miRNA-30b對抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用研究

李建華，鄧愛民，張洪杰

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，河南 鄭州 450064；2.河南登封市人民醫(yī)院 頸肩腰腿痛康復(fù)科，河南 登封 452470）

miRNA-30b對抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用研究

李建華1，鄧愛民1，張洪杰2

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，河南 鄭州 450064；2.河南登封市人民醫(yī)院 頸肩腰腿痛康復(fù)科，河南 登封 452470）

目的研究miRNA-30b在胃癌癌組織中的表達(dá)水平及對癌細(xì)胞增殖侵襲的影響，探討miRNA-30b在胃癌中的臨床意義及可能的分子機(jī)制。方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測miRNA-30b在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況；用miRNA-30b模擬物及抑制物轉(zhuǎn)染人胃癌HGC-27細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的情況，Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲情況，Western blot檢測RAB22A和USP47蛋白表達(dá)。結(jié)果miRNA-30b在胃癌組織中表達(dá)水平低于對應(yīng)癌旁組織（P＜0.05），且miRNA-30b低表達(dá)與胃癌分期及腫瘤大小有關(guān)（P＜0.05）；與轉(zhuǎn)染陰性對照細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miRNA-30b模擬物的HGC-27細(xì)胞增殖水平和侵襲能力均受到抑制（P＜0.05），RAB22A和USP47蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miRNA-30b抑制物的HGC-27細(xì)胞增殖水平和侵襲能力則增強(qiáng)（P＜0.05），RAB22A和USP47蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。結(jié)論miRNA-30b在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，且miRNA-30b可能通過調(diào)節(jié)RAB22A和USP47的表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲。

胃癌；miRNA-30b；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲；RAB22A；USP47

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均占惡性腫瘤的前列[1-2]。由于胃癌發(fā)病隱匿，早期缺乏臨床癥狀，大多患者就診時(shí)已到晚期，而胃癌晚期患者的5年存活率20%～30%[3-4]。早期發(fā)現(xiàn)胃癌并得到及時(shí)治療是胃癌治療的關(guān)鍵。其中，血液腫瘤標(biāo)志物檢測是目前胃癌早期診斷的重要方法，但是目前多數(shù)腫瘤標(biāo)志物特異性和單一檢測敏感性較低。因此，開發(fā)新的和更敏感的腫瘤標(biāo)志物用于早期胃癌診斷和疾病監(jiān)測，是治療胃癌的重要研究方向。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[5]。研究報(bào)道顯示，miRNA-30b在多種腫瘤發(fā)展過程中起作用，包括乳腺癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]和肺癌等[8]。在非小細(xì)胞肺癌中，肺癌組織中miRNA-30b表達(dá)水平低于對應(yīng)癌旁組織，miRNA-30b通過調(diào)控靶基因（如 Rab18、Cthrc1）的表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。為探討miRNA-30b在胃癌中是否發(fā)揮作用，本研究對胃癌患者癌組織中miRNA-30b的表達(dá)進(jìn)行檢測，以便了解其在胃癌中的臨床意義，并對miRNA-30b影響胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年6月-2016年12月在河南登封市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的胃癌患者55例。其中，男性29例，女性26例；年齡41～74歲，平均（55.4±6.9）歲。留取其胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，手術(shù)切除標(biāo)本立即放入液氮中，隨后置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。所有患者術(shù)前均尚未接受放化療，均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

人胃癌HGC-27細(xì)胞株（購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫），1640培養(yǎng)基、胎牛血清（購自美國Gibco公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（購自江蘇省海門碧云天生物技術(shù)公司），RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒等（購自大連寶生生物工程有限公司），miRNA-30b和內(nèi)參U6的引物、miRNA-30b mimics、miRNA-30b inhibitor和miRNA-30b control由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（購自美國Invitrogen公司），小鼠抗人USP47抗體（購自美國Santa Cruz公司），小鼠抗人RAB22A抗體、βactin抗體（購自美國Abcam公司）。

1.3 qRT-PCR胃癌組織及癌旁組織中miR-30b的表達(dá)

