跨界基因沉默菌株的快速構(gòu)建及對(duì)靶標(biāo)基因干擾能力的檢測(cè)

胡琳敏+楊霄旭+王金+向雙林+魏晨曦

摘 要 “跨界基因沉默”是一種利用大腸桿菌在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中傳遞小干擾RNA并引起基因沉默的新穎技術(shù)，具有實(shí)用、穩(wěn)定和低成本等優(yōu)點(diǎn).該技術(shù)通過(guò)構(gòu)建一種能轉(zhuǎn)錄出短發(fā)夾RNA （shRNA） 的大腸桿菌，而這種大腸桿菌產(chǎn)生的shRNA能靶向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的特定基因，從而引發(fā)RNA干擾（RNAi）.本文用RecA同源重組的方法將跨界基因沉默質(zhì)粒的工作元件快速地整合到大腸桿菌的染色體DNA上，構(gòu)建了跨界基因沉默菌株.通過(guò)吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)證明了跨界基因沉默菌株能夠入侵哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最后Western blot結(jié)果表明跨界基因沉默菌株可以對(duì)靶標(biāo)基因產(chǎn)生干擾作用.該技術(shù)的完善將進(jìn)一步促進(jìn)工程菌的研發(fā)和利用.

關(guān)鍵詞 siRNA傳遞；跨界基因沉默菌株；RNA干擾；RecA同源重組

中圖分類(lèi)號(hào) Q812；Q9399 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2017）05-0029-07

Fast Construction of Trans-kingdom RNAi Bacteria and Detection of Their Ability to Silence Expression of Target Genes

HU Lin-min1#， YANG Xiao-xu1，2#， WANG Jin1， XIANG Shuang-lin1， WEI Chen-xi1*

（1. The National and Local Joint Engineering Laboratory of Animal Peptide Drug Development，

School of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2. The Medicine School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract Trans-kingdom RNA interference （TkRNAi） is a useful， stable and low-cost approach for small interference RNA delivery， which employs the genetically engineered E.coli to produce short hairpin RNA and then deliver it into mammalian cells. The shRNA， transcribed by the genetically engineered E.coli， can target and silence the particular gene expression in mammalian cells. We used RecA homologous recombination to quickly integrate working components of TkRNAi into the chromosome DNA of engineered E.coli， thus yielding trans-kingdom interference bacteria. Acridine orange staining tests demonstrated that the trans-kingdom interference bacteria could invade into mammalian cells. Finally， western blot analysis results showed that the trans-kingdom interference bacteria could silence expression of target genes. The improvement of the TkRNAi technology will further promote the development and utilization of this kind of engineering bacteria.

Key words siRNA delivery； trans-kingdom RNAi bacteria； RNAi； RecA homologous recombination

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是由小干擾RNA（small interference RNA， siRNA）引起的細(xì)胞內(nèi)序列特異性基因沉默，這給惡性腫瘤等疾病的治療帶來(lái)了新的希望[1].然而，siRNA的低血清穩(wěn)定性、易脫靶性和易引起免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)，也給臨床應(yīng)用帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)[2].此外，鑒于siRNA自身的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其不能直接穿過(guò)細(xì)胞膜，因此找到一種穩(wěn)定、安全和有效的siRNA傳遞方式十分重要[3].

