• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性單核細胞白血病全基因組微小RNA的表達譜分析*

    2017-11-28 02:20:33林小聰李寧符偉玉蘭柳波張海濤張宇明
    關(guān)鍵詞:文庫單核細胞白血病

    林小聰 ,李寧 ,符偉玉 ,蘭柳波 ,張海濤 ,張宇明

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科,廣東 湛江 524001)

    急性單核細胞白血病全基因組微小RNA的表達譜分析*

    林小聰1,李寧2,符偉玉1,蘭柳波1,張海濤1,張宇明2

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科,廣東 湛江 524001)

    目的研究急性單核細胞白血?。ˋMoL)全基因組的微小RNA(miRNA)表達譜。方法應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對10例AMoL患者和10例非惡性血液病患者骨髓樣本的miRNA表達水平進行檢測,分析兩者的表達差異,并通過莖環(huán)引物實時熒光定量 PCR(Stem-loop qPCR)技術(shù)對部分Illumina測序結(jié)果進行驗證。結(jié)果兩組樣本共發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA 285個,其中,199個miRNA在AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。6個miRNA的Stem-loop qPCR驗證結(jié)果與其測序結(jié)果具有相同的變化趨勢。結(jié)論miR-126-3p和miR-29b-3p可作為潛在的分子靶點用于AMoL發(fā)病機制的進一步研究。

    急性單核細胞白血??;微小RNA;測序

    急性單核細胞白血?。╝cutemonocytic leukemia,AMoL)為急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)最常見的亞型之一;其病例數(shù)約占AML 20%~30%,在各種AML亞型中居第2位[1]。相比于其他的AML亞型,AMoL高白細胞血癥、髓外浸潤以及不良染色體核型的發(fā)生率更高,常規(guī)化療完全緩解率低、容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不佳[1-2]。目前,AMoL的發(fā)病機制仍未完全明確,可能與電離輻射、染色體異常及基因突變等多種因素有關(guān)[3]。為尋找新的治療靶點,迫切需要對AMoL的發(fā)病機制進行進一步研究。微小 RNA(micro ribonucleic acid,miRNA)是一類內(nèi)源性、具有基因表達調(diào)控功能的小分子單鏈非編碼RNA,長度約為 18~25 個核苷酸(nt)[4]。研究表明,miRNA與白血病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),可能成為白血病潛在的治療靶點[5]。為闡明AMoL的miRNA表達譜,本研究應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對AMoL與對照組骨髓樣本的miRNA表達水平進行對比分析,為研究AMoL相關(guān)發(fā)病機制和尋找新型的分子靶點提供新的線索。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    收集來自于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科10例AMoL患者(男性6例,女性4例;年齡14~64歲,平均41.2歲)和10例非惡性血液病對照者(骨髓象正常的貧血或發(fā)熱查因患者,男性6例,女性4例;年齡10~73歲,平均39.0歲)的骨髓樣本。所有AMoL患者均為初發(fā)病例,在采樣前均未接受放療或化療,且符合AMoL的診斷標準。本研究已獲得廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準,并取得所有患者的知情同意。

    1.2 主要試劑

    無RNase的DnaseⅠ(購自美國Promega公司),Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司),Small RNA測序接頭、TruSeq Rapid SR cluster試劑盒以及Tru Seq Rapid SBS試劑盒(美國Illumina公司產(chǎn)品),SuperscriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(購自美國Invitrogen公司),2×SYBR Green PCR混合液(美國 Applied Biosystems公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 總RNA樣品的提取 根據(jù)Trizol試劑說明書抽提組織總RNA,以無RNase的DnaseⅠ消化以去除基因組DNA污染。20例RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等質(zhì)量混合,在230、260及280 nm波長以Nano Drop ND-1000型分光光度計測定其吸光度(A)值,計算RNA樣品的濃度并分析其純度,通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性。

    1.3.2 Small RNAs文庫構(gòu)建和Illumina測序RNA樣品在T4RNA連接酶的催化下加上3’、5’small RNA測序接頭,所得產(chǎn)物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增及聚丙烯胺凝膠電泳純化生成Small RNAs文庫。以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進行定量分析。應(yīng)用Illumina cBot簇生成系統(tǒng),按照TruSeq Rapid SR cluster試劑盒說明書,對文庫進行克隆擴增;然后根據(jù)TruSeq Rapid SBS試劑盒說明書,在Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)上行高通量深度測序。

