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    急性單核細胞白血病全基因組微小RNA的表達譜分析*

    2017-11-28 02:20:33林小聰李寧符偉玉蘭柳波張海濤張宇明
    關(guān)鍵詞:文庫單核細胞白血病

    林小聰 ,李寧 ,符偉玉 ,蘭柳波 ,張海濤 ,張宇明

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科,廣東 湛江 524001)

    急性單核細胞白血病全基因組微小RNA的表達譜分析*

    林小聰1,李寧2,符偉玉1,蘭柳波1,張海濤1,張宇明2

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科,廣東 湛江 524001)

    目的研究急性單核細胞白血?。ˋMoL)全基因組的微小RNA(miRNA)表達譜。方法應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對10例AMoL患者和10例非惡性血液病患者骨髓樣本的miRNA表達水平進行檢測,分析兩者的表達差異,并通過莖環(huán)引物實時熒光定量 PCR(Stem-loop qPCR)技術(shù)對部分Illumina測序結(jié)果進行驗證。結(jié)果兩組樣本共發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA 285個,其中,199個miRNA在AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。6個miRNA的Stem-loop qPCR驗證結(jié)果與其測序結(jié)果具有相同的變化趨勢。結(jié)論miR-126-3p和miR-29b-3p可作為潛在的分子靶點用于AMoL發(fā)病機制的進一步研究。

    急性單核細胞白血??;微小RNA;測序

    急性單核細胞白血?。╝cutemonocytic leukemia,AMoL)為急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)最常見的亞型之一;其病例數(shù)約占AML 20%~30%,在各種AML亞型中居第2位[1]。相比于其他的AML亞型,AMoL高白細胞血癥、髓外浸潤以及不良染色體核型的發(fā)生率更高,常規(guī)化療完全緩解率低、容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不佳[1-2]。目前,AMoL的發(fā)病機制仍未完全明確,可能與電離輻射、染色體異常及基因突變等多種因素有關(guān)[3]。為尋找新的治療靶點,迫切需要對AMoL的發(fā)病機制進行進一步研究。微小 RNA(micro ribonucleic acid,miRNA)是一類內(nèi)源性、具有基因表達調(diào)控功能的小分子單鏈非編碼RNA,長度約為 18~25 個核苷酸(nt)[4]。研究表明,miRNA與白血病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),可能成為白血病潛在的治療靶點[5]。為闡明AMoL的miRNA表達譜,本研究應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對AMoL與對照組骨髓樣本的miRNA表達水平進行對比分析,為研究AMoL相關(guān)發(fā)病機制和尋找新型的分子靶點提供新的線索。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    收集來自于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科10例AMoL患者(男性6例,女性4例;年齡14~64歲,平均41.2歲)和10例非惡性血液病對照者(骨髓象正常的貧血或發(fā)熱查因患者,男性6例,女性4例;年齡10~73歲,平均39.0歲)的骨髓樣本。所有AMoL患者均為初發(fā)病例,在采樣前均未接受放療或化療,且符合AMoL的診斷標準。本研究已獲得廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準,并取得所有患者的知情同意。

    1.2 主要試劑

    無RNase的DnaseⅠ(購自美國Promega公司),Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司),Small RNA測序接頭、TruSeq Rapid SR cluster試劑盒以及Tru Seq Rapid SBS試劑盒(美國Illumina公司產(chǎn)品),SuperscriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(購自美國Invitrogen公司),2×SYBR Green PCR混合液(美國 Applied Biosystems公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 總RNA樣品的提取 根據(jù)Trizol試劑說明書抽提組織總RNA,以無RNase的DnaseⅠ消化以去除基因組DNA污染。20例RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等質(zhì)量混合,在230、260及280 nm波長以Nano Drop ND-1000型分光光度計測定其吸光度(A)值,計算RNA樣品的濃度并分析其純度,通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性。

    1.3.2 Small RNAs文庫構(gòu)建和Illumina測序RNA樣品在T4RNA連接酶的催化下加上3’、5’small RNA測序接頭,所得產(chǎn)物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增及聚丙烯胺凝膠電泳純化生成Small RNAs文庫。以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進行定量分析。應(yīng)用Illumina cBot簇生成系統(tǒng),按照TruSeq Rapid SR cluster試劑盒說明書,對文庫進行克隆擴增;然后根據(jù)TruSeq Rapid SBS試劑盒說明書,在Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)上行高通量深度測序。

    1.3.3 測序數(shù)據(jù)的處理和注釋 以O(shè)ff-Line Basecaller軟件對高通量測序所生成的原始圖像進行分析,讀取堿基序列信息并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的數(shù)據(jù)。然后,經(jīng)去接頭、去冗余、去低質(zhì)量以及去污染等處理,獲得16~30 nt長度的高質(zhì)量干凈序列并進行序列長度分布分析。將干凈序列分別與RefSeq數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫以及RepBase數(shù)據(jù)庫進行序列比對和分類注釋,去除mRNA、重復(fù)序列、tRNA、rRNA、snRNA以及sRNA等序列;余下序列再與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知的人類pre-miRNA進行序列比對和注釋,獲取兩樣本miRNA的表達豐度和染色體分布等信息。