“跨界基因沉默”技術(shù)利用工程菌攜帶短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA， shRNA），將shRNA傳遞至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，引發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特定基因的沉默.這種新型siRNA傳遞技術(shù)的出現(xiàn)在某種程度上彌補(bǔ)了RNA干擾藥物的傳遞困境，具有成為臨床藥物載體的潛力[4-6].“跨界基因沉默”技術(shù)由向雙林等提出[7]，其基本流程為：首先構(gòu)建跨界干擾質(zhì)粒 （Trans-kingdom RNAi plasmid， TRIP） pT7-RNAi-inv-hly.該質(zhì)粒上的inv基因，其表達(dá)產(chǎn)物為Invasin蛋白，能與表皮細(xì)胞膜上表達(dá)的β1-整合蛋白 （β1-integrin） 結(jié)合，促使細(xì)胞內(nèi)陷并吞噬附著于該區(qū)域的細(xì)菌；hly基因，其表達(dá)產(chǎn)物為分泌蛋白LLO，使細(xì)菌能夠從細(xì)胞內(nèi)體中逃離[8-9].將TRIP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BL21（DE3））內(nèi)，最后將轉(zhuǎn)化TRIP的BL21（DE3）侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮RNAi作用[7， 10].然而，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后游離于細(xì)菌的胞質(zhì)中，在無(wú)抗性的條件下，質(zhì)粒容易因環(huán)境壓力而丟失，不利于質(zhì)粒穩(wěn)定存在并表達(dá)shRNA.若能使跨界基因沉默技術(shù)更加穩(wěn)定方便，將有利于拓展跨界基因沉默技術(shù)的使用范圍[11].本研究對(duì)跨界基因沉默技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，將TRIP的工作元件整合到BL21（DE3）的基因組中，改進(jìn)后的整合型菌株克服了質(zhì)粒易丟失的缺點(diǎn)，且菌株的保存與使用比質(zhì)粒更方便.endprint

在原核生物中，由RecA介導(dǎo)的同源重組技術(shù)已經(jīng)很成熟[12-14].RecA蛋白在細(xì)菌中廣泛存在且高度保守，在細(xì)菌的同源重組途徑中起著重要的作用.RecA同源重組系統(tǒng)可介導(dǎo)1 000 bp長(zhǎng)同源序列的同源重組，利用大腸桿菌依賴(lài)的RecA蛋白重組系統(tǒng)，可以對(duì)大腸桿菌基因組進(jìn)行修飾和基因替換等改造[15-16].

本研究以BL21（DE3） 基因組中的lac Z為模板，克隆出一段長(zhǎng)2 027 bp的序列，將其作為lac Z的同源序列插入到TRIP中，構(gòu)建出環(huán)狀整合型跨界基因沉默質(zhì)粒（Cyclic Integrated Trans-kingdom RNAi plasmid， CI-TRIP）.CI-TRIP無(wú)須線性化即可快速將TRIP上的工作元件整合入BL21（DE3） 基因組中，實(shí)現(xiàn)對(duì)BL21（DE3） 基因組的改造.隨后利用CI-TRIP構(gòu)建了跨界基因沉默菌株，并檢測(cè)該菌株侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞SW480的能力以及對(duì)SW480細(xì)胞中特定基因的干擾能力.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

E.coli BL21（DE3），E.coli，GBpir菌，質(zhì)粒TRIP，質(zhì)粒pR6k及質(zhì)粒pCre等為本實(shí)驗(yàn)室保存；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株 （SW480） 為本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞株；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于東盛生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶Pci Ⅰ，限制性核酸內(nèi)切酶NgoM Ⅳ，限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ，限制性核酸內(nèi)切酶Sal Ⅰ和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB；Anti-LLO antibody，Anti-GAPDH antibody和Anti-β-catenin antibody購(gòu)于武漢博士德公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)于Santa Cruz公司；氯霉素、氨芐青霉素鈉、4%多聚甲醛、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、氯化鈉、硼酸、瓊脂糖、酵母提取物等購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；吖啶橙購(gòu)于Sigma公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于Merck Millipore公司.培養(yǎng)細(xì)胞所用的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)狀整合型跨界基因沉默質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pR6k為模板，用引物R6k F1和R6k R1擴(kuò)增出oriR6k-cm（cm代表氯霉素抗性基因）片段，在氯霉素抗性基因兩側(cè)設(shè)計(jì)同方向的LoxP72位點(diǎn)；以BL21（DE3） 基因組為模板，用引物lac F1和N-lac R1擴(kuò)增出lac Z的重組片段.兩者的PCR產(chǎn)物分別用膠回收試劑盒純化，測(cè)定濃度后于-20 ℃保存?zhèn)溆?將oriR6k-cm片段和lac Z重組片段等量混合，以此混合物為模板，以R6k F1，N-lac R1為引物擴(kuò)增出oriR6k-cm-lac Z基因片段.引物序列如表1所示.

