟲的研究在分子生物學(xué)方面有了巨大進(jìn)展，同時(shí)關(guān)于柞蠶微孢子蟲感染后柞蠶在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成為熱點(diǎn)，為探究柞蠶對(duì)柞蠶微孢子蟲的免疫應(yīng)答模式、柞蠶微粒子病的發(fā)病機(jī)理和開發(fā)新的防治藥劑提供了直接依據(jù)[4]。本文介紹了柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測(cè)、感染傳播規(guī)律及其感染發(fā)病分子機(jī)制的研究進(jìn)展和柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展，以期在阻斷柞蠶微粒子病的傳播以及提高柞蠶的免疫能力等方面提供理論依據(jù)，為今后應(yīng)用于柞蠶生產(chǎn)、降低微粒子病的發(fā)病率與傳播力提供幫助。

1 柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測(cè)技術(shù)

1.1 柞蠶微孢子蟲的分離純化

微孢子蟲孢子的分離純化方法有差速離心法、蔗糖(氯化銫) 密度梯度離心法和Percoll 密度梯度離心法等多種，其中應(yīng)用最多的是Percoll密度梯度離心法。姜義仁等[5]采用傳統(tǒng)離心的方式分離得到柞蠶微孢子蟲孢子，再根據(jù)Percoll溶液自行分層的特性，設(shè)計(jì)3個(gè)單一濃度和2個(gè)不連續(xù)密度梯度的Percoll NaCl溶液進(jìn)行純化試驗(yàn)，最終得到了折光性和均一性一致，無組織碎片的柞蠶微孢子蟲孢子，最佳離心方法為25%、50%、75%、100%不連續(xù)梯度，15 000 r/min下離心30 min，NaCl溶液濃度為0.15 mol/L。

1.2 柞蠶微孢子蟲的檢測(cè)技術(shù)

目前，快速免疫檢測(cè)技術(shù)、酶學(xué)及分子生物學(xué)研究方法已廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)鑒定，如抗體檢測(cè)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA法)等技術(shù)。

1.2.1 抗體檢測(cè)技術(shù) 王伯陽等[6]通過制備柞蠶微孢子蟲多克隆抗體，建立了柞蠶微孢子蟲膠體金免疫層析快速檢測(cè)法，但由于抗體效價(jià)、柞蠶血淋巴本身具有顏色等原因?qū)е聶z測(cè)靈敏度較低，后期希望配合親和性更高的單克隆抗體優(yōu)化完善檢測(cè)方法。

1.2.2 ELISA法 ELISA法測(cè)定因具有較多優(yōu)點(diǎn)而在生物科學(xué)各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，姜義仁等[7]也用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)柞蠶微孢子蟲，特異性及靈敏度較好，為開發(fā)柞蠶微孢子蟲單克隆抗體、解決檢測(cè)假陽性、提高檢測(cè)靈敏度及特異性等方面奠定了基礎(chǔ)。但ELISA法仍存在抗體捕獲孢子的能力較弱、靈敏度的穩(wěn)定性較差等不足之處，實(shí)用化檢測(cè)技術(shù)有待進(jìn)一步研究[8]。

2 柞蠶微孢子蟲的感染傳播規(guī)律及其分子機(jī)制研究進(jìn)展

2.1 具有致病性柞蠶微孢子蟲種類

目前發(fā)現(xiàn)對(duì)柞蠶具有感染致病性的微孢子蟲有5種[9]，包括柞蠶微孢子蟲、修氏內(nèi)網(wǎng)蟲(Endoreticlatusschubergi)、鏈孢變形孢蟲(VairimorphachainsporumWen et Ding)、訥卡變形孢蟲(Vairimorphanecatrix)和柞蠶微孢子蟲新種(Nosemasp.)，其中，柞蠶微孢子蟲是優(yōu)勢(shì)種。