    1.3.3 測序數(shù)據(jù)的處理和注釋 以O(shè)ff-Line Basecaller軟件對高通量測序所生成的原始圖像進行分析,讀取堿基序列信息并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的數(shù)據(jù)。然后,經(jīng)去接頭、去冗余、去低質(zhì)量以及去污染等處理,獲得16~30 nt長度的高質(zhì)量干凈序列并進行序列長度分布分析。將干凈序列分別與RefSeq數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫以及RepBase數(shù)據(jù)庫進行序列比對和分類注釋,去除mRNA、重復(fù)序列、tRNA、rRNA、snRNA以及sRNA等序列;余下序列再與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知的人類pre-miRNA進行序列比對和注釋,獲取兩樣本miRNA的表達豐度和染色體分布等信息。

    1.3.4 miRNA的差異表達分析 首先對兩樣本miRNA的表達豐度進行標準化處理 [公式:miRNA的標準化表達豐度(normalization of the calculation of transcript parts per million,TPM)=miRNA 的表達豐度/樣本miRNA的總表達豐度×106],然后再計算兩樣本的miRNA差異表達比值 [公式:miRNA的差異表達比值=(AMoL組miRNA標準化表達豐度值+10TPM)/(對照組miRNA標準化表達豐度值+10TPM)]。如果差異表達比值≤0.5或≥2.0,則為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;如果0.5<比值<2.0則為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    1.3.5 莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(stem-loop primer-based quantitative real-time polymerase chain reaction,Stem-loop,qRT-PCR)利用 miRNA 的莖環(huán)(Stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物,根據(jù)SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用ABI公司Prism7500型qRT-PCR儀,參照2×SYBR Green PCR混合液說明書,以U6 snRNA作為內(nèi)參照進行qRT-PCR。反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)反應(yīng)10 min,使模板完全解鏈。然后95℃變性10s,60℃退火及延伸60s,重復(fù)40個循環(huán)。檢測結(jié)果計算采用常規(guī)的2-△△Ct法。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表達,比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 總RNA的質(zhì)量分析

    提取的組織RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等量混合后,對其進行純度分析(見表1)和RNA完整性分析(見圖1)。結(jié)果表明,其A260/A280比值都在1.8~2.0,且A260/A230比值都>1.8,提示樣本RNA的純度較高、質(zhì)量良好。電泳結(jié)果顯示兩組總RNA均可見18和28 S 2條清晰的條帶,而5 S的條帶則比較模糊(見圖1);提示RNA的完整性好。上述結(jié)果表明,總RNA的質(zhì)量符合實驗要求,可用于后續(xù)Small RNAs文庫的構(gòu)建。

    2.2 Small RNAs文庫的質(zhì)量評估

    以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進行質(zhì)量分析(見表2)。結(jié)果表明,兩樣本Small RNAs文庫的片段長度峰值均在130~155 nt且其摩爾數(shù)>1 fmol,提示Small RNAs文庫的質(zhì)量良好,可用于后續(xù)的克隆擴增和測序分析。

    2.3 Small RNA干凈序列的長度分布和分類注釋

    Small RNA干凈序列(16~30 nt)的長度分布分析表明,對照組及AMoL組的干凈序列均大致呈正態(tài)分布在22 nt序列兩側(cè)(見圖2)。其中,符合miRNA片段長度(18~25 nt)的干凈序列所占的比例最高,其在對照組與AMoL組分別占93.70%和82.31%。干凈序列的序列比對和分類注釋表明,miRNA在對照組(占80.05%)及AMoL組(占54.44%)所占的比例最高,兩者均>50%(見圖3)。上述數(shù)據(jù)初步驗證Illumina測序結(jié)果的有效性。

    表1 總RNA的純度分析

    圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    表2 Small RNAs文庫的定量分析

    2.4 miRNA的差異表達譜分析

    兩組樣本發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA 285個。其中,199個miRNA在 AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。hsa-miR-122-5p在AMoL組表達上調(diào)最顯著,而hsa-miR-941則表達下調(diào)最明顯。見表3。

