• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甜菜夜蛾卵黃原蛋白多克隆抗體制備及其在不同發(fā)育時(shí)期蛋白表達(dá)

    2017-11-28 01:42:52趙靜孫洋譚永安肖留斌姜義平柏立新
    關(guān)鍵詞:羽化甜菜夜蛾

    趙靜,孫洋,譚永安,肖留斌,姜義平,柏立新

    ?

    甜菜夜蛾卵黃原蛋白多克隆抗體制備及其在不同發(fā)育時(shí)期蛋白表達(dá)

    趙靜,孫洋,譚永安,肖留斌,姜義平,柏立新

    (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,南京 210014)

    制備甜菜夜蛾()卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗體,并檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期血淋巴中的Vg蛋白表達(dá)量變化,為進(jìn)一步研究Vg轉(zhuǎn)運(yùn)與利用機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲cDNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到甜菜夜蛾基因片段,其包含vitellogenin-N結(jié)構(gòu)功能區(qū)。將目的片段連入pMD-19T載體后進(jìn)行測(cè)序,利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準(zhǔn)確性及編碼蛋白的特性。將測(cè)序正確的基因片段通過(guò)I和I限制性內(nèi)切酶連接到原核表達(dá)載體pCzn1。將重組表達(dá)載體pCzn1-轉(zhuǎn)入大腸桿菌ArcticExpress,離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液,超聲波破碎菌體沉淀,取上清液與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),分析Vg重組蛋白的可溶性。在不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)Vg重組蛋白,篩選最優(yōu)表達(dá)條件。經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析柱純化得到了Vg重組蛋白,將該蛋白免疫新西蘭白兔,制備兔抗Vg血清抗體。采用間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體的效價(jià),并通過(guò)Western blot法檢測(cè)甜菜夜蛾雌蟲不同發(fā)育階段血淋巴中Vg蛋白的表達(dá)差異。擴(kuò)增所得基因片段為2 091 bp,編碼697個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白分子量為80.88 kD。通過(guò)大腸桿菌表達(dá)出的Vg重組蛋白相對(duì)分子量為80 kD,其大小與預(yù)期的Vg重組蛋白帶大小相符合。其主要以包涵體形式表達(dá),而在上清中表達(dá)量不明顯。不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)Vg重組蛋白的結(jié)果顯示溫度為25℃,IPTG濃度為0.6 mmol·L-1時(shí),Vg重組蛋白表達(dá)量最高。繼續(xù)提高溫度和IPTG濃度,對(duì)提高Vg重組蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯作用,且雜蛋白增多。新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后,間接ELISA法檢測(cè)表明,制備的兔抗Vg抗體具有較好的靈敏度,效價(jià)達(dá)到 1﹕512 000。Western blot檢測(cè)Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達(dá),其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期開始微弱表達(dá)。雌成蟲羽化后血淋巴中Vg蛋白表達(dá)量先升高后降低,呈動(dòng)態(tài)變化,到羽化48 h表達(dá)量最高,隨后降低。純化獲得了Vg重組蛋白,并明確了最優(yōu)表達(dá)條件(溫度為25℃,IPTG濃度為0.6 mmol·L-1);制備了高效價(jià)的甜菜夜蛾Vg多克隆抗體,明確了甜菜夜蛾Vg蛋白的表達(dá)規(guī)律。

    甜菜夜蛾;卵黃原蛋白基因;原核表達(dá);抗體制備;表達(dá)模式

    0 引言

    【研究意義】甜菜夜蛾()屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是一種世界性分布的多食性重要害蟲,可嚴(yán)重危害多種重要經(jīng)濟(jì)作物[1-2]。近年來(lái),由于蔬菜、Bt棉等適生性蟲源寄主種植面積的擴(kuò)大等因素,中國(guó)暴發(fā)頻度呈上升趨勢(shì)。其暴發(fā)的主要原因是繁殖能力強(qiáng)及較高的抗藥性[3-4]。目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于甜菜夜蛾的生殖生理研究還很薄弱,僅在生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與發(fā)育分級(jí)方面有部分報(bào)道[5-6]。卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成與卵黃的沉積是卵形成的關(guān)鍵因素,其含量直接影響雌成蟲產(chǎn)卵潛力。通過(guò)開展甜菜夜蛾卵黃發(fā)生的研究,可充分揭示甜菜夜蛾成蟲大量產(chǎn)卵的內(nèi)在規(guī)律,對(duì)該蟲害種群測(cè)報(bào)與防治具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】在大部分昆蟲中,Vg是卵黃蛋白的前體,它由雌性脂肪體在激素的調(diào)控下合成,分泌到血淋巴,被卵母細(xì)胞通過(guò)卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor,VgR)調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用所攝取,經(jīng)修飾、切除、加工后以晶體形式沉積為卵黃磷蛋白(vtellin,Vt)。迄今,有關(guān)昆蟲的分子特性、功能、卵黃發(fā)生的時(shí)間動(dòng)態(tài)以及卵黃發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)理等已有許多研究,涉及的昆蟲包括11目80余種[7-15]。不同昆蟲類群或同一昆蟲類群不同種類的個(gè)體,Vg合成與攝取的時(shí)間并不相同,這一性質(zhì)決定了昆蟲卵黃發(fā)生的時(shí)間差異。在鱗翅目中,對(duì)于成蟲不取食的蛾類,Vg合成啟動(dòng)在末齡幼蟲、預(yù)蛹或蛹初期,如舞毒蛾()始于末齡幼蟲[16];天蠶()始于結(jié)繭的預(yù)蛹期[17];而對(duì)于成蟲取食的蛾類,Vg合成和啟動(dòng)在蛹末期或成蟲期,如斜紋夜蛾()[15]和美洲棉鈴蟲()[17]。隨著RNA干擾技術(shù)的發(fā)展,已有研究表明Vg不僅為胚胎發(fā)生提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),它在生物體內(nèi)還具有氣候適應(yīng)、激活卵巢、生殖競(jìng)爭(zhēng)、行為構(gòu)建、延長(zhǎng)壽命、轉(zhuǎn)化食物、抗氧化、傳播病毒等其他的功能[18-20]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】昆蟲Vg的功能為人們利用或抑制昆蟲提供了新思路,在前期研究中甜菜夜蛾序列已克隆得到,但甜菜夜蛾Vg蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收機(jī)制以及生物學(xué)功能尚不明確。目前,研究Vg含量的動(dòng)態(tài)變化主要采用免疫印跡方法,因此制備Vg抗體是研究的關(guān)鍵?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期獲得卵黃原蛋白全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)分離純化特異性肽鏈,制備其多克隆抗體,并通過(guò)Western blot分析甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期Vg含量的動(dòng)態(tài)變化,揭示其卵黃發(fā)生規(guī)律,為在蛋白水平上進(jìn)一步研究甜菜夜蛾Vg轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    試驗(yàn)于2016年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