將TRIP中的基因片段hly-inv用Pci Ⅰ和NgoM Ⅳ雙酶切，回收hly-inv基因片段；再用相同的酶剪切oriR6k-cm-lac Z，然后將這兩部分連接.將連接產(chǎn)物用熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GBpir菌，用含氯霉素抗性（終濃度為15 mg/L）的固體培養(yǎng)基篩選，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第二天挑單克隆擴(kuò)增，用菌落PCR初篩，之后提取陽(yáng)性菌落中的質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證，最后將驗(yàn)證為陽(yáng)性的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序.將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為CI-TRIP，即帶有hly-inv基因的環(huán)狀整合型跨界基因沉默質(zhì)粒.

1.2.2 CI-TRIP整合到跨界基因沉默菌株基因組 取CI-TRIP加到BL21（DE3） 中，用熱轉(zhuǎn)化法處理，置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng).第二天從固體培養(yǎng)基中挑取單克隆重組子，接種于1.5 mL離心管中，離心管先用無(wú)菌針頭在管蓋上戳一個(gè)小孔，并加1.0 mL帶氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基.最后將離心管放在恒溫?fù)u床上，37 ℃，1 000 r/min培養(yǎng)12～16 h.將重組子菌液做模板，用PCR初篩，inv的引物如表1所示，將陽(yáng)性重組子菌液復(fù)壯，第二次PCR篩檢用相同的引物，以細(xì)菌基因組DNA為模板.PCR條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，循環(huán)30次；72 ℃后延伸7 min.將陽(yáng)性菌落的菌液加入甘油管中，于-80 ℃保種.

1.2.3 細(xì)菌基因組中抗性基因的敲除 構(gòu)建CI-TRIP時(shí)，筆者已在氯霉素抗性基因兩側(cè)設(shè)計(jì)了同方向的LoxP72位點(diǎn)，因此可用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)來(lái)刪除抗性基因.取1 mL細(xì)菌復(fù)壯后，加1 μL pCre質(zhì)粒到管中，混勻后轉(zhuǎn)移到2 mm電擊杯中.電壓為2.5 kV，5.0 ms電擊一次.電擊轉(zhuǎn)化后，37 ℃，250 r/min復(fù)蘇1 h.將菌液沉淀濃縮至100 μL，涂到氯霉素/氨芐青霉素雙固體培養(yǎng)基上，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng).長(zhǎng)出單克隆后，挑取接種到含氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)2 h，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h.將菌液分別接種到無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基和氯霉素固體培養(yǎng)基，進(jìn)行雙固體培養(yǎng)基對(duì)照檢測(cè).選取無(wú)抗性的菌落，以inv c1f/inv c1r為引物做菌落PCR.以菌落PCR為陽(yáng)性結(jié)果的細(xì)菌基因組DNA做模板，用引物inv c1f/inv c1r和cm f/cm r（引物序列如表1所示）進(jìn)行第二次PCR驗(yàn)證，inv c1f/inv c1r擴(kuò)增為陽(yáng)性而cm f/cm r擴(kuò)增為陰性的菌落即為抗性敲除成功的跨界基因沉默菌株.將此菌液復(fù)壯，當(dāng)OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)，按500 μL/管分裝于甘油管內(nèi)，-80 ℃保種待用.

1.2.4 Western blot檢測(cè)跨界沉默菌株中LLO蛋白的表達(dá) 從固體培養(yǎng)基上挑單克隆接種到LB培養(yǎng)液中，過(guò)夜培養(yǎng).將菌液離心后收集上清到新管中.用TCA-丙酮沉淀法提取LLO分泌蛋白，根據(jù)沉淀量加入SDS裂解液，-20 ℃保存?zhèn)溆?用Western blot檢測(cè)LLO的表達(dá)情況，取50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為10%，電壓為100 V；轉(zhuǎn)PVDF膜，恒電流400 mA，時(shí)間為80 min.用5%脫脂奶粉封閉，孵育LLO蛋白質(zhì)的一抗（1∶ 2 000）.洗去一抗，孵育HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶ 2 000），最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，并用Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.endprint