患者的胃癌和癌旁組織標(biāo)本各取約100 mg，加入1 ml Trizol，用PRO-200組織勻漿機(jī)PRO-200（美國Pro Scientific公司）充分破碎后，按照RNA提取試劑盒說明書抽提總RNA。抽提的總RNA測定濃度及純度后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。qRT-PCR引物序列見表1。用ABI PRISM7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國賽默飛世爾公司）檢測miRNA-30b mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR擴(kuò)增體系為20 μl，按95℃Taq 酶活化 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miRNA-30b相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合度70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為轉(zhuǎn)染試劑對照組、陰性對照組、miRNA-30b模擬物組和miRNA-30b抑制物組，miRNA-30b mimics及inhibitor終濃度為80 nmol/L。按說明書將各組轉(zhuǎn)染物與LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞以100μl/孔（約1×104個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板中，每組設(shè)4個(gè)平行孔，分別于0、24、48及72 h后向每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)孵育4 h后進(jìn)行檢測。Spectra Max 190酶標(biāo)儀（美國MD公司）測定在450 nm波長各孔光密度值（optical density，OD），以O(shè)D值代表細(xì)胞相對增殖水平，繪制增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室內(nèi)膜預(yù)先用Matrigel膠包被，實(shí)驗(yàn)開始前每個(gè)小室內(nèi)加入50 μl含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基，37℃，30 min，水化基底膜。各組轉(zhuǎn)染48 h后的HGC-27細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度。小室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液（約1×105個(gè)細(xì)胞），小室下層加入400 μl含10%血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，使用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞。4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗2遍，結(jié)晶紫染色30 min后，再用PBS洗2遍。Olympus1×51倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞（選取10個(gè)視野），每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

1.6 Western blot分析miRNA-30b的靶蛋白

為進(jìn)一步探索miRNA-30b對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制，運(yùn)用TargetScan和PicTar軟件進(jìn)行miRNA-30b靶基因的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)RAB22A與USP47是miRNA-30b的候選靶基因。采取Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證。收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。8%SDS-PAGE分離膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，浸入5%脫脂奶粉中，搖床上室溫封閉2 h。洗膜后，分別加入 RAB22A（1∶1 000）、USP47（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），4℃孵育過夜。洗膜后，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶10 000），室溫震蕩孵育1 h。按照A液∶B液（1∶1）配制ECL發(fā)光劑，混勻放置1 min后均勻加在膜正面。利用凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）觀察蛋白條帶，曝光結(jié)束后將圖片導(dǎo)出分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graph Pad Prism 5.0作圖軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中miRNA-30b的表達(dá)水平

55例胃癌患者胃癌及癌旁組織中miRNA-30b表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.281，P=0.000）。與癌旁組織中miRNA-30b的表達(dá)水平（2.62±0.72）比較，胃癌組織（1.14±0.53）降低。

早期胃癌組（Ⅰ+Ⅱ）中miRNA-30b的表達(dá)低于晚期組（Ⅲ+Ⅳ），且與腫瘤大小有一定的關(guān)系（P＜0.05），但與年齡、性別以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），見表 2。

表2 胃癌患者不同臨床特征與胃癌組織miRNA-30b相對表達(dá)量的比較 （±s）

表2 胃癌患者不同臨床特征與胃癌組織miRNA-30b相對表達(dá)量的比較 （±s）

臨床特征 例數(shù) miRNA-30b t值 P值年齡＜55歲 24 1.34±0.23 0.930 0.358≥55歲 31 1.27±0.31性別男女26 1.17±0.21 29 1.24±0.13 1.501 0.138分期Ⅰ+Ⅱ 21 1.07±0.25 2.212 0.031Ⅲ+Ⅳ 34 1.26±0.34淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無有37 1.25±0.13 18 1.19±0.27 0.935 0.358腫瘤大小＜3 cm 20 1.11±0.28 2.318 0.024≥3 cm 35 1.28±0.25