    圖2 Small RNA干凈序列的長度分布

    圖3 匹配的干凈序列的分類注釋

    表3 前10個表達上調(diào)和下調(diào)miRNA的差異

    2.5 Stem-loop qRT-PCR驗證結(jié)果

    為驗證Illumina測序結(jié)果的可靠性,筆者選擇2個表達上調(diào)(miRNA-155-5p和miRNA-221-3p)、2個表達下調(diào)(miRNA-106b-5p和miRNA-142-3p)以及2個表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義miRNA(miRNA-532-5p和miRNA-423-5p)進行Stem-loop qRT-PCR驗證。結(jié)果表明,上述6個miRNA在兩組樣本中的變化趨勢與Illumina測序結(jié)果一致(見表4),說明Illumina測序結(jié)果可靠、有效。

    表4 Illumina測序結(jié)果的Stem-loop qRT-PCR驗證

    3 討論

    作為一種具有基因表達調(diào)控功能的內(nèi)源性小片段單鏈RNA,miRNA與白血病關(guān)系密切。研究表明,>60%的miRNA基因存在于白血病相關(guān)的染色體易位區(qū),多種miRNA可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及凋亡與耐藥等相關(guān)基因的表達在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可能成為白血病潛在的診斷標志物和分子靶點[6-7]。但目前尚無通過Illumina高通量測序技術(shù)在AMoL患者臨床樣本中系統(tǒng)性研究miRNA表達譜的報道。本結(jié)果表明,兩者的miRNA表達譜存在較大的差異,兩組樣本共鑒定差異表達的miRNA 285個,其中,199個miRNA在AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。筆者隨后選取6個miRNA,應(yīng)用Stem-loop qRT-PCR技術(shù)證實Illumina測序結(jié)果的可靠性。

    miRNA-29b-3p是一種基因定位于染色體7q32和1q32的miRNA分子,在胃癌、前列腺癌及肺癌等多種實體瘤以及AML中呈低表達;在AML中,染色體7q缺失或CEBPA基因功能障礙可導(dǎo)致miRNA-29b-3p 表達下調(diào)[8]。GONG 等[9]報道,miRNA-29b-3p可通過作用于其靶基因CCND2和AKT2,抑制AMoL細胞系THP1增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究表明,miRNA-29b-3p在AMoL患者骨髓樣本中表達呈下調(diào),與文獻報道基本相符,提示miRNA-29b-3p在AMoL發(fā)病機制中可能起一定的作用。相比于其他的AML亞型,miRNA-199b-5p在AMoL臨床樣本中呈異常低表達,并與AMoL患者預(yù)后呈正相關(guān);組蛋白脫乙?;敢种苿〢R-42和Panobinostat可通過上調(diào)hsa-miRNA-199b-5p表達誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡[10]。筆者研究發(fā)現(xiàn),miRNA-199b-5p在AMoL樣本中也呈低表達,與文獻報道一致,提示miRNA-199b-5p可能與AMoL發(fā)病機制相關(guān)。

    miRNA-126基因在染色體上定位于9q34.3,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為miRNA-126-5p和miRNA-126-3p。研究表明,miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AML中均呈高表達并與患者預(yù)后呈負相關(guān)[11]。LEEUW等[12]發(fā)現(xiàn),沉默miRNA-126-3p表達可抑制THP1細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制NOD/SCID小鼠移植瘤的生長。提示miRNA-126-3p在AMoL中可能具有潛在的癌基因活性。本組miRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AMoL中均呈表達上調(diào),與文獻報道基本相符。HO等[13]報道,miRNA-135b-5p在依托泊甙以及替尼泊苷耐藥的白血病細胞中呈表達上調(diào),其過表達可誘導(dǎo)白血病細胞對依托泊甙以及替尼泊苷產(chǎn)生耐藥性。此外,miRNA-135b-5p在AMoL細胞系U937以及THP-1中過表達均可下調(diào)Ppm1e并激活A(yù)MPK[14]。研究表明,AMPK激活在AMoL細胞凋亡過程中起重要作用;骨髓脂肪細胞β-氧化所介導(dǎo)AMPK的激活可抑制AMoL細胞凋亡并促進細胞增殖[15]。本組miRNA-135b-5p在AMoL樣本中也呈高表達,與文獻報道基本相符,提示miRNA-135b-5p在AMoL細胞凋亡過程中可能起一定的抑制作用,具有潛在的研究價值。