1.2.5 吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)菌侵染SW480細(xì)胞的能力 在6孔板中放入玻璃蓋玻片，將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于孔板內(nèi)，用于細(xì)胞爬片.之后置于37 ℃，5%CO2，90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).從固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇細(xì)菌進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn).經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2 h后，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)到OD600=1.0時(shí)終止培養(yǎng)，取出菌株用于侵染SW480細(xì)胞.用無(wú)血清、無(wú)抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)菌2次，最后用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，完全混勻.根據(jù)實(shí)驗(yàn)中需要的MOI值（細(xì)胞與細(xì)菌的比值） （1∶ 500/1∶ 1 000/1∶ 1 500） 稀釋細(xì)菌.準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)菌侵染試驗(yàn)前0.5 h，先將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成無(wú)血清、無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，0.5 h后，加入含有細(xì)菌的培養(yǎng)液，輕搖培養(yǎng)板使細(xì)菌均勻分布.1.5～4 h后去除含細(xì)菌的培養(yǎng)基，加入含慶大霉素的培養(yǎng)基，用以殺死細(xì)胞外的細(xì)菌.將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定液固定處理，PBS洗滌后在搖床上輕搖.用通透液（V丙酮∶ V甲醇=1∶ 1）處理30 s，再用PBS洗滌.用0.01%吖啶橙工作液以1 mL/孔加入孔板中，染色45 s，立即用PBS沖洗.用濾紙吸去多余的水，然后用封閉膠水將玻璃片封閉固定，最后用激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss LSM710）觀察拍照，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.2.6 跨界基因沉默菌株BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1的構(gòu)建 利用1.2.1的質(zhì)粒CI-TRIP快速構(gòu)建跨界基因沉默菌株BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1.目標(biāo)基因CTNNB1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)干擾序列為，sense： CACCGGATGTGGATACCTCCCAAGTCGAAACTTGGGAGGTATCCACATCC； antisense： AAAAGGATGTGGATACCTCCCAAGTTT-CGACTTGGGAGGTATCCACATCC.將這兩段干擾序列合成后，95℃1 min，37℃1 h退火，將CI-TRIP質(zhì)粒用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切，最后將干擾序列與CI-TRIP質(zhì)粒連接.經(jīng)測(cè)序，連接正確的質(zhì)粒就是BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1.取1 μL CI-TRIP-CTNNB1加入BL21（DE3）感受態(tài)中，獲得重組菌.重組菌的鑒定方法同1.2.3.用Western blot檢測(cè)跨界基因沉默菌株BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1的干擾能力，ImageJ軟件分析目的條帶的光密度值.采用t-檢驗(yàn)判斷實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間均值的差異顯著性，顯著水平定為P<0.05.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 同源臂擴(kuò)增及環(huán)形跨界整合質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

首先，擴(kuò)增出同源臂片段，如圖1所示.以質(zhì)粒pR6k為模板，用引物擴(kuò)增出oriR6k-cm片段，其長(zhǎng)度為1 487 bp（圖1A）；以BL21（DE3） 基因組為模板，用引物擴(kuò)增出lac Z的重組片段，其長(zhǎng)度為2 129 bp（圖1B）.將兩者的PCR產(chǎn)物分別用膠回收試劑盒回收，然后將兩種產(chǎn)物等量混合，以此混合物為模板，PCR擴(kuò)增出oriR6k-cm-lac Z基因片段，其長(zhǎng)度為3 493 bp（圖1C）.再將CI-TRIP和oriR6k-cm-lac Z基因片段分別用Pci Ⅰ和NgoM Ⅳ雙酶切，將兩者的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入GBpir菌.然后提取陽(yáng)性菌落中的質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖1D）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)形跨界基因沉默整合質(zhì)粒被成功構(gòu)建，并被命名為CI-TRIP.