圖1 miRNA-30b對細(xì)胞增殖的影響

2.2 miRNA-30b對細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)miRNA-30b的表達(dá)水平，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 705.460，P=0.000），模擬物組和抑制物組分別高于或低于陰性對照組（P＜0.05），證明轉(zhuǎn)染有效。轉(zhuǎn)染48和72 h后各組細(xì)胞的增殖能力，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=148.412和75.179，均P=0.000）。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miRNA-30b模擬物的HGC-27細(xì)胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miRNA-30b抑制物的細(xì)胞增殖水平則升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3和圖1B。

2.3 miRNA-30b對細(xì)胞侵襲的影響

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=166.157，P=0.000）。LSD-t檢驗(yàn)顯示，miRNA-30b模擬物組穿透微孔膜的細(xì)胞數(shù)少于陰性對照組（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miRNA-30b抑制物組抑制miRNA-30b的表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)較其他3組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3和圖2A、B）。提示miRNA-30b表達(dá)水平的變化與胃癌侵襲能力密切相關(guān)。

表3 各組指標(biāo)比較 （±s）

表3 各組指標(biāo)比較 （±s）

組別 miRNA-30b相對表達(dá)量0 h 24 h 48 h 72 h試劑對照組 1.00±0.01 0.10±0.01 0.34±0.02 0.49±0.02 0.64±0.03 73.8±3.0 0.175±0.003 0.283±0.004陰性對照組 0.96±0.02 0.10±0.01 0.33±0.02 0.48±0.02 0.60±0.02 75.0±3.0 0.189±0.004 0.261±0.016模擬物組 1.75±0.02 0.10±0.01 0.32±0.02 0.31±0.01 0.47±0.02 52.0±1.0 0.032±0.008 0.091±0.009抑制物組 0.52±0.03 0.10±0.01 0.28±0.03 0.62±0.02 0.82±0.04 100.1±3.0 0.246±0.003 0.290±0.020 F值 1 705.046 0.003 3.849 148.412 75.179 166.157 1 004.462 139.466 P值 0.000 1.000 0.057 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 OD值（450 nm） HGC-27 RAB22A相對灰度值USP47相對灰度值

圖2 miRNA-30b對細(xì)胞侵襲的影響

圖3 Western blot分析miRNA-30b的靶蛋白

2.4 Western blot分析miRNA-30b的靶蛋白

候選靶基因RAB22A和USP47在miRNA-30b影響胃癌細(xì)胞增殖及侵襲過程中的作用，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 004.462和139.466，均P=0.000）。LSD-t檢驗(yàn)也顯示，miRNA-30b模擬物組RAB22A和USP47的水平低于陰性對照組（P＜0.05），而miRNA-30b抑制物組RAB22A和USP47表達(dá)水平則高于陰性對照組與miRNA-30b模擬物組（P＜0.05），初步證實(shí)miRNA-30b可能通過調(diào)控RAB22A和USP47的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。見表3和圖3。

3 討論

胃癌是一種我國最常見的惡性腫瘤之一，由于早期診斷率低，胃癌患者發(fā)現(xiàn)是多已是進(jìn)展到晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。因此尋找可靠的胃癌早期診斷方法，對提高胃癌治療效果和延長胃癌患者的生存及生活質(zhì)量具有重大意義。胃癌的發(fā)生是由多種因素（如基因、環(huán)境和飲食習(xí)慣等）共同作用的結(jié)果，其發(fā)生機(jī)制目前尚未明確。miRNA是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，一般通過與靶基因rmiRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖凋亡和代謝等各種生命活動及生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。miRNA與多種人類疾病有關(guān)，其在疾病的發(fā)生、診斷和治療中起著重要的作用。大量研究證明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要的角色，通過調(diào)控靶基因起到癌基因或抑癌基因的作用[10-11]。