    綜上所述,AMoL患者與非惡性血液病對照者骨髓樣本的miRNA表達譜存在較大的差異。根據(jù)其差異表達趨勢與文獻報道的符合程度,筆者得到5個與AMoL發(fā)病機制有密切關(guān)系的miRNA(包括miRNA-29b-3p、miRNA-199b-5p、miRNA-126-3p、miRNA-126-5p 及 miRNA-135b-5p)。其中,miRNA-126-3p的差異表達比值最大,呈明顯的表達上調(diào);而miRNA-29b-3p的差異表達比值最小,呈明顯的表達下調(diào);再加上已有文獻證實兩者在AMoL細胞增殖和凋亡過程中具有重要作用。因此,miRNA-126-3p和miRNA-29b-3p可作為潛在的分子靶點用于AMoL發(fā)病機制的進一步研究。

    [1]胡映歆,仇紅霞.急性單核細胞白血病預(yù)后因素研究進展[J].國際輸血及血液學(xué)雜志,2012,35(1):62-65.

    [2]張靜,秦鐵軍,秘營昌,等.急性單核細胞白血病的臨床研究[J].臨床血液學(xué)雜志,2010,23(9):536-539.

    [3]程譯幟,金潔.急性粒-單核及單核細胞白血病研究進展[J].國際輸血及血液學(xué)雜志,2008,31(3):243-246.

    [4]THOMSON D W,BRACKEN C P,GOODALL G J.Experimental strategies for microRNA targetidentification[J].Nucleic Acids Res,2011,39(16):6845-6853.

    [5]何冬梅,吳紅,高楊軍,等.MicroRNA在白血病中的研究新進展[J].暨南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,32(4):362-368.

    [6]王梓,李善妮,劉靜.microRNA在急性淋巴細胞白血病中的作用[J].生命科學(xué)研究,2012,16(2):172-180.

    [7]楊洋,王莉莉,于力.表觀遺傳調(diào)控在白血病發(fā)生中作用的研究進展-MicroRNA與白血病 [J].中國實驗血液學(xué)雜志,2010,18(2):520-524.

    [8]LIU H, WANG B, LIN J, et al. microRNA-29b: an emerging player in human cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(21):9059-9064.

    [9]GONG J N, YU J, LIN H S, et al. The role, mechanism and potentially therapeutic application of microRNA-29 family in acute myeloid leukemia[J]. Cell Death Differ, 2014, 21(1): 100-112.

    [10]FAVREAU A J, MCGLAUFLIN R E, DUARTE C W, et al.MiR-199b, a novel tumor suppressor miRNA in acute myeloid leukemia with prognostic implications [J]. Exp Hematol Oncol,2016, 5(1): 4.

    [11]SHIBAYAMA Y, KONDO T, OHYA H, et al. Upregulation of microRNA-126-5p is associated with drug resistance to cytarabine and poor prognosis in AML patients[J]. Oncol Rep, 2015,33(5): 2176-2182.

    [12]de LEEUW D C,DENKERS F,OLTHOF M C,et al.Attenuation of micro RNA-126 expression that drives CD34+38-stem/progenitor cells in acute myeloid leukemia leads to tumor eradication[J].Cancer Res,2014,74(7):2094-2105.

    [13]HO T T, HE X, MO Y Y, et al. Transient resistance to DNA damaging agents is associated with expression of microRNAs-135band-196b in human leukemia cell lines[J]. Int J Biochem MolBiol, 2016, 7(2): 27-47.

    [14]LI P, FAN J B, GAO Y, et al. miR-135b-5p inhibits LPS-induced TNF-α production via silencing AMPK phosphatase Ppm1e[J]. Oncotarget, 2016, 7(47): 77978-77986.

    [15]TABE Y, YAMAMOTO S, SAITOH K, et al. Bone marrow adipocytes facilitate fatty acid oxidation activating AMPK and a transcriptional network supporting survival of acute monocytic leukemia cells[J]. Cancer Res, 2017, 77(6): 1453-1464.