根據(jù)宿桂梅等[10]的文獻(xiàn)，可以從主要侵染部位及順序、主要寄主范圍、孢子大小與形狀、極絲繞核圈數(shù)、孢子母細(xì)胞的產(chǎn)孢形式等方面對(duì)5種微孢子蟲進(jìn)行分類鑒定，為研究各種微孢子蟲的致病性做準(zhǔn)備。在此基礎(chǔ)上，徐亮等[11]比較5個(gè)柞蠶品種的抵抗能力發(fā)現(xiàn)，柞蠶品種582的幼蟲生長發(fā)育受微孢子蟲侵染的影響最小，柞蠶品種青6號(hào)和寬青的幼蟲生長發(fā)育受微孢子蟲侵染的影響最大，為選育對(duì)微孢子蟲侵染具有較強(qiáng)抵抗力的柞蠶品種提供了更充分和更準(zhǔn)確的依據(jù)。

2.2 柞蠶微孢子蟲的感染傳播規(guī)律

柞蠶微孢子蟲的生命周期一般分為感染期、裂殖增殖期和孢子增殖期3個(gè)階段[12]。孢子階段是微孢子蟲生活史中成熟且具有侵染力的階段，也是研究微孢子蟲侵染機(jī)制、生活史及檢測(cè)診斷的關(guān)鍵階段。與微孢子蟲侵染有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)有3個(gè)：極膜體、極絲及后極泡，其中與侵染聯(lián)系最緊密的細(xì)胞器是極絲[12]。目前至少有5種極絲蛋白被鑒定，這些蛋白在微孢子蟲種間具有一定的保守性，在與宿主細(xì)胞粘附及侵染的最后階段可能發(fā)揮作用[13]；極絲蛋白還具有用于開發(fā)血清學(xué)檢查抗原的潛力[14]。可以根據(jù)微孢子蟲極絲蛋白的研究克隆得到柞蠶微孢子蟲的相關(guān)極絲蛋白，為進(jìn)一步研究其侵染機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)于微孢子蟲感染細(xì)胞途徑的研究一直在進(jìn)行，目前認(rèn)為主要有2種方式：一是孢子發(fā)射極絲注射孢原質(zhì)到宿主細(xì)胞以達(dá)到感染的目的，有的同時(shí)形成寄生空泡再次感染[15]；二是通過微孢子蟲孢壁的主要成分孢壁蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用，來實(shí)現(xiàn)微孢子蟲對(duì)宿主的侵染，這也是病原體免疫檢測(cè)的重要靶標(biāo)蛋白[16]，關(guān)于柞蠶微孢子蟲孢壁蛋白的研究也逐漸成為熱點(diǎn)。

柞蠶微孢子蟲的傳播途徑有水平傳播和垂直傳播2種[1]。水平傳播即經(jīng)口感染，柞蠶微孢子蟲進(jìn)入到柞蠶體內(nèi)后，微孢子蟲不斷增殖，吸收了蠶體的大量營養(yǎng)，導(dǎo)致柞蠶生理機(jī)能發(fā)生障礙；垂直傳播即胚種傳染，是柞蠶微孢子蟲的主要傳染途徑，也是造成檢測(cè)及防治難度較大的原因[17]。關(guān)于柞蠶微孢子蟲致病性與傳播規(guī)律相互關(guān)系的研究還比較少，但已有一些研究發(fā)現(xiàn)，病原的毒力和垂直傳播特點(diǎn)具有一定的關(guān)系，病原的毒力越強(qiáng)，胚種垂直傳染力越弱，反之亦然[18]。同時(shí)，在家蠶中發(fā)現(xiàn)，對(duì)家蠶具有病原性的不同微孢子蟲所表現(xiàn)出的垂直傳播特點(diǎn)不一致；另外，研究人員還從山東蠶區(qū)分離出一種納卡變形微孢子蟲，雖對(duì)家蠶具有較強(qiáng)的致病性[19]，但不具有垂直傳播的能力[20]。