近年來，miRNA在胃癌研究中備受關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)胃癌中多種異常表達(dá)的miRNA可能與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNA-124、miRNA-222/221、miRNA-143等在胃癌中的作用已被證實(shí)[12-14]。miRNA-30b在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的功能和機(jī)制研究成為新的關(guān)注點(diǎn)。WSZOLEK[15]發(fā)現(xiàn)在侵襲性膀胱癌組織中miRNA-30b表達(dá)下降，且侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-30b與膀胱癌細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌的研究中，證實(shí)miRNA-30b在癌組織中表達(dá)降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30b通過調(diào)控靶基因SIX1的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。本研究中，首先采用qRT-PCR法檢測胃癌組織中miRNA-30b的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中miRNA-30b的表達(dá)低于癌旁組織，且miRNA-30b低表達(dá)與胃癌分期及腫瘤大小有關(guān)，提示miRNA-30b在胃癌中可能具有抑癌基因功能。經(jīng)過轉(zhuǎn)染過表達(dá)或抑制miRNA-30b，觀察miRNA-30b對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，結(jié)果表明，miRNA-30b對胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用。對預(yù)測miRNA-30b靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果提示RAB22A和USP47是miRNA-30b調(diào)控細(xì)胞增殖侵襲的可能途徑。RAB22A屬于Rab超家族，是一類小分子三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)真核細(xì)胞胞內(nèi)胞外的膜泡運(yùn)輸[17]。多個(gè)Rab超家族成員成為癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要潛在因素，如Rab11亞家族成員Rab25及其效應(yīng)蛋白受體組分蛋白在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用[18]；Rab31作為一個(gè)乳腺癌標(biāo)志物，提示預(yù)后良好[19]；在腎癌的研究中，miRNA-204通過降低RAB22A表達(dá)從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和侵襲的作用[20]。USP47是泛素特異性蛋白酶家族成員之一，在乳腺癌的研究中，將USP作為新的治療靶點(diǎn)[21-22]。本研究證明，RAB22A和USP47是miRNA-30b的 2個(gè)靶基因，miRNA-30b通過下調(diào)RAB22A及USP47從而發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用。

綜上所述，miRNA-30b在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用，該作用可能是通過下調(diào)靶基因RAB22A及USP47從而抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲而實(shí)現(xiàn)。miRNA-30b低表達(dá)與胃癌分期及腫瘤大小相關(guān)，可作為胃癌早期診斷的一個(gè)重要分子標(biāo)志物。

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（王榮兵 編輯）

Effect of miRNA-30b on cell proliferation and invasion of gastric cancer

Jian-hua Li1,Ai-min Deng1,Hong-jie Zhang2
(1.Department of Anatomy,Basic Medical Sciences,Zhengzhou Shuqing Medical College,Zhengzhou,Henan 450064,China;2.Department of Neck and Shoulder Pain Rehabilitation,Dengfeng People's Hospital,Dengfeng,Henan 452470,China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-30b on cell proliferation and invasion in gastric cancer and possible molecular mechanism.MethodsqRT-PCR was utilized to detect expression of miR-30b in gastric cancer and adjacent tissues.HGC-27 cell line was transfected with miRNA-30b mimics or inhibitor.Cellproliferation and cellinvasion was determined by CCK-8 assay and Trans well assay,respectively.RAB22A and USP47 were measured by Western blot.ResultsThe expression of miRNA-30b in gastric cancer tissues was significantly decreased compared with adjacent tissues(P＜0.05),and low expression of miRNA-30b was closely associated with stage as well as size of tumor(P＜0.05).HGC-27 cell proliferation and invasion were significantly decreased by miRNA-30b mimics transfection compared with control group (P＜0.05),which was attenuated by treatment of miRNA-30b inhibitor(P＜0.05).Expression levels of RAB22A and USP47 were decreased after miRNA-30b mimics transfection compared with control group (P＜0.05),which was attenuated by treatment of miRNA-30b inhibitor (P＜0.05).ConclusionsThe expression of miRNA-30b in gastric cancer is decreased,and miRNA-30b may inhibit the cell proliferation and invasion of the cancer cells through manipulation of RAB22A and USP47 pathway.

gastric cancer;miRNA-30b;cell proliferation;cell invasion;RAB22A;USP47

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.009

1005-8982（2017）27-0045-06

2017-05-24

張洪杰，Tel：15617801980；E-mail：983441262@qq.com