    (王榮兵 編輯)

    Whole-genome analysis profile of MicroRNA in acute monocytic leukemia*

    Xiao-cong Lin1,Ning Li2,Wei-yu Fu1,Liu-bo Lan1,Hai-tao Zhang1,Yu-ming Zhang2
    (1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524023,China;2.Department of Hematology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524001,China)

    ObjectiveTo investigate the whole-genome MicroRNA (miRNA)profile in acute monocytic leukemia (AMoL).MethodsIllumina high-throughput sequencing technology was utilized to screen differentially expressed miRNA in bone marrow samples of 10 AMoL patients as well as 10 patients with non-malignant hematologic diseases.Stem-loop primer-based real-time quantitative polymerase chain reaction(Stem-loop qPCR)was carried out to validate the sequencing data.ResultsIn total of 285 differentially expressed miRNAs,199 up-regulated and 86 down-regulated miRNAs were identified in AMoL patients compared with the control group.Further stem-loop qPCR results confirmed similar expression of 6 miRNAs identified by sequencing.ConclusionsMiR-126-3p and miR-29b-3p can be potential targets for further study of AMoL.

    acute monocytic leukemia;micro ribonucleic acid;sequencing

    R394.3

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.007

    1005-8982(2017)27-0032-05

    2017-05-21

    廣東省自然科學(xué)基金(No:2016A030313677);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No:A2016193)