2.3 侵染相關(guān)分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展

龔娟娟等[21]利用Percoll-NaCl梯度純化和LC-MS/MS(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜)鑒定技術(shù)，得到了柞蠶微孢子蟲的610個(gè)蛋白，再進(jìn)行GO蛋白質(zhì)功能分析，發(fā)現(xiàn)多種與侵染、增殖相關(guān)的功能蛋白，為研究其侵染機(jī)制提供了分子依據(jù)。

孢壁蛋白在信號(hào)識(shí)別、細(xì)胞粘附和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面起著重要作用，SOUTHERN等[22]通過研究功能基因EnP1，證實(shí)了孢壁蛋白是病原菌侵染過程中的重要蛋白，還發(fā)現(xiàn)兔腦炎微孢子蟲孢壁蛋白EnP1和家蠶微孢子蟲表面蛋白NbSWP26有相似的功能[22-23]。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲孢壁的某些蛋白質(zhì)被破壞，如利用抗體或其他化學(xué)物質(zhì)處理微孢子蟲孢子，其孢子的感染能力顯著下降[24]。

由于微孢子蟲特有的幾丁質(zhì)孢壁結(jié)構(gòu)，常規(guī)的蛋白質(zhì)提取方法難以獲得僅含微孢子蟲表面蛋白的檢測(cè)樣品，而水溶性維生素生物素和糖蛋白親和素相結(jié)合的層析分離技術(shù)可特異性標(biāo)記和富集細(xì)胞表面蛋白，具備靈敏、穩(wěn)定、專一、適用廣泛等特點(diǎn)[25-27]。趙唯希等[28]運(yùn)用生物素-親和素層析分離技術(shù)得到柞蠶微孢子蟲表面蛋白，并與家蠶微孢子蟲表面蛋白進(jìn)行比對(duì)，已鑒定出3個(gè)柞蠶微孢子蟲孢子表面蛋白NpSWP30、NpSWP26、NpSWP12，并通過間接免疫熒光亞細(xì)胞定位分析確證為孢子外表面的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究柞蠶微孢子蟲孢壁蛋白細(xì)胞定位以及功能奠定了基礎(chǔ)，也為檢測(cè)和侵染機(jī)制的研究提供了新的靶標(biāo)蛋白。

3 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展

柞蠶微孢子蟲的侵染對(duì)柞蠶體內(nèi)各種生理生化指標(biāo)均造成不同程度的影響，主要表現(xiàn)在中腸和血淋巴的一系列反應(yīng)中。宿桂梅等[10]探究了不同溫度條件對(duì)柞蠶微孢子蟲侵染組織順序及發(fā)病時(shí)間的影響不同，驗(yàn)證了其是通過血液循環(huán)侵染其他組織，并發(fā)現(xiàn)侵染的過程都是從柞蠶中腸開始的。

3.1 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶中腸相關(guān)免疫反應(yīng)

基于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶中腸的重要作用，姜義仁等[12]構(gòu)建了柞蠶中腸蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，分析篩選得到差異基因和差異蛋白所在的位置和參與的代謝，并發(fā)現(xiàn)與柞蠶微孢子蟲發(fā)病相關(guān)的2種蛋白——絲氨酸蛋白酶和芳基貯存蛋白，為進(jìn)一步闡明柞蠶微粒子病的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。之后，王勇等[32]運(yùn)用qRT-PCR(定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng))技術(shù)對(duì)柞蠶中腸內(nèi)ApHSC70基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在微孢子蟲感染后最高可上調(diào)近5倍，推測(cè)該基因可能參與了柞蠶的免疫防御過程。

3.2 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶血淋巴相關(guān)免疫反應(yīng)