2.2 利用CI-TRIP構(gòu)建跨界基因沉默菌株

將CI-TRIP轉(zhuǎn)進(jìn)BL21（DE3），用引物inv c1f/inv c1r進(jìn)行菌落PCR初篩.如圖2A中的1，2，3，4，7，8，11，13，14，15，16，19，20，23號(hào)菌液擴(kuò)增出1 563 bp的鑒定條帶，因?yàn)閕nv是跨界基因沉默質(zhì)粒元件中的一段序列，對(duì)于改造后的BL21（DE3） 而言，這是一個(gè)外源的基因，能用菌落PCR擴(kuò)增出inv的目的條帶，說(shuō)明這些菌經(jīng)CI-TRIP已將其他元件也整合到其染色體上了.為了確認(rèn)這些菌是否確實(shí)為陽(yáng)性，筆者將上述部分陽(yáng)性菌液作為候選菌株繼續(xù)培養(yǎng)，并提取基因組DNA，然后用相同引物進(jìn)行第二輪PCR.如圖2B所示，7個(gè)泳道都有目的條帶，且條帶的大小和位置正確.通過(guò)兩輪PCR驗(yàn)證，跨界基因沉默菌株已構(gòu)建成功.

2.3 Cre重組酶刪除抗性基因及驗(yàn)證

雖然跨界基因沉默菌株已經(jīng)構(gòu)建成功，但是菌株的基因組上還含有質(zhì)粒上的抗性基因，因此要?jiǎng)h除整合到染色體上的抗性基因，使其成為安全的siRNA傳遞載體.通過(guò)Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)刪除抗性基因后，跨界基因沉默菌株有可能同時(shí)丟失已整合的inv-hly工作元件.將只在無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行菌落PCR，如圖3A中泳道5，10所示，工作元件已丟失；而泳道1，2，3，4，6，7，8，9為刪除抗性基因后，工作元件仍然存在，為陽(yáng)性菌.取部分陽(yáng)性菌進(jìn)一步做PCR驗(yàn)證，提取細(xì)菌的基因組DNA，并用引物inv c1f/inv c1r和cm f/cm r進(jìn)行PCR檢測(cè)，若在這一輪PCR篩選中引物inv c1f/inv c1r擴(kuò)增產(chǎn)物為陽(yáng)性而cm f/cm r擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性，則說(shuō)明跨界基因沉默作用元件已穩(wěn)定整合到該菌株的基因組染色體上，而抗性基因cm被成功刪除.如圖3B所示，泳道1，2，3，4都有目的條帶，說(shuō)明工作元件未丟失.如圖3C所示，泳道1，2，3，4都無(wú)目的條帶，說(shuō)明抗性基因刪除成功，泳道p為陽(yáng)性對(duì)照，圖3B和3C中編號(hào)相同的泳道其模板來(lái)源相同.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗性基因cm已經(jīng)成功被刪除.

2.4 檢測(cè)跨界基因沉默菌株中LLO蛋白的表達(dá)

跨界基因沉默菌株的基因組DNA整合了TRIP中的hly和inv基因，為了檢測(cè)上述整合進(jìn)細(xì)菌基因組的跨界干擾元件能否正常工作，筆者通過(guò)Western blot和侵染實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證.endprint

首先，通過(guò)Western blot檢測(cè)跨界基因沉默菌株是否能夠穩(wěn)定表達(dá)hly基因的編碼產(chǎn)物L(fēng)LO蛋白.如圖4所示，BL21（DE3） 為空載對(duì)照，TRIP為含TRIP質(zhì)粒的BL21（DE3），B-CI-TRIP為已將跨界基因沉默質(zhì)粒整合到基因組且刪除抗性基因的BL21（DE3）.結(jié)果表明跨界基因沉默菌株能正常表達(dá)LLO蛋白.