    1.3.4 miRNA的差異表達分析 首先對兩樣本miRNA的表達豐度進行標準化處理 [公式:miRNA的標準化表達豐度(normalization of the calculation of transcript parts per million,TPM)=miRNA 的表達豐度/樣本miRNA的總表達豐度×106],然后再計算兩樣本的miRNA差異表達比值 [公式:miRNA的差異表達比值=(AMoL組miRNA標準化表達豐度值+10TPM)/(對照組miRNA標準化表達豐度值+10TPM)]。如果差異表達比值≤0.5或≥2.0,則為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;如果0.5<比值<2.0則為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    1.3.5 莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(stem-loop primer-based quantitative real-time polymerase chain reaction,Stem-loop,qRT-PCR)利用 miRNA 的莖環(huán)(Stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物,根據(jù)SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用ABI公司Prism7500型qRT-PCR儀,參照2×SYBR Green PCR混合液說明書,以U6 snRNA作為內(nèi)參照進行qRT-PCR。反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)反應(yīng)10 min,使模板完全解鏈。然后95℃變性10s,60℃退火及延伸60s,重復(fù)40個循環(huán)。檢測結(jié)果計算采用常規(guī)的2-△△Ct法。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表達,比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 總RNA的質(zhì)量分析

    提取的組織RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等量混合后,對其進行純度分析(見表1)和RNA完整性分析(見圖1)。結(jié)果表明,其A260/A280比值都在1.8~2.0,且A260/A230比值都>1.8,提示樣本RNA的純度較高、質(zhì)量良好。電泳結(jié)果顯示兩組總RNA均可見18和28 S 2條清晰的條帶,而5 S的條帶則比較模糊(見圖1);提示RNA的完整性好。上述結(jié)果表明,總RNA的質(zhì)量符合實驗要求,可用于后續(xù)Small RNAs文庫的構(gòu)建。

    2.2 Small RNAs文庫的質(zhì)量評估

    以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進行質(zhì)量分析(見表2)。結(jié)果表明,兩樣本Small RNAs文庫的片段長度峰值均在130~155 nt且其摩爾數(shù)>1 fmol,提示Small RNAs文庫的質(zhì)量良好,可用于后續(xù)的克隆擴增和測序分析。

    2.3 Small RNA干凈序列的長度分布和分類注釋

    Small RNA干凈序列(16~30 nt)的長度分布分析表明,對照組及AMoL組的干凈序列均大致呈正態(tài)分布在22 nt序列兩側(cè)(見圖2)。其中,符合miRNA片段長度(18~25 nt)的干凈序列所占的比例最高,其在對照組與AMoL組分別占93.70%和82.31%。干凈序列的序列比對和分類注釋表明,miRNA在對照組(占80.05%)及AMoL組(占54.44%)所占的比例最高,兩者均>50%(見圖3)。上述數(shù)據(jù)初步驗證Illumina測序結(jié)果的有效性。

    表1 總RNA的純度分析

    圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    表2 Small RNAs文庫的定量分析

    2.4 miRNA的差異表達譜分析

    兩組樣本發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA 285個。其中,199個miRNA在 AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。hsa-miR-122-5p在AMoL組表達上調(diào)最顯著,而hsa-miR-941則表達下調(diào)最明顯。見表3。

    圖2 Small RNA干凈序列的長度分布

    圖3 匹配的干凈序列的分類注釋

    表3 前10個表達上調(diào)和下調(diào)miRNA的差異

    2.5 Stem-loop qRT-PCR驗證結(jié)果

    為驗證Illumina測序結(jié)果的可靠性,筆者選擇2個表達上調(diào)(miRNA-155-5p和miRNA-221-3p)、2個表達下調(diào)(miRNA-106b-5p和miRNA-142-3p)以及2個表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義miRNA(miRNA-532-5p和miRNA-423-5p)進行Stem-loop qRT-PCR驗證。結(jié)果表明,上述6個miRNA在兩組樣本中的變化趨勢與Illumina測序結(jié)果一致(見表4),說明Illumina測序結(jié)果可靠、有效。

    表4 Illumina測序結(jié)果的Stem-loop qRT-PCR驗證

    3 討論

    作為一種具有基因表達調(diào)控功能的內(nèi)源性小片段單鏈RNA,miRNA與白血病關(guān)系密切。研究表明,>60%的miRNA基因存在于白血病相關(guān)的染色體易位區(qū),多種miRNA可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及凋亡與耐藥等相關(guān)基因的表達在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可能成為白血病潛在的診斷標志物和分子靶點[6-7]。但目前尚無通過Illumina高通量測序技術(shù)在AMoL患者臨床樣本中系統(tǒng)性研究miRNA表達譜的報道。本結(jié)果表明,兩者的miRNA表達譜存在較大的差異,兩組樣本共鑒定差異表達的miRNA 285個,其中,199個miRNA在AMoL組呈表達上調(diào),86個miRNA呈表達下調(diào)。筆者隨后選取6個miRNA,應(yīng)用Stem-loop qRT-PCR技術(shù)證實Illumina測序結(jié)果的可靠性。