相關(guān)研究認(rèn)為血細(xì)胞總數(shù)的增加及蛋白含量的減少可以作為衡量柞蠶微粒子病的標(biāo)志[33]，說明柞蠶血淋巴在柞蠶免疫系統(tǒng)中起重要作用，能夠抵抗柞蠶微孢子蟲的入侵。臧敏等[34]通過添食柞蠶微孢子蟲發(fā)現(xiàn)，血淋巴蛋白質(zhì)含量和組成發(fā)生顯著變化，影響柞蠶體內(nèi)營養(yǎng)代謝并且雌雄個(gè)體存在抗性差異，說明柞蠶微孢子蟲寄生是一個(gè)相對(duì)緩慢的侵染過程。還有研究證明，熱休克蛋白HSC70在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及抗病原菌感染過程中起重要作用，參與多種生物的免疫應(yīng)答反應(yīng)[35]，這可以作為研究柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫反應(yīng)的一個(gè)依據(jù)和方法。

4 研究展望

柞蠶微孢子蟲是生產(chǎn)上最具威脅的病原之一，與產(chǎn)業(yè)發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，關(guān)于其基礎(chǔ)理論的研究成果應(yīng)該與蠶業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐結(jié)合，以推動(dòng)產(chǎn)業(yè)升級(jí)與發(fā)展。柞蠶微孢子蟲檢測(cè)技術(shù)的研究提高了實(shí)際生產(chǎn)中微粒子病的檢出率，并能實(shí)現(xiàn)柞蠶微粒子病早發(fā)現(xiàn)、早處理，降低得病率與損失。但對(duì)于寄生柞蠶的5種微孢子蟲的研究只集中在柞蠶微孢子蟲的研究，而關(guān)于其他4種微孢子蟲致病力與胚種傳染率的異同還有待進(jìn)一步研究，如可以利用新技術(shù)分離純化各種微孢子蟲，為微粒子病的綜合治理提供幫助；同時(shí)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步研究柞蠶免疫相關(guān)基因，為提高柞蠶抗病性提供分子學(xué)依據(jù)。

柞蠶微孢子蟲的水平傳播需要在柞蠶場(chǎng)生產(chǎn)過程中加強(qiáng)防病意識(shí)，做好消毒工作，降低相互傳染的幾率；垂直傳播是造成柞蠶微粒子病病原污染的重要原因，而且對(duì)柞蠶種的種質(zhì)檢測(cè)工作造成諸多麻煩，因此亟需對(duì)其進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究，以期可以找到阻斷柞蠶微孢子蟲垂直傳播的方法和藥劑，達(dá)到阻斷柞蠶微孢子蟲垂直傳播的目的。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行柞蠶抗性育種素材的創(chuàng)建，具有廣闊的研究前景，今后可以利用已發(fā)現(xiàn)的與侵染相關(guān)的極絲蛋白、孢壁蛋白的結(jié)構(gòu)與功能差異，測(cè)定免疫相關(guān)基因的表達(dá)量變化，以揭示寄生柞蠶不同微孢子蟲垂直傳播的機(jī)理。還可以尋找阻斷垂直傳播的分子靶標(biāo)，構(gòu)建相關(guān)的單克隆抗體，再運(yùn)用RNA干擾或轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究柞蠶抗微粒子病新品種。

綜合柞蠶微孢子蟲近幾年的研究發(fā)展情況，盡管其核型已獲得鑒定，然而具體的遺傳規(guī)律還不清楚，詳細(xì)的基因圖譜結(jié)果還沒有獲得，相關(guān)基因在微孢子蟲侵染過程中和宿主的免疫過程中的功能還需深入研究。未來開展對(duì)柞蠶微孢子蟲侵染和垂直傳播機(jī)制的研究，并建立便捷、靈敏的檢測(cè)方法和創(chuàng)建柞蠶高抗病育種素材將是重要的研究方向。

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2017-07-13;接受日期2017-09-27

信息： 劉中文(1987—)，男，山東沂水，本科，助理農(nóng)藝師。Tel： 0377-66661675， E-mail: 1020350426@qq.com

信息： 朱緒偉(1968—)，男，河南信陽，碩士研究生，高級(jí)農(nóng)藝師。

Tel： 0377-66666115， E-mail: hnsckyzxw@126.com

S885.1

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1007-0982(2017)04-0043-05