2.5 跨界基因沉默菌株侵染細(xì)胞的能力

其次，用侵染實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)跨界基因沉默菌株是否能穩(wěn)定表達(dá)inv基因，從而有入侵細(xì)胞的能力.吖啶橙能透過(guò)細(xì)胞膜，并與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，在藍(lán)光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光.如圖5（彩圖見(jiàn)封三）所示，SW480細(xì)胞內(nèi)最大的綠色熒光團(tuán)為細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)處有許多綠色小亮斑即為入侵的細(xì)菌.用空載細(xì)菌檢測(cè)侵染細(xì)胞的能力，可見(jiàn)SW480細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有入侵的細(xì)菌，由此可知，空載菌不能侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（圖5A）.在相同處理?xiàng)l件下，用攜帶了跨界基因沉默整合元件的菌株去侵染細(xì)胞，SW480細(xì)胞質(zhì)中有入侵的細(xì)菌（圖5B）.以上結(jié)果表明，筆者構(gòu)建的跨界基因沉默菌株具有入侵哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力.

2.6 跨界基因沉默菌株干擾靶基因的能力

用1.2.6中的方法，構(gòu)建干擾CTNNB1基因的跨界基因沉默菌株，將其命名為BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1.將構(gòu)建好的跨界基因沉默菌株侵染SW480細(xì)胞，然后用Western blot來(lái)檢測(cè)此跨界基因沉默菌株對(duì)細(xì)胞中靶基因的干擾能力.結(jié)果如圖6所示，跨界基因沉默菌株BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1能在48 h和72 h顯著下調(diào)SW480細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)，將β-catenin的表達(dá)量分別降至NC組（不用細(xì)菌處理細(xì)胞）的76.3%（P<0.01）和61.3%（P<0.05）.這表明跨界基因沉默菌株可攜帶shRNA，并能抑制哺乳細(xì)胞中目的基因的表達(dá).

3 討論

RNAi是一種由雙鏈RNA引起的基因沉默現(xiàn)象，能抑制靶基因的表達(dá)，具有特異性和高效等優(yōu)點(diǎn).對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，要使外源的siRNA起基因沉默作用，siRNA的傳遞成為限制RNAi技術(shù)發(fā)展的瓶頸之一，更限制了特異性干擾作用應(yīng)用于臨床藥物開(kāi)發(fā).向雙林等在2006年提出了“跨界基因沉默”技術(shù)，利用基因工程改造后的工程細(xì)菌攜帶shRNA侵染細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)釋放shRNA的特點(diǎn)，使RNAi的運(yùn)用不再因傳遞的問(wèn)題而被限制.但是TRIP轉(zhuǎn)入大腸桿菌后容易因環(huán)境壓力而丟失，從而喪失跨界基因沉默的功能.如果能使質(zhì)粒整合到跨界基因沉默菌株的基因組內(nèi)，那么跨界基因沉默系統(tǒng)會(huì)變得更加穩(wěn)定方便，這也將有利于拓展跨界基因沉默技術(shù)的使用范圍.將來(lái)可以把益生菌改造成“跨界基因沉默”菌株，當(dāng)人們飲用這種益生菌到腸道后，它不僅對(duì)身體有益，還能發(fā)揮RNAi作用，這種一舉兩得的方式將使得臨床治療變得更為便捷.

基于以上考慮，筆者對(duì)跨界基因沉默技術(shù)進(jìn)行完善.首先運(yùn)用傳統(tǒng)分子克隆的方法構(gòu)建環(huán)形跨界基因沉默整合質(zhì)粒 （CI-TRIP），然后通過(guò)RecA介導(dǎo)的同源重組將CI-TRIP上的跨界基因沉默元件成功地整合到大腸桿菌 （BL21-DE3） 的基因組中，并通過(guò)Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)刪除跨界基因沉默菌株基因組中的抗性基因.隨后利用Western blot和細(xì)菌侵染實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)跨界基因沉默菌株中基因組的跨界干擾元件是否能正常工作.結(jié)果表明，抗性刪除的基因沉默菌株不僅能穩(wěn)定表達(dá)LLO蛋白，而且具有細(xì)胞侵染的能力.