    miRNA-29b-3p是一種基因定位于染色體7q32和1q32的miRNA分子,在胃癌、前列腺癌及肺癌等多種實體瘤以及AML中呈低表達;在AML中,染色體7q缺失或CEBPA基因功能障礙可導(dǎo)致miRNA-29b-3p 表達下調(diào)[8]。GONG 等[9]報道,miRNA-29b-3p可通過作用于其靶基因CCND2和AKT2,抑制AMoL細胞系THP1增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究表明,miRNA-29b-3p在AMoL患者骨髓樣本中表達呈下調(diào),與文獻報道基本相符,提示miRNA-29b-3p在AMoL發(fā)病機制中可能起一定的作用。相比于其他的AML亞型,miRNA-199b-5p在AMoL臨床樣本中呈異常低表達,并與AMoL患者預(yù)后呈正相關(guān);組蛋白脫乙?;敢种苿〢R-42和Panobinostat可通過上調(diào)hsa-miRNA-199b-5p表達誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡[10]。筆者研究發(fā)現(xiàn),miRNA-199b-5p在AMoL樣本中也呈低表達,與文獻報道一致,提示miRNA-199b-5p可能與AMoL發(fā)病機制相關(guān)。

    miRNA-126基因在染色體上定位于9q34.3,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為miRNA-126-5p和miRNA-126-3p。研究表明,miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AML中均呈高表達并與患者預(yù)后呈負相關(guān)[11]。LEEUW等[12]發(fā)現(xiàn),沉默miRNA-126-3p表達可抑制THP1細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制NOD/SCID小鼠移植瘤的生長。提示miRNA-126-3p在AMoL中可能具有潛在的癌基因活性。本組miRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AMoL中均呈表達上調(diào),與文獻報道基本相符。HO等[13]報道,miRNA-135b-5p在依托泊甙以及替尼泊苷耐藥的白血病細胞中呈表達上調(diào),其過表達可誘導(dǎo)白血病細胞對依托泊甙以及替尼泊苷產(chǎn)生耐藥性。此外,miRNA-135b-5p在AMoL細胞系U937以及THP-1中過表達均可下調(diào)Ppm1e并激活A(yù)MPK[14]。研究表明,AMPK激活在AMoL細胞凋亡過程中起重要作用;骨髓脂肪細胞β-氧化所介導(dǎo)AMPK的激活可抑制AMoL細胞凋亡并促進細胞增殖[15]。本組miRNA-135b-5p在AMoL樣本中也呈高表達,與文獻報道基本相符,提示miRNA-135b-5p在AMoL細胞凋亡過程中可能起一定的抑制作用,具有潛在的研究價值。

    綜上所述,AMoL患者與非惡性血液病對照者骨髓樣本的miRNA表達譜存在較大的差異。根據(jù)其差異表達趨勢與文獻報道的符合程度,筆者得到5個與AMoL發(fā)病機制有密切關(guān)系的miRNA(包括miRNA-29b-3p、miRNA-199b-5p、miRNA-126-3p、miRNA-126-5p 及 miRNA-135b-5p)。其中,miRNA-126-3p的差異表達比值最大,呈明顯的表達上調(diào);而miRNA-29b-3p的差異表達比值最小,呈明顯的表達下調(diào);再加上已有文獻證實兩者在AMoL細胞增殖和凋亡過程中具有重要作用。因此,miRNA-126-3p和miRNA-29b-3p可作為潛在的分子靶點用于AMoL發(fā)病機制的進一步研究。

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    (王榮兵 編輯)

    Whole-genome analysis profile of MicroRNA in acute monocytic leukemia*

    Xiao-cong Lin1,Ning Li2,Wei-yu Fu1,Liu-bo Lan1,Hai-tao Zhang1,Yu-ming Zhang2
    (1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524023,China;2.Department of Hematology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524001,China)

    ObjectiveTo investigate the whole-genome MicroRNA (miRNA)profile in acute monocytic leukemia (AMoL).MethodsIllumina high-throughput sequencing technology was utilized to screen differentially expressed miRNA in bone marrow samples of 10 AMoL patients as well as 10 patients with non-malignant hematologic diseases.Stem-loop primer-based real-time quantitative polymerase chain reaction(Stem-loop qPCR)was carried out to validate the sequencing data.ResultsIn total of 285 differentially expressed miRNAs,199 up-regulated and 86 down-regulated miRNAs were identified in AMoL patients compared with the control group.Further stem-loop qPCR results confirmed similar expression of 6 miRNAs identified by sequencing.ConclusionsMiR-126-3p and miR-29b-3p can be potential targets for further study of AMoL.

    acute monocytic leukemia;micro ribonucleic acid;sequencing

    R394.3

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.007

    1005-8982(2017)27-0032-05

    2017-05-21

    廣東省自然科學(xué)基金(No:2016A030313677);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No:A2016193)

    張宇明,E-mail:13670982222@163.com

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