    1.1 材料

    供試甜菜夜蛾蟲源來(lái)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物蟲害研究室。甜菜夜蛾飼養(yǎng)條件為溫度(26.5±1)℃,相對(duì)濕度(65±5)%,光周期 L﹕D=14 h﹕10 h,成蟲期補(bǔ)充10%蜂蜜水。

    1.2 方法

    1.2.1 Vg表達(dá)引物設(shè)計(jì)與序列擴(kuò)增 根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表的甜菜夜蛾的全長(zhǎng)序列[21](GenBank登錄號(hào):KT599434),設(shè)計(jì)含有I和I酶切位點(diǎn)的特異性引物。用于擴(kuò)增的特異性片段,包含 Vitellogenin-N 結(jié)構(gòu)區(qū)。引物由上海生工合成。正向引物序列為:5′-GGGTTTCATATGTG GCAAACTGGCAAACT-3′,反向引物序列:5′-CTCTA GAAATTCCACTCTTGATAGC-3′。采用Trizol reagent(Invitrogen)提取羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲(從破蛹而出開始計(jì)算羽化時(shí)間)總RNA,用M-MLV酶(Promega)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA為模板用特異性引物擴(kuò)增特異性片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 3 min,然后按照 94℃ 45 s,55℃ 30 s,72℃ 120 s,進(jìn)行 30 次循環(huán)反應(yīng),最后于 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,并通過(guò)膠回收試劑盒(Axygen)純化回收目的DNA片段。目的片段與pMD-19T 載體(TaKaRa)連接,經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性克隆后,送上海生工測(cè)序。利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準(zhǔn)確性及預(yù)測(cè)編碼蛋白的大小。重組載體命名為 pMD19T-。

    1.2.2 Vg原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶I和I酶(TaKaRa)雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和空pCzn1載體(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室保存),回收目的片段及表達(dá)載體,經(jīng)T4 DNA連接酶(TaKaRa)連接,16℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ArcticExpress(北京華越洋),在含有氨芐青霉素(Amp)的平板上抗性篩選培養(yǎng),通過(guò)酶切及PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆,并將確認(rèn)為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序,分析是否為目的片段序列,將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 pCzn1-。

    1.2.3Vg重組蛋白的可溶性分析及表達(dá)條件的優(yōu)化 接種鑒定正確的重組子于含有50 μg·ml-1Amp的 3 ml LB 液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日,1﹕100轉(zhuǎn)接于30 ml LB(含Amp)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),至 OD600值為0.5時(shí),加入IPTG分別調(diào)至終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1,于37℃、200 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4 h后收集1 ml菌液,6 000 r/min離心10 min,棄上清,用PBS重懸菌體沉淀;超聲波破碎菌體沉淀并離心,取上清液與沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)分析Vg 重組蛋白的可溶性及最適的 IPTG 濃度。在最適的IPTG終濃度進(jìn)行溫度優(yōu)化,將誘導(dǎo)溫度分別調(diào)整至 20、25、30和 35℃,根據(jù)Vg重組蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果確定誘導(dǎo)最佳溫度。

    1.2.4 Vg包涵體蛋白的制備和純化 在最適 IPTG 濃度和溫度條件下進(jìn)行 Vg目的蛋白大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液在低溫4℃條件下,60 000 r/min離心10 min,菌體沉淀與20 ml裂解buffer(包含20 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1PMSF和細(xì)菌蛋白酶抑制劑cocktail混合液,pH 8.0)重懸,重懸液進(jìn)行超聲破碎(功率 400 W,工作 4 s,間歇8 s,共20 min);將超聲破碎的細(xì)胞裂解液4℃10 000×離心20 min,收集沉淀;使用包涵體洗滌液(20 mmol·L-1Tris,1 mmol·L-1EDTA,2 mol·L-1尿素,1 mol·L-1NaCl,1% Triton X-100,pH 8.0)洗滌包涵體3次;用溶解緩沖液(20 mmol·L-1Tris,5 mmol·L-1DTT,8 mol·L-1尿素pH 8.0),按一定比例溶解包涵體,4℃放置過(guò)夜。利用低壓層析系統(tǒng),包涵體溶液以0.5 ml·min-1流速上樣至Ni-IDA親和層析柱(Novagen),用Ni-IDA緩沖液洗脫目的蛋白,收集洗脫液。將洗脫液裝入透析袋,于4℃經(jīng)0.01 mol·L-1PBST 溶液(pH 8.0)透析過(guò)夜后獲得 Vg純化蛋白。采用 12% SDS-PAGE檢測(cè)Vg重組蛋白的純度。

    1.2.5 Vg多克隆抗體的制備 取純化的Vg重組蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定,免疫2只新西蘭白兔(2—2.5 kg)(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供),進(jìn)行皮下注射,每次免疫量為 400 μg,2—3周免疫一次,共免疫 4 次。第4次免疫后在大白兔頸動(dòng)脈采血,8 000 r/min 離心8 min所得上清制備抗血清并準(zhǔn)備純化抗體。將Vg蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱,將PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣,待抗體抗原結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體,并在PBS緩沖液中進(jìn)行4℃透析過(guò)夜,隔日進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

    1.2.6 效價(jià)測(cè)定 用間接ELISA法對(duì)抗體進(jìn)行最終的效價(jià)測(cè)定。以純化的Vg蛋白(5 μg·mL-1)包被ELISA 板,混勻后加入板條中,每孔加入100 μL,4℃過(guò)夜。用PBST(0.2 g KCl,0.2 g KH2PO4,2.9 g Na HPO4·12H2O,8 g NaCl,0.05% Tween-20,pH 7.4)洗滌3次,每次5 min后,加入封閉液(含5%牛血清白蛋白的PBST)于37℃封閉2 h。取出酶標(biāo)板,棄去內(nèi)液,用PBST洗板3次,加入用PBST連續(xù)倍比稀釋(500×20—500×210)的Vg多克隆抗體和陰性血清(免疫前健康兔血清)每孔100 μl,37℃恒溫箱1 h。同上洗滌后,加入100 μl的用PBST以1﹕5 000稀釋的二抗HRP-IgG,37℃放置 1 h。用PBST洗板3次,每次5 min,最后加 100 μl TMB 底物液顯色,37℃顯色15 min,待終止反應(yīng)后,酶標(biāo)儀測(cè)定 A450值。