    張宇明,E-mail:13670982222@163.com

    猜你喜歡
    文庫單核細胞白血病
    白血病男孩終于摘到了星星
    軍事文摘(2024年2期)2024-01-10 01:59:00
    專家文庫
    優(yōu)秀傳統(tǒng)文化啟蒙文庫
    幽默大師(2020年10期)2020-11-10 09:07:22
    關(guān)于推薦《當代詩壇百家文庫》入選詩家的啟事
    中華詩詞(2019年1期)2019-11-14 23:33:56
    專家文庫
    一例蛋雞白血病繼發(fā)細菌感染的診治
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    單核細胞18F-FDG標記與蛛網(wǎng)膜下腔示蹤研究
    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細胞TLR2的表達及意義
    單核細胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分離鑒定及其抑菌活性
    熟女人妻精品中文字幕| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 黄色一级大片看看| 欧美人与善性xxx| 久久久久久久久久成人| 五月开心婷婷网| 大香蕉久久网| 90打野战视频偷拍视频| 日本免费在线观看一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av网站免费在线观看视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 亚洲四区av| av在线app专区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人亚洲欧美一区二区av| 国产黄频视频在线观看| 多毛熟女@视频| 亚洲精品日本国产第一区| 久久这里有精品视频免费| 看十八女毛片水多多多| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲国产精品一区三区| 婷婷成人精品国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 色吧在线观看| 下体分泌物呈黄色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品女同一区二区软件| 国产日韩欧美视频二区| 热99久久久久精品小说推荐| 黄片无遮挡物在线观看| 搡老乐熟女国产| 免费黄色在线免费观看| 亚洲国产精品999| 2022亚洲国产成人精品| av一本久久久久| 九色亚洲精品在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 热re99久久国产66热| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| www.av在线官网国产| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看美女被高潮喷水网站| 三级国产精品片| 97超碰精品成人国产| 国产黄色免费在线视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 啦啦啦在线观看免费高清www| 一本大道久久a久久精品| videos熟女内射| 99国产综合亚洲精品| 亚洲伊人久久精品综合| 又黄又粗又硬又大视频| 成年人免费黄色播放视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕最新亚洲高清| 久久国产亚洲av麻豆专区| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久精品性色| 婷婷成人精品国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| av有码第一页| 精品福利永久在线观看| 日本午夜av视频| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲欧美清纯卡通| 在线观看免费视频网站a站| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品酒店卫生间| 视频区图区小说| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久狼人影院| 国产精品无大码| xxxhd国产人妻xxx| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品熟女少妇av免费看| 搡老乐熟女国产| 久久精品久久久久久久性| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 波多野结衣一区麻豆| 久久97久久精品| 中文字幕免费在线视频6| 五月开心婷婷网| 亚洲国产精品专区欧美| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费看光身美女| 国产国语露脸激情在线看| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美色中文字幕在线| 男女免费视频国产| 人人澡人人妻人| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美性感艳星| av黄色大香蕉| 亚洲精品视频女| 亚洲情色 制服丝袜| 黄色 视频免费看| 看十八女毛片水多多多| 午夜久久久在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人91sexporn| 亚洲四区av| 国产av一区二区精品久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜91福利影院| 国产xxxxx性猛交| 精品人妻偷拍中文字幕| 高清不卡的av网站| 久久狼人影院| 伊人亚洲综合成人网| 国产黄色免费在线视频| 一级爰片在线观看| h视频一区二区三区| 天天影视国产精品| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产国语露脸激情在线看| xxx大片免费视频| av在线播放精品| 最近的中文字幕免费完整| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 丝瓜视频免费看黄片| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲成色77777| 制服诱惑二区| 国产精品免费大片| 性色avwww在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品久久久久久电影网| 秋霞在线观看毛片| 国产男女超爽视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清视频免费观看一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲av综合色区一区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 久久ye,这里只有精品| 久久久久久人人人人人| 国产成人精品无人区| 在线观看国产h片| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲欧美精品自产自拍| 国精品久久久久久国模美| 国产高清三级在线| 99香蕉大伊视频| 性色avwww在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 中国国产av一级| 久久精品国产a三级三级三级| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产1区2区3区精品| 一级爰片在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成色77777| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 欧美精品一区二区大全| 久久 成人 亚洲| 国产成人精品一,二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热re99久久国产66热| h视频一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 一级黄片播放器| 久久女婷五月综合色啪小说| www.熟女人妻精品国产 | 777米奇影视久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产高清不卡午夜福利| 观看美女的网站| 久久免费观看电影| 深夜精品福利| 日韩一区二区视频免费看| 国产不卡av网站在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国内精品宾馆在线| 国产日韩欧美在线精品| 日本黄大片高清| 黑人高潮一二区| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久国产欧美日韩av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 女人精品久久久久毛片| 一本久久精品| 国产高清三级在线| 亚洲av日韩在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产精品偷伦视频观看了| 青春草亚洲视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 99视频精品全部免费 在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲,欧美,日韩| 色吧在线观看| 99热全是精品| 成年人免费黄色播放视频| 七月丁香在线播放| 国产 精品1| 人妻 亚洲 视频| 国产精品偷伦视频观看了| 黄色毛片三级朝国网站| 伊人久久国产一区二区| 满18在线观看网站| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲中文av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲性久久影院| 又大又黄又爽视频免费| 大香蕉97超碰在线| 五月天丁香电影| 成人综合一区亚洲| 一级片免费观看大全| 制服人妻中文乱码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲av电影在线进入| 日韩三级伦理在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲中文av在线| 国产麻豆69| 国内精品宾馆在线| 亚洲国产精品999| 美女国产视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲成色77777| 久久久久久伊人网av| 少妇 在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜91福利影院| 日韩视频在线欧美| 免费人妻精品一区二区三区视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久国产欧美日韩av| 欧美精品一区二区大全| 9色porny在线观看| 内地一区二区视频在线| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕亚洲精品专区| av.