為了驗(yàn)證構(gòu)建出的基因沉默菌株是否能在細(xì)胞中發(fā)揮其基因沉默作用，筆者對(duì)跨界基因沉默菌株進(jìn)行了功能檢測(cè)：以CTNNB1基因做為靶標(biāo)，用環(huán)形跨界基因沉默整合質(zhì)粒構(gòu)建了BL21（DE3）-TRIP-CTNNB1跨界基因沉默菌株，此菌株帶有能引起CTNNB1基因沉默的shRNA序列.將干擾菌株侵染細(xì)胞后，用Western blot來(lái)檢測(cè)菌株對(duì)靶標(biāo)基因的干擾作用.結(jié)果表明，跨界基因沉默菌株可通過(guò)傳遞shRNA抑制細(xì)胞中目的基因的表達(dá).

在本研究中，改良后的跨界基因沉默整合菌株解決了載體細(xì)菌中質(zhì)粒容易丟失的缺點(diǎn)，提高了跨界沉默菌株的穩(wěn)定性，同時(shí)表現(xiàn)出無(wú)抗性的特點(diǎn)，而且還能有效地沉默細(xì)胞中靶基因，這使跨界基因沉默技術(shù)的使用變得更方便.在今后的研究中，筆者還將對(duì)跨界基因沉默技術(shù)進(jìn)一步改造，使該菌株真正成為既能治療疾病又對(duì)人體無(wú)害的工程菌.

參考文獻(xiàn)：

[1] LARES M R， ROSSI J J， OUELLET D L. RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications[J]. Trends Biotechnol， 2010，28（11）：570-579.

[2] KIM S H. Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer[J]. J Control Rel， 2008，129（2）：107-116.

[3] HONG C A， NAM Y S. Functional nanostructures for effective delivery of small interfering RNA therapeutics[J]. Theranostics， 2014，4（12）：1211-1232.

[4] AIGNER A. Transkingdom RNA interference （tkRNAi） as a new delivery tool for therapeutic RNA[J]. Expert Opin Biol Ther， 2009，9（12）：1533-1542.endprint

[5] NGUYEN T A， FRUEHAUF J H. Transkingdom RNA interference （tkRNAi）： a novel method to induce therapeutic gene silencing[J]. Methods Mol Biol， 2009，514：27-34.

[6] GRILLOT C C. Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells[J]. Nat Biotechnol， 1998，16（9）：862-866.

[7] XIANG S L， FRUEHAUF J， LI C J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals[J]. Nat Biotechnol， 2006，24（6）：697-702.

[8] MATHEW E. Cytosolic delivery of antisense oligonucleotides by listeriolysin O-containing liposomes[J]. Gene Ther， 2003，10（13）：1105-1115.

[9] HEUCK A P. Mechanism of membrane insertion of a multimeric beta-barrel protein： perfringolysin O creates a pore using ordered and coupled conformational changes[J]. Mol Cell， 2000，6（5）：1233-1242.

[10] XIANG S L， KEATES A C， FRUEHAUF J， et al.. In vitro and in vivo gene silencing by Transkingdom RNAi （tkRNAi）[J]. Methods Mol Biol， 2009，487：147-160.

[11] LAGE H， KRUHN A. Bacterial delivery of RNAi effectors： transkingdom RNAi[J]. J Vis Exp， 2010（42）：e2099.DOI：10.3791/2099.

[12] YADAV T. Roles of bacillus subtilis DprA and SsbA in RecA-mediated genetic recombination[J]. J Biol Chem， 2014，289（40）：27640-27652.

[13] CHEN Z， YANG H， PAVLETICH N P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures[J]. Nature， 2008，453（7194）：489-494.

[14] LIN Z. Origins and evolution of the recA/RAD51 gene family： Evidence for ancient gene duplication and endosymbiotic gene transfer[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2006，103（27）：10328-10333.

[15] 戴 倩，田 云，盧向陽(yáng). 同源重組介導(dǎo)的克隆策略研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）， 2011（6）：7-9，13.

[16] 楊獻(xiàn)偉，楊瑞馥，崔玉軍. 細(xì)菌基因組同源重組：量化與鑒定[J]. 遺傳， 2016（2）：137-143.endprint