    1.2.7 多克隆抗體檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴Vg含量 采用背血管取血淋巴法[15,22],用定量玻璃毛細(xì)管直接插入甜菜夜蛾胸部背血管,收集甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期(化蛹1—7 d的雌蛹,羽化0、12、24、48、60、72 h的雌成蟲)血淋巴樣品。甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期的血淋巴樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)取自5頭試蟲,每頭試蟲定量吸取1 μl血淋巴,共5 μl。每個(gè)樣品用PBS溶液稀釋100 倍,上樣 10 μl,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)印 PVDF 膜后,取下膜先用 PBST 洗滌 4 次,每次5 min,然后將膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉液置于37℃封閉 1 h,加入用 PBST 以1﹕5 000稀釋比例的一抗(上述制備的Vg多克隆抗體),膜在一抗稀釋液中4℃過(guò)夜。次日將膜取出后,用PBST洗膜4次,每次5 min。用PBST以1﹕5 000的比例稀釋二抗HRP-IgG(上海生工),膜在二抗中37℃反應(yīng) 1 h。反應(yīng)完畢后,把膜取出置于干凈的盒子中用PBST洗膜 4次,ECL顯影,曝光。

    2 結(jié)果

    2.1 甜菜夜蛾Vg片段的擴(kuò)增和克隆

    以羽化24 h的甜菜夜蛾成蟲cDNA為模板,用加酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,呈現(xiàn)一條大小與預(yù)期相吻合的目的DNA條帶,約為2 091 bp(圖 1)。將此特異性條帶切膠回收,連接到pMD-19T載體,并挑斑鑒定。同時(shí),測(cè)序克隆載體也驗(yàn)證了序列的正確性。序列長(zhǎng)度 2 091 bp,編碼 697 個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量為 80.88 kD。

    1:PCR 產(chǎn)物PCR product;M:DL2000 DNA Marker

    2.2 Vg原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    經(jīng)I和I雙酶切的基因片段,亞克隆到pCzn1載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ArcticExpress,挑選平板上單一的菌落抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。如圖2所示,正確的重組質(zhì)粒酶切后呈現(xiàn)兩條清晰的條帶,一條帶為 2 091 bp的片段,另一條帶為約4 400 bp的pCzn1載體。此外采用DNAMAN軟件分析該重組質(zhì)粒測(cè)序所得序列,結(jié)果顯示基因序列無(wú)突變?nèi)笔В砻鱬Czn1-載體構(gòu)建成功。

    2.3 重組蛋白表達(dá)的鑒定

    經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,重組克隆菌的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明在80 kD處出現(xiàn)了一條新蛋白帶,其大小與預(yù)期的Vg重組蛋白帶大小相符合,其在沉淀中表達(dá)量較高而在上清中表達(dá)量不明顯(圖3)。

    2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

    2.4.1 IPTG濃度 以未誘導(dǎo)的菌體作為對(duì)照,用0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1的IPTG濃度誘導(dǎo),隨著 IPTG 加入量的增加,Vg蛋白表達(dá)量也明顯增加(圖4)。當(dāng)IPTG 濃度為0.6 mmol·L-1時(shí),Vg蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)最大化,而繼續(xù)提高 IPTG 的濃度對(duì)提高蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯作用。

    M:DL5000 DNA Marker;1:pCzn1-Vg質(zhì)粒雙酶切pCzn1-Vg ingested by Nde I/Xba I

    M:蛋白marker Protein marker;1:未經(jīng)誘導(dǎo) pCzn1-Vg表達(dá)產(chǎn)物The expression product of pCzn1-Vg without inducing;2:pCzn1-Vg 誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物induced expression product of pCzn1-Vg;3:誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清液the precipitate induced by IPTG;4:誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沉淀The supernatant induced by IPTG

    2.4.2 誘導(dǎo)溫度 在0.6 mmol·L-1的最適IPTG 濃度下,隨著誘導(dǎo)溫度的升高,沉淀蛋白的表達(dá)量在25℃時(shí)有明顯提高(圖5)。25℃以后,隨著溫度升高,蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,且雜蛋白量增多。

    M:蛋白Marker Protein Marker;1—6:IPTG 濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mmol·L-1時(shí),pCzn1-Vg 轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后破菌沉淀Precipitates of pCzn1-Vg induced by IPTG at the concentration of 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mmol·L-1, respectively

    M:蛋白Marker Protein Marker;1—4:加入 0.6 mmol·L-1 IPTG分別在20、25、30和35℃時(shí)誘導(dǎo),pCzn1-Vg轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后破菌沉淀Precipitate of pCzn1-Vg by induction with 0.6 mmol·L-1 IPTG at 20, 25, 30, and 35℃

    2.5 Vg重組蛋白的純化檢測(cè)

    Vg包涵體蛋白經(jīng)過(guò)變復(fù)性的方式,重溶目標(biāo)蛋白,通過(guò)Ni柱樹脂親和純化獲得目標(biāo)蛋白,進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析,用Ni-IDA緩沖液洗脫,可獲得一條約為 80 kD 的清晰的特異性蛋白條帶(圖6)。

    M:蛋白Marker Protein Marker;1:Vg包涵體蛋白Precipitate from pCzn1-Vg;2:純化后的 Vg 重組蛋白Purified Vg recombinant protein

    2.6 Vg多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

    新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后,用間接ELISA法檢測(cè)Vg多克隆抗體的效價(jià)。Vg多克隆抗體和陰性血清(免疫前健康兔血清)按 500×20(500)至 500×210(512 000)連續(xù)倍比稀釋,結(jié)果表明,當(dāng)Vg抗體稀釋512 000 倍時(shí),OD陽(yáng)性/OD陰性>2.0,其終效價(jià)可達(dá) 1﹕512 000。

    2.7 多克隆抗體檢測(cè)甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中Vg的含量

    分別取化蛹 1—6 d的雌蛹以及剛羽化,羽化 12、24、48、60、72 h的甜菜夜蛾成蟲血淋巴樣品,用Western blot檢測(cè)Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達(dá)差異(圖7)。其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Vg僅在甜菜夜蛾雌蟲中表達(dá),從蛹末期開始微弱表達(dá)。成蟲羽化后血淋巴中Vg表達(dá)量先升高后降低,呈動(dòng)態(tài)變化,到羽化 48 h表達(dá)量最高,隨后降低。