在线天堂| 久久ye,这里只有精品| 韩国精品一区二区三区 | 老司机亚洲免费影院| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 男男h啪啪无遮挡| 伊人久久国产一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品免费大片| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩综合久久久久久| 最黄视频免费看| 高清欧美精品videossex| 日韩欧美一区视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品三级大全| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 中文天堂在线官网| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 大香蕉久久网| 亚洲av男天堂| 在线 av 中文字幕| 免费人成在线观看视频色| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 午夜福利视频在线观看免费| 超色免费av| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲丝袜综合中文字幕| av免费观看日本| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品乱久久久久久| 久久精品夜色国产| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产av码专区亚洲av| 伦理电影免费视频| 国产色爽女视频免费观看| 制服诱惑二区| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久久久久久免费av| 97在线视频观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产av一区二区精品久久| 免费观看在线日韩| 亚洲美女视频黄频| 久久精品国产综合久久久 | 国产精品国产三级专区第一集| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品国产av在线观看| 男的添女的下面高潮视频| a级毛片在线看网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| a级毛色黄片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久影院123| 性色av一级| 成年人免费黄色播放视频| 26uuu在线亚洲综合色| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99久久人妻综合| 最近中文字幕2019免费版| 97在线视频观看| 韩国精品一区二区三区 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 乱人伦中国视频| 在线天堂最新版资源| 精品人妻在线不人妻| 久久精品人人爽人人爽视色| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本欧美国产在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产免费一级a男人的天堂| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 深夜精品福利| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品夜色国产| 波多野结衣一区麻豆| 久久ye,这里只有精品| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲美女视频黄频| 美国免费a级毛片| 美女中出高潮动态图| 视频在线观看一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产av一区二区精品久久| 国产黄频视频在线观看| 高清不卡的av网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 永久免费av网站大全| av天堂久久9| 国产一区有黄有色的免费视频| 日本午夜av视频| 国产精品一区www在线观看| videosex国产| 欧美性感艳星| 免费少妇av软件| 只有这里有精品99| a级毛片黄视频| 国产av码专区亚洲av| 国精品久久久久久国模美| 国产高清三级在线| 大香蕉久久成人网| 男男h啪啪无遮挡| 久久这里有精品视频免费| 亚洲美女视频黄频| 日韩 亚洲 欧美在线| 伦理电影大哥的女人| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 色哟哟·www| 国产精品久久久久久久久免| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产免费又黄又爽又色| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 两个人免费观看高清视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 尾随美女入室| 久久久久久伊人网av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人精品福利久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产有黄有色有爽视频| 久久ye,这里只有精品| 伊人久久国产一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 捣出白浆h1v1| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 成人综合一区亚洲| 一本色道久久久久久精品综合| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 如何舔出高潮| 亚洲熟女精品中文字幕| 韩国高清视频一区二区三区| 色94色欧美一区二区| 高清不卡的av网站| 不卡视频在线观看欧美| 黄片播放在线免费| 尾随美女入室| av天堂久久9| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av成人精品一二三区| 美女视频免费永久观看网站| 日本av免费视频播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久人妻熟女aⅴ| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美精品自产自拍| 老司机亚洲免费影院| 制服丝袜香蕉在线| 午夜老司机福利剧场| 国产成人精品福利久久| 日本av手机在线免费观看| 亚洲,欧美精品.| 在线观看国产h片| 夜夜爽夜夜爽视频| 七月丁香在线播放| av线在线观看网站| av免费观看日本| 少妇 在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品少妇久久久久久888优播| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 婷婷色综合www| 九九在线视频观看精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产黄频视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美+日韩+精品| 精品一区二区免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 两性夫妻黄色片 | 免费看光身美女| 综合色丁香网| 尾随美女入室| 国产片内射在线| 99久久人妻综合| 97超碰精品成人国产| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产成人精品一,二区| 国产成人精品婷婷| 精品一区二区三卡| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲伊人色综图| 久久久久精品久久久久真实原创| 蜜桃国产av成人99| 香蕉国产在线看| 久久精品久久久久久久性| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 国产有黄有色有爽视频| 热re99久久国产66热| 亚洲中文av在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 两个人免费观看高清视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费少妇av软件| 在线观看三级黄色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美3d第一页| a级毛片在线看网站| 亚洲精品国产av成人精品| 免费看光身美女| 国产精品免费大片| 日本欧美视频一区| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品中文字幕在线视频| 全区人妻精品视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产成人免费无遮挡视频| 成年人免费黄色播放视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩三级伦理在线观看| 老女人水多毛片| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 大码成人一级视频| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩av免费高清视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 色哟哟·www| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 91精品国产国语对白视频| 岛国毛片在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 女人久久www免费人成看片| 99久久综合免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 婷婷色综合www| 日本黄大片高清| a级毛片黄视频| 男女边摸边吃奶| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 视频区图区小说| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩三级伦理在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 色哟哟·www| 国产不卡av网站在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲性久久影院| 免费观看av网站的网址| 99久久综合免费| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 在线 av 中文字幕| 天天操日日干夜夜撸| 婷婷色综合www| 插逼视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日本wwww免费看| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 韩国av在线不卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本欧美视频一区| 久久综合国产亚洲精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品,欧美精品| 国产爽快片一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 热99久久久久精品小说推荐| 国产av国产精品国产| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久久精品精品| 国产精品久久久久久久电影| 97精品久久久久久久久久精品| 日本午夜av视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久ye,这里只有精品| 成人免费观看视频高清| 美女国产高潮福利片在线看| 国产 一区精品| 十八禁高潮呻吟视频| 一级毛片电影观看| 国产在线免费精品| 高清欧美精品videossex| av在线观看视频网站免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人精品婷婷| 亚洲在久久综合| av电影中文网址| 2022亚洲国产成人精品| 久久久久久人妻| 国产一区亚洲一区在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 中文天堂在线官网| 中文字幕制服av| 大片电影免费在线观看免费| 久久久欧美国产精品| 99久久综合免费| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 大话2 男鬼变身卡| 另类精品久久| 桃花免费在线播放| 97超碰精品成人国产| 亚洲成人手机| 精品福利永久在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人91sexporn| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日日爽夜夜爽网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜激情av网站| 免费观看a级毛片全部| 国产乱人偷精品视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 热re99久久国产66热| 国产精品 国内视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 一级爰片在线观看| av天堂久久9|