    3 討論

    昆蟲Vg是由 6—7 kb的mRNA編碼,首先形成分子量約為200 kD的前體蛋白,然后卵裂位點(diǎn)將其分裂成 40—60和140—190 kD大小兩種亞基,亞基經(jīng)聚合、修飾后形成Vg[23]。在前期研究中,通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾序列的分析,總長(zhǎng)5 694 bp,編碼1 761個(gè)氨基酸,總分子量為200 kD左右,預(yù)測(cè)蛋白水解酶在卵裂位點(diǎn)RTLR將其分解成大小兩個(gè)亞基(141和58 kD)。本研究用于原核表達(dá)的肽鏈vitellogenin-N區(qū)是一個(gè)脂蛋白結(jié)構(gòu)域,主要用于運(yùn)輸脂質(zhì)[24],表達(dá)的Vg重組蛋白為80 kD左右,其包含卵裂位點(diǎn)RTLR。理論上用Vg重組蛋白免疫家兔制備的多克隆抗體對(duì)Vg大小亞基都有免疫反應(yīng),但Western blot結(jié)果顯示在雌蟲血淋巴中,只檢測(cè)出Vg的一個(gè)大亞基(180 kD左右)。有研究表明,在同屬夜蛾科的斜紋夜蛾中,通過(guò)分離卵提取物卵黃蛋白制備Vg多克隆抗體對(duì)卵與雌性血淋巴進(jìn)行Western blot分析,也只能檢測(cè)出Vg的一個(gè)大亞基[14]。因此筆者推測(cè),像一些高等膜翅目昆蟲如日本瘤姬蜂()[25]一樣,甜菜夜蛾中只有編碼大亞基的部分才有轉(zhuǎn)錄活性,而編碼小亞基單位的部分缺失或不表達(dá)。

    M:蛋白marker Protein Marker;1—6:化蛹1-6 d的雌蛹Female pupae from 1st to 6th day;7—12:剛羽化雌成蟲、羽化12、24、48、60、72 h雌成蟲0-, 12-, 24-, 48-, 60-, 72-h-old adults

    昆蟲Vg在體內(nèi)合成具有性別、發(fā)育時(shí)期和組織的特異性。在大多數(shù)昆蟲中,脂肪體是Vg合成的唯一場(chǎng)所,然后分泌到血淋巴,被卵母細(xì)胞通過(guò)卵黃原蛋白受體吸收[7]。在前期的研究中,筆者克隆得到甜菜夜蛾序列,同時(shí)明確了僅在雌蟲脂肪體表達(dá),而在中腸、馬氏管、卵巢等組織中不表達(dá)。鱗翅目昆蟲Vg合成啟動(dòng)時(shí)間根據(jù)成蟲是否取食的特性在不同類群中存在差異性。本研究測(cè)定的甜菜夜蛾Vg蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)結(jié)果顯示 Vg在甜菜夜蛾雌蟲蛹末期開始微弱表達(dá),成蟲羽化后Vg表達(dá)量先升高后降低,呈動(dòng)態(tài)變化,到羽化48 h表達(dá)量最高,隨后降低。甜菜夜蛾Vg合成和啟動(dòng)在蛹末期,這與大多數(shù)屬于成蟲補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)型的蛾類Vg合成和啟動(dòng)時(shí)間一致,如煙草天蛾()[17]和斜紋夜蛾[15]。而對(duì)于成蟲不取食型的蛾類,如同屬于鱗翅目的舞毒蛾[16],Vg在末齡幼蟲就開始表達(dá)。不同蛾類Vg合成啟動(dòng)時(shí)間不同,這可能是由個(gè)體內(nèi)在特有的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控決定的。

    在害蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)中,通過(guò)剖解昆蟲的卵巢發(fā)育進(jìn)度可以預(yù)測(cè)其田間產(chǎn)卵量。而昆蟲Vg蛋白表達(dá)量的變化與卵巢發(fā)育進(jìn)度緊密相關(guān),這在很多昆蟲如美洲蜚蠊()[11]、猛蟻()[26]、草地貪夜蛾()[27]、斜紋夜蛾[14]中已得到證實(shí)。根據(jù)甜菜夜蛾雌蛾的卵巢形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,將其卵巢發(fā)育進(jìn)度分為5級(jí),即乳白透明期、卵黃沉積期、成熟待產(chǎn)期、產(chǎn)卵盛期、產(chǎn)卵末期[6]。通過(guò)對(duì)室內(nèi)甜菜夜蛾種群不同日齡的卵巢組織進(jìn)行解剖,結(jié)果顯示在甜菜夜蛾蛹末期(羽化前2 d)是乳白透明期,卵巢處于萌芽階段,脂肪體量多而飽滿。這一階段本研究測(cè)定的Vg蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)結(jié)果顯示Vg表達(dá)開始啟動(dòng),但表達(dá)量較弱,與觀察到的卵黃沉積較少,卵巢管基本處于透明狀的現(xiàn)象基本相符。從蛹體發(fā)黑即將要羽化至羽化48 h是卵黃沉積期,這一時(shí)期卵巢管伸長(zhǎng),管內(nèi)卵量急速增加,未成熟的卵粒較多,卵巢發(fā)育所需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)急劇增加。因此,Vg表達(dá)量在蛋白水平上進(jìn)入快速增長(zhǎng)期。羽化48 h之后甜菜夜蛾卵巢進(jìn)入成熟待產(chǎn)期,進(jìn)入待產(chǎn)期后,脂肪體明顯變少,卵巢管內(nèi)有大量成熟的卵存在,而此刻未成熟的卵粒較少,所需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,Vg蛋白表達(dá)量也開始降低。本研究血淋巴中Vg蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)變化與筆者前期對(duì)甜菜夜蛾脂肪體組織中表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果[21]基本一致。因此,綜合Vg表達(dá)動(dòng)態(tài)及卵巢發(fā)育進(jìn)度的結(jié)果,筆者認(rèn)為在甜菜夜蛾進(jìn)入產(chǎn)卵盛期(羽化3—4 d)前,已基本完成了卵黃沉積的主要過(guò)程。

    甜菜夜蛾寄主范圍廣,食性雜,并具有繁殖能力強(qiáng)、易產(chǎn)生抗藥性、遷飛擴(kuò)散能力強(qiáng)等特點(diǎn)[28-30],因而極易猖獗發(fā)生、暴發(fā)成災(zāi),現(xiàn)已列入世界性極難治理的重大害蟲范圍。Vg是胚胎發(fā)育營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源,在昆蟲生殖過(guò)程中起重要作用,也是害蟲種群增殖的關(guān)鍵因子。用于制備甜菜夜蛾Vg多克隆抗體的抗原有兩種,一種是表達(dá)蛋白,另一種為甜菜夜蛾卵提取物即卵黃蛋白。Moon等[14]曾利用甜菜夜蛾的卵提取物制備了Vg抗體,但其特異性效果不好,在目標(biāo)蛋白附近220 kD的位置有交互免疫性,不利于對(duì)Vg的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。本研究通過(guò)原核表達(dá)的vitellogenin-N結(jié)構(gòu)區(qū),制備了高效價(jià),高純度,特異性強(qiáng)的多克隆抗體,并測(cè)定了血淋巴中Vg的動(dòng)態(tài)變化。研究結(jié)果一方面可揭示甜菜夜蛾卵黃發(fā)生規(guī)律與卵巢發(fā)育進(jìn)度及產(chǎn)卵動(dòng)態(tài)的內(nèi)在聯(lián)系,對(duì)于甜菜夜蛾的監(jiān)測(cè)防治具有重要意義;另一方面也可為進(jìn)一步研究甜菜夜蛾Vg吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    克隆了甜菜夜蛾的功能區(qū)片段,該基因片段序列長(zhǎng)度 2 091 bp,編碼697個(gè)氨基酸。同時(shí)獲得了原核表達(dá)的Vg純化蛋白,明確了蛋白最優(yōu)表達(dá)條件(溫度為25℃,IPTG濃度為0.6 mmol·L-1);制備了甜菜夜蛾Vg多克隆抗體,通過(guò)Western blot明確了甜菜夜蛾 Vg 蛋白的表達(dá)規(guī)律。

    [1] FARAHANI S, NASERI B, TALEBI A A. Comparative life table parameters of the beet armyworm,(Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) on five host plants., 2011, 13(1): 91-101.

    [2] AZIDAH A A, SOFIAN-AZIRUN M. Life history of(Lepidoptera: Noctuidae) on various host plants., 2006, 96: 613-618.

    [3] 戴瀚洋, 孫洋, 柏立新, 趙靜, 肖留斌, 譚永安. 亞致死濃度甲維鹽脅迫對(duì)甜菜夜蛾幼蟲解毒酶系活力及其相關(guān)基因表達(dá)量的影響. 棉花學(xué)報(bào), 2015, 27(2): 149-158.

    DAI H Y, SUN Y, BAI L X, ZHAO J, XIAO L B, TAN Y A. Activities of detoxification enzymes and expressions of related genes inlarvae treated with sublethal concentrations of emamectin benzoate., 2015, 27(2): 149-158. (in Chinese)

    [4] 文禮章, 張友軍. 我國(guó)甜菜夜蛾大尺度暴發(fā)頻度與廣域溫度和廣域降雨量關(guān)系的預(yù)測(cè)模型. 昆蟲學(xué)報(bào), 2010, 53(12): 1367-1381.

    WEN L Z, ZHANG Y J. Modelling of the relationship between the frequency of large-scale outbreak of the beet armyworm,(Lepidoptera: Noctuidae) and the wide-area temperature and rainfall trends in China., 2010, 53(12): 1367-1381. (in Chinese)

    [5] 王憲輝, 徐洪富, 許永玉, 劉勇, 周真. 甜菜夜蛾雌性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、發(fā)育分級(jí)及在測(cè)報(bào)上的應(yīng)用. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2003, 30(3): 261-266.

    WANG X H, XU H F, XU Y Y, LIU Y, ZHOU Z. The structures and developmental progress of reproductive system of beet armyworm,(Hübner), and their use in forecast., 2003, 30(3): 261-266. (in Chinese)

    [6] 韓蘭芝, 翟保平, 戴率善, 張孝羲, 劉培磊. 江蘇豐縣甜菜夜蛾田間種群蟲源性質(zhì)分析. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2004, 24(7): 1388-1398.

    HAN L Z, ZHAI B P, DAI S S, ZHANG X Y, LIU P L. Analysis on the population status of the beet armyworm,(Hübner) in Fengxian, Jiangsu Province, China., 2004, 24(7): 1388-1398. (in Chinese)

    [7] 戈林泉, 吳進(jìn)才. 昆蟲卵黃蛋白及其激素調(diào)控的研究進(jìn)展. 昆蟲知識(shí), 2010, 47(2): 236-246.

    GE L Q, WU J C. Research progress in insect vitellin and its hormone regulation., 2010, 47(2): 236-246. (in Chinese)

    [8] 葉恭銀, 呂慧平, 蔣彩英. 昆蟲卵黃蛋白分子的多樣性與進(jìn)化關(guān)系//李典謨. 走向二十一世紀(jì)的中國(guó)昆蟲學(xué). 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 2001: 178-189.

    YE G Y, Lü H P, JIANG C Y. Diversity and phylogeny of yolk proteins in insects//Li D M.. Beijing: Chinese Science and Technology Press, 2001: 178-189. (in Chinese)

    [9] 董勝?gòu)? 高秀云, 程正賢, 胡萃, 葉恭銀. 蝶蛹金小蜂卵黃蛋白單克隆抗體的制備及其應(yīng)用方法的建立. 昆蟲學(xué)報(bào), 2007, 50(9): 871-877.

    DONG S Z, GAO X Y, CHENG Z X, HU C, YE G Y. Development of monoclonal antibodies to the vitellin in an endoparasitoid,(Hymenoptera: Pteromalidae) and its application methods., 2007, 50(9): 871-877. (in Chinese)

    [10] TUFAIL M, LEE J M, HATAKEYAMA M, OISHI K, TAKEDA M. Cloning of vitellogenin cDNA of the American cockroach,(Dietyoptera) and its structural and expression analyses., 2000, 45(1): 37-46.

    [11] TUFAIL M, TAKEDA M. Molecular characteristics of insect vitellogenins., 2008, 54(12): 1447-1458.

    [12] TUFAIL M, NAEEMULLAH M, ELMOGY M, SHARMA P, TAKEDA M, NAKAMURA C. Molecular cloning, transcriptional regulation, and differential expression profiling of vitellogenin in two wing-morphs of the brown planthopper,St?l (Hemiptera: Delphacidae)., 2010, 19(6): 787-798.

    [13] TUFAIL M, NAGABA Y, ELGENDY A M, TAKEDA M. Regulation of vitellogenin genes in insects., 2014, 17(3): 269-282.

    [14] MOON J, KIM Y. Purification and characterization of vitellin and vitellogenin of the beet armyworm,, (Noctuidae: Lepidoptera)., 2003, 6(1): 37-43.

    [15] SHU Y H, ZHOU J L, TANG W C, LU K, ZHOU Q, ZHANG G. Molecular characterization and expression pattern of(Lepidoptera: Noctuidae) vitellogenin, and its response to lead stress., 2009, 55(7): 608-616.

    [16] LAMISON C D, BALLARINO J, MA M. Temporal events of gypsy moth vitellogenesis and ovarian development., 1991, 16(2): 201-209.

    [17] 葉恭銀, 胡萃, 洪健, 龔和. 天蠶卵黃原蛋白的合成、運(yùn)轉(zhuǎn)與沉積. 昆蟲學(xué)報(bào), 1999, 42(3): 225-233.

    YE G Y, Hu C, HONG J, GONG H. Synthesis, transport and accumulation of vitellogenin in the Japanese oak silkworm,(Lepidoptera: Saturiidae)., 1999, 42(3): 225-233. (in Chinese)

    [18] SEEHUUS S C, NORBERG K, GIMSA U, AMDAM G V. Reproductive protein protects sterile honey bee workers from oxidative stress., 2006, 103(4): 962-967.

    [19] LI Z, ZHANG S, LIU Q. Vitellogenin functions as a multivalent pattern recognition receptor with an opsonic activity., 2008, 3(4): e1940.

    [20] HUO Y, LIU W, ZHANG F, CHEN X, LI L, LIU Q, ZHOU Y, WEI T, FANG R, WANG X. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector., 2014, 10(3): e1003949.

    [21] ZHAO J, SUN Y, XIAO L B, TAN Y A, BAI L X. Molecular characterization and expression of vitellogenin gene fromexposed to cadmium stress., 2016, 593(1): 179-184.

    [22] 王巖, 馬紀(jì), 劉小寧. 昆蟲血淋巴的收集技術(shù)與方法. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2009, 46(1): 147-151.

    WANG Y, MA J, LIU X N. Techniques and methods for collecting insect haemolymph., 2009, 46(1): 147-151. (in Chinese)

    [23] 馬卓, 劉廷輝, 陳潔, 梁超, 曹美琳, 何運(yùn)轉(zhuǎn). 異色瓢蟲卵黃蛋白單克隆抗體的制備及鑒定. 昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 58(11): 1186-1193.

    MA Z, LIU T H, CHEN J, LIANG C, CAO M L, HE Y Z. Preparation and identification of monoclonal antibodies to the vitellin in(Coleoptera: Coccinellidae)., 2015, 58(11): 1186-1193. (in Chinese)

    [24] SMOLENAARS M M W, MADSEN O, RODENBURG K W, VAN DER HORST D J. Molecular diversity and evolution of the large lipid transfer protein superfamily., 2007, 48: 489-502.

    [25] NOSE Y, LEE J M, VENO T, HATAKEYAMA M, OISHI K. Cloning of cDNA for vitellogenin of the parasitoid wasp,: vitellogenin primary structure and evolution considerations., 1997, 27(9): 1047-1056.

    [26] AZEVEDO D O, ZANUNCIO J C, DELABIE J H C, SERR?O J E. Temporal variation of vitellogenin synthesis in, (Formicidae: Ectatomminae) workers., 2011, 57(7): 972-977.

    [27] SORGE D, NAUEN R, RANGE S, HOFFMANN K H. Regulation of vitellogenesis in the fall armyworm,(Lepidoptera: Noctuidae)., 2000, 46(6): 969-976.

    [28] ZHANG B, LIU H, HELEN H S, WANG J J. Effect of host plants on development, fecundity and enzyme activity of, (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)., 2011, 10(8): 1232-1240.

    [29] 司升云, 周利琳, 王少麗, 江幸福, 許再福, 慕衛(wèi), 王冬升, 王小平, 陳浩濤, 楊亦樺, 吉訓(xùn)聰. 甜菜夜蛾防控技術(shù)研究與示范—公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng) “甜菜夜蛾防控技術(shù)研究與示范” 研究進(jìn)展. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2012, 49(6): 1432-1438.

    SI S Y, ZHOU L L, WANG S L, JIANG X F, XU Z F, MU W, WANG D S, WANG X P, CHEN H T, YANG Y H, JI X C. Progress in research on prevention and control of beet armyworm,in China., 2012, 49(6): 1432-1438. (in Chinese)

    [30] SU J, SUN X X. High level of metaflumizone resistance and multiple insecticide resistance in field populations of, (Lepidoptera: Noctuidae) in Guangdong Province, China., 2014, 61(3): 58-63.

    (責(zé)任編輯 岳梅)

    Polyclonal antibody preparation ofvitellogeninand its protein expression at different Developmental stages

    ZHAO Jing, SUN Yang, TAN YongAn, XIAO LiuBin, JIANG YiPing, BAI LiXin

    (Institute of Plant Protection/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)

    The objective of this study is to prepare the polyclonal antibody ofvitellogenin(Vg), investigate the expression pattern of Vgprotein in female hemolymph ofat different developmental stages, and to provide a basis for studying the function and mechanism of synthesis, transportation and utilization.The fragment ofwas amplified from the cDNA of 24-h-old female adults ofby PCR which included the vitellogenin-N region. The fragment ofwas then inserted into the pMD-19T for sequencing. The nucleic acid sequence and the amino acids encoded by this gene fragment were analyzed by DNAMAN software. The sequencedfragment was inserted into the expression vector pCzn1 byI andI digestion. The recombinant vector pCzn1-Vg was then inserted intoArcticExpress. TheArcticExpress expressing the Vg recombinant protein was collected and crushed by ultrasonic. The supernatant and the precipitate were collected, respectively, and SDS-PAGE was used to analyze the expression of the recombinant protein. The recombinant Vg protein was expressed at different temperatures and concentrations of IPTG and the optimized expression condition was achieved. The recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. The purified recombinant protein was used to produce polyclonal antibody via immunizing rabbit. The titer of rabbit anti-Vg antiserum was evaluated by indirect ELISA. The content of Vg in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot.The length of the fragment ofis 2 091 bp, encoding 697 amino acids. The predicted molecular weight of Vg recombinant protein is 80.88 kD. The molecular weight of Vg recombinant protein expressed inis 80 kD, which is consistent with the predicted molecular weight. It was mainly expressed in inclusion body rather than the supernatant. The results of Vg recombinant protein content expressed at different temperatures and concentrations of IPTG showed that it was highly expressed at inducing temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG. It had no obvious effect on boosting the Vg recombinant protein level and other protein content increased by raising temperature and the concentration of IPTG. After immunizing New Zealand white rabbits with four times, the ELISA assay showed that the rabbit anti-Vg antiserum had a good sensitivity with the titer 1﹕512 000.The Vg content in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot. A single Vg band of approximately 180 kD was detected. Vg was first expressed at late stage of female pupa and showed a low expression level. After female adult eclosion, Vg expression was in a dynamic balance which peaked in 48-h-old female adults, then decreased.The Vg recombinant protein was successfully purified and the optimized expression condition (temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG) is clearly defined. The polyclonal antibody of Vg protein with high titer was obtained and the expression pattern of Vg inis explicit.

    ; vitellogenin gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; expression pattern

    2017-06-06;

    國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(6111661)、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-18-16)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金計(jì)劃(6111612)、國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303028)、江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地自主研究課題(3201632)

    接受日期:2017-09-01

    聯(lián)系方式:趙靜,E-mail:jingzhao0126@126.com。通信作者肖留斌,E-mail:xlbwll@sohu.com

    猜你喜歡
    羽化甜菜夜蛾
    甜菜應(yīng)答鹽脅迫的RING型E3連接酶基因的鑒定與分析
    辣椒甜菜,各有所愛
    侯馬市 采取果斷措施開展對(duì)草地貪夜蛾統(tǒng)防統(tǒng)治
    科學(xué)認(rèn)知草地貪夜蛾 打贏防控攻堅(jiān)戰(zhàn)
    草地貪夜蛾的識(shí)別與防控
    宜昌市柑橘大實(shí)蠅羽化出土觀察
    湖北植保(2017年4期)2017-08-31 11:09:49
    酷蟲學(xué)校蠶蛹羽化了(二)
    酷蟲學(xué)校蠶蛹羽化了(一)
    新疆產(chǎn)區(qū)有機(jī)甜菜栽培技術(shù)探討
    去看看蝴蝶羽化吧
    国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美激情在线99| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产成人福利小说| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国内精品一区二区在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人av在线免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成人午夜高清在线视频| 免费大片18禁| 日日摸夜夜添夜夜爱| 给我免费播放毛片高清在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久精品综合一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 一区二区三区四区激情视频 | 国产黄片美女视频| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 寂寞人妻少妇视频99o| 黄片无遮挡物在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久99热这里只有精品18| 有码 亚洲区| 青青草视频在线视频观看| av视频在线观看入口| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一本久久精品| 国产人妻一区二区三区在| 人妻系列 视频| 99热这里只有是精品在线观看| 国产91av在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 精品一区二区三区人妻视频| 色哟哟哟哟哟哟| 国产极品天堂在线| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费人成在线观看视频色| 欧美三级亚洲精品| 一边亲一边摸免费视频| 人妻系列 视频| 尾随美女入室| eeuss影院久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 1024手机看黄色片| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲内射少妇av| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久噜噜| 永久网站在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 韩国av在线不卡| 欧美日本视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲七黄色美女视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 精品国产三级普通话版| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品人妻久久久影院| 久久这里有精品视频免费| 国产毛片a区久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 最近中文字幕高清免费大全6| 免费搜索国产男女视频| 最近手机中文字幕大全| 亚洲人成网站在线播| 国产高清三级在线| 亚洲中文字幕日韩| 欧美+亚洲+日韩+国产| 身体一侧抽搐| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 我要看日韩黄色一级片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜精品在线福利| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日本三级黄在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| www.av在线官网国产| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品无大码| 亚洲av成人av| 亚洲自偷自拍三级| 中国美女看黄片| 久久精品国产亚洲网站| 国产高清三级在线| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精品自拍成人| 免费av毛片视频| 69人妻影院| 国产亚洲欧美98| 成人美女网站在线观看视频| av在线观看视频网站免费| 最近中文字幕高清免费大全6| 高清毛片免费看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产成年人精品一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美高清成人免费视频www| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜福利视频1000在线观看| 尾随美女入室| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产高清有码在线观看视频| 久久久精品大字幕| 黄片无遮挡物在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品久久久久久久电影| 中文字幕熟女人妻在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品一区二区三区人妻视频| 免费大片18禁| 久久久精品大字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| av专区在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 性色avwww在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲最大成人av| 久久久久九九精品影院| 又爽又黄无遮挡网站| 青春草视频在线免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 18禁在线播放成人免费| 最近手机中文字幕大全| 精品日产1卡2卡| 波多野结衣巨乳人妻| 小说图片视频综合网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 变态另类丝袜制服| 日韩高清综合在线| 免费看av在线观看网站| a级一级毛片免费在线观看| 欧美区成人在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产一区二区激情短视频| 最近手机中文字幕大全| av黄色大香蕉| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美又色又爽又黄视频| or卡值多少钱| 秋霞在线观看毛片| 国产精品野战在线观看| 久久精品国产自在天天线| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲在久久综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 成人av在线播放网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产成年人精品一区二区| a级毛色黄片| 久久久久久久久久久免费av| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 2022亚洲国产成人精品| 好男人在线观看高清免费视频| 看黄色毛片网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 12—13女人毛片做爰片一| 天美传媒精品一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 婷婷色综合大香蕉| 欧美xxxx性猛交bbbb| 白带黄色成豆腐渣| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲图色成人| 久久国产乱子免费精品| 久久九九热精品免费| 久久久久久久久久成人| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费看a级黄色片| 在线观看午夜福利视频| 国产免费男女视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 精品一区二区三区人妻视频| 午夜福利在线观看吧| 看黄色毛片网站| 久久亚洲精品不卡| 久久午夜福利片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美激情国产日韩精品一区| av在线蜜桃| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 丝袜美腿在线中文| 能在线免费观看的黄片| 黄色欧美视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久久久久久黄片| 天天躁日日操中文字幕| 成年av动漫网址| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 69av精品久久久久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品蜜桃在线观看 | 国产 一区精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 一级av片app| 免费看光身美女| 亚洲国产精品sss在线观看| av视频在线观看入口| 99久国产av精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日本与韩国留学比较| 久久久精品94久久精品| 简卡轻食公司| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 只有这里有精品99| 亚洲最大成人中文| 99视频精品全部免费 在线| 精品国产三级普通话版| 日本av手机在线免费观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲在久久综合| 亚洲精品成人久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩一本色道免费dvd| 男女边吃奶边做爰视频| 美女 人体艺术 gogo| 啦啦啦韩国在线观看视频| av天堂在线播放| 丝袜美腿在线中文| 十八禁国产超污无遮挡网站| 男的添女的下面高潮视频| 日本免费a在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 婷婷精品国产亚洲av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 青青草视频在线视频观看| 成年av动漫网址| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费搜索国产男女视频| 精品日产1卡2卡| 国产精品久久久久久久电影| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 听说在线观看完整版免费高清| 成人性生交大片免费视频hd| 国内精品一区二区在线观看| 色吧在线观看| 免费观看的影片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产一区二区激情短视频| 国产单亲对白刺激| 精品不卡国产一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 麻豆乱淫一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 婷婷六月久久综合丁香| 老司机影院成人| 成人永久免费在线观看视频| 成人国产麻豆网| 美女cb高潮喷水在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区三区av在线 | 国产亚洲精品av在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久午夜福利片| 精品久久久久久久久久免费视频| 悠悠久久av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人无遮挡网站| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧美精品专区久久| 一级毛片我不卡| 亚洲在线自拍视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产av在哪里看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲四区av| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美三级三区| 青春草国产在线视频 | 久久99热这里只有精品18| а√天堂www在线а√下载| 国产黄片视频在线免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 伦精品一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 性欧美人与动物交配| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产不卡一卡二| 热99re8久久精品国产| av在线蜜桃| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩成人伦理影院| 国产亚洲91精品色在线| 色尼玛亚洲综合影院| 国产 一区精品| 乱系列少妇在线播放| 亚洲中文字幕日韩| 激情 狠狠 欧美| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 午夜精品在线福利| 国产精品.久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美区成人在线视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 男人狂女人下面高潮的视频| av.在线天堂| 99九九线精品视频在线观看视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 中文欧美无线码| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久久久免费av| 丰满的人妻完整版| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久综合国产亚洲精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 性色avwww在线观看| 18+在线观看网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产真实乱freesex| 看免费成人av毛片| АⅤ资源中文在线天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲国产欧美人成| 极品教师在线视频| av.在线天堂| 我要搜黄色片| 国产在视频线在精品| 日韩精品青青久久久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 51国产日韩欧美| 久久这里有精品视频免费| 最好的美女福利视频网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 青青草视频在线视频观看| 午夜久久久久精精品| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产在线男女| 国产精品av视频在线免费观看| 可以在线观看的亚洲视频| 在线观看免费视频日本深夜| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av黄色大香蕉| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美潮喷喷水| 久久精品国产清高在天天线| 韩国av在线不卡| 亚洲电影在线观看av| 欧美激情在线99| 少妇的逼水好多| 我的女老师完整版在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 内射极品少妇av片p| 亚洲欧洲日产国产| 真实男女啪啪啪动态图| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| av卡一久久| 熟女电影av网| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 熟女人妻精品中文字幕| 中文欧美无线码| 欧美成人免费av一区二区三区| 热99在线观看视频| 亚洲在线自拍视频| 91久久精品国产一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 国产毛片a区久久久久| 六月丁香七月| 永久网站在线| 三级毛片av免费| 久久人人精品亚洲av| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产高清激情床上av| 中文在线观看免费www的网站| 国产成年人精品一区二区| 青春草视频在线免费观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 特级一级黄色大片| 美女内射精品一级片tv| 亚洲成人久久性| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 婷婷色综合大香蕉| 久久人妻av系列| 亚洲内射少妇av| 中国美白少妇内射xxxbb| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美色视频一区免费| 日日啪夜夜撸| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩三级伦理在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 69av精品久久久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 丝袜喷水一区| 国产av在哪里看| 乱系列少妇在线播放| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本欧美国产在线视频| 欧美最新免费一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 中文字幕久久专区| www.色视频.com| 中出人妻视频一区二区| av天堂在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 大香蕉久久网| av视频在线观看入口| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 久久久久性生活片| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久国产成人精品二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲人与动物交配视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩一区二区三区影片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久午夜亚洲精品久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 又爽又黄a免费视频| 成人国产麻豆网| 99热这里只有精品一区| 国产 一区精品| 日本三级黄在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 99riav亚洲国产免费| 日韩精品青青久久久久久| 精品久久久久久成人av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久久久九九精品影院| 国产av在哪里看| 国产精品永久免费网站| 久久久精品94久久精品| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产色片| 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 天美传媒精品一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 成年免费大片在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 晚上一个人看的免费电影| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲在久久综合| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本与韩国留学比较| 中文在线观看免费www的网站| or卡值多少钱| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久性生活片| 国产精品,欧美在线| 日韩成人伦理影院| 午夜免费激情av| 最好的美女福利视频网| 久久久a久久爽久久v久久| av在线天堂中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 青春草国产在线视频 | 人妻久久中文字幕网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产探花极品一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| av国产免费在线观看| 青春草视频在线免费观看| 岛国在线免费视频观看| 悠悠久久av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品综合一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 人妻系列 视频| 久久中文看片网| 国产伦理片在线播放av一区 | 网址你懂的国产日韩在线| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩欧美精品免费久久| 村上凉子中文字幕在线| 日本黄色片子视频| 波多野结衣高清作品| 岛国毛片在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久成人免费电影| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久九九精品影院| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜精品在线福利| 亚洲成人久久性| 国产淫片久久久久久久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品熟女少妇av免费看| 老司机影院成人| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一本一本综合久久| 亚洲成人久久性| 国产精品一二三区在线看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 久久99蜜桃精品久久| 欧美一级a爱片免费观看看| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲在久久综合| 一边摸一边抽搐一进一小说| 不卡一级毛片| 久久精品夜色国产| 国产真实伦视频高清在线观看| 99热这里只有精品一区| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品野战在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 免费av不卡在线播放| 久久久国产成人免费| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产麻豆成人av免费视频| 只有这里有精品99| 久久草成人影院| 婷婷六月久久综合丁香| 国产高清三级在线| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久久久成人| 成人无遮挡网站| 午夜福利高清视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 在线观看一区二区三区| 亚洲人成网站高清观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 大香蕉久久网| 99久国产av精品国产电影| 国产av在哪里看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品午夜福利在线看| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 边亲边吃奶的免费视频| 性欧美人与动物交配| av免费在线看不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 毛片女人毛片| 草草在线视频免费看| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲人与动物交配视频|