髓系抑制性細胞和調(diào)節(jié)性T細胞在小鼠實驗性結(jié)腸炎中的作用*

呂穎 ，盧建華 ，呂卓 ，段媛媛 ，劉志權 ，崔美蘭 ，閆會敏

（河北省石家莊市第五醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學研究中心，2.檢驗科，河北 石家莊 050021；3.河北醫(yī)科大學 研究生學院，河北 石家莊 050017）

髓系抑制性細胞和調(diào)節(jié)性T細胞在小鼠實驗性結(jié)腸炎中的作用*

呂穎1，盧建華2，呂卓3，段媛媛3，劉志權2，崔美蘭1，閆會敏1

（河北省石家莊市第五醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學研究中心，2.檢驗科，河北 石家莊 050021；3.河北醫(yī)科大學 研究生學院，河北 石家莊 050017）

目的探討髓系抑制性細胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法使用5%右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液復制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，每日觀察小鼠體重和大便狀況。DSS處理3和7 d后處死小鼠，蘇木精-伊紅染色法觀察病理組織學變化，流式細胞儀檢測脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中MDSC和Treg細胞的表達。結(jié)果模型組小鼠于造模第4天體重開始下降，有腹瀉和血便，HE染色結(jié)果顯示小鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜損傷及炎癥表現(xiàn)。與對照組和造模3 d組比較，造模7 d組腸系膜淋巴結(jié)中Treg細胞比例增加，而MDSC比例降低；進一步觀察MDSC亞群變化發(fā)現(xiàn)，粒細胞型MDSC在造模7 d組中比例下降，而單核細胞型MDSC則無改變。無論Treg細胞還是MDSC，脾臟中的水平3組比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論急性潰瘍性結(jié)腸炎可導致MDSC降低和Treg細胞增高，可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。

潰瘍性結(jié)腸炎；髓系抑制性細胞；調(diào)節(jié)性T細胞；免疫調(diào)控

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種臨床常見的難治性腸道疾病，因慢性遷延不愈，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量。雖然UC的發(fā)病機制尚未完全闡明，但普遍認為免疫紊亂，特別是效應性CD4+T細胞的過度激活是導致UC發(fā)病的重要原因之一[1]。正常狀態(tài)下，機體存在著許多具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞，該細胞可抑制免疫應答，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）和調(diào)節(jié)性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）是目前已知的兩類重要免疫抑制細胞，MDSC由一群未成熟的高度異質(zhì)性細胞組成，具有廣泛且強大的抑制功能，可抑制T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞，下調(diào)炎癥因子產(chǎn)生[2-3]；而Treg細胞是一群成熟的T細胞亞群，是機體負向調(diào)節(jié)免疫反應及維持免疫穩(wěn)態(tài)的關鍵環(huán)節(jié)，可通過細胞間相互作用及分泌IL-10等抗炎癥因子抑制多種細胞的活性[4]。

MDSC和Treg細胞作為機體免疫調(diào)控的重要細胞，能夠誘導免疫抑制、參與介導免疫耐受，因此，推測UC的發(fā)生、發(fā)展可能與MDSC和Treg細胞的異常表達有關。本研究在建立小鼠急性UC模型的基礎上，檢測不同階段小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC和Treg細胞的比例，以探討MDSC和Treg細胞在UC發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

清潔級BALB/c小鼠[購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003],右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfact sodium，DSS）（購自美國MP Biomedicals公司），小鼠 FITC-CD4、PE-CD25、PE/Cy7-CD127、FITC-CD11b、APC-Ly6G 和 PerCPCy5.5-Ly6C抗體（購自美國BD公司），紅細胞裂解液（購自美國Beckman Coulter公司），F(xiàn)ACS Canto II流式細胞儀（購自美國BD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 復制小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型 選取健康BALB/c小鼠20只，鼠齡6～8周，體重18～22 g。將小鼠隨機分為3組：①對照組（n=6）；②造模3 d組（n=7）；③造模7 d組（n=8）。其中，造模組小鼠分別自由飲用5%DSS溶液3和7 d，以誘導潰瘍性結(jié)腸炎，對照組小鼠給予蒸餾水自由飲用。實驗開始前及開始后每日稱重、觀察大便性狀和有無便血。造模結(jié)束后處死小鼠，測量大腸長度，并取結(jié)腸進行HE染色，分離脾臟及腸系膜淋巴結(jié)制備單細胞懸液。

1.2.2 疾病活動指數(shù) 根據(jù)小鼠體重下降程度、大便性狀和便血情況，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分。見表 1。

表1 小鼠結(jié)腸炎DAI評估表

1.2.3 病理組織學觀察 處死小鼠后，取結(jié)腸組織固定于10%中性甲醛緩沖液，常規(guī)石蠟包埋、切片后進行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 脾臟和淋巴結(jié)單細胞懸液的制備 取出脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，去除周圍脂肪組織，用注射器活塞芯桿的平端在小培養(yǎng)皿中輕輕研磨，過200目細胞篩過濾，1 500 r/min離心后棄上清，紅細胞裂解液將脾臟中紅細胞破除。洗滌2次，重懸細胞后計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度至1×107個/ml。

1.2.5 流式細胞儀檢測MDSC和Treg細胞 取100 μl待測細胞，加至相應的流式管，再加入下述熒光素標記的抗體：Treg細胞：小鼠FITC-CD4，PECD25，PE/Cy7-CD127 或 MDSC：FITC-CD11b，APCLy6G，PerCP-Cy5.5-Ly6C抗體。避光孵育20～30min后，離心洗滌2次，流式細胞儀檢測MDSC和Treg細胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化和DAI評分

對照組和造模3 d組小鼠飲食量及活動狀態(tài)無明顯改變，未見便血，造模7 d組小鼠在造模第4天開始逐漸出現(xiàn)大便松軟或稀糊狀及不同程度的血便。體重相對變化（體重/原始體重×100%）結(jié)果顯示，對照組體重逐漸增加，造模3 d組未見改變，而造模7 d組自第4天開始體重逐漸下降，實驗第6天和第7天低于對照組和造模3 d組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。實驗第7日，造模7 d組DAI評分高于造模3 d組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），大腸長度短于造模3 d組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.016和0.016）。見圖1和表2。

圖1 各組小鼠體重變化比較

表2 各組小鼠終末結(jié)腸長度和DAI評分比較 （±s）

表2 各組小鼠終末結(jié)腸長度和DAI評分比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與造模 3 d 組比較，P ＜0.05

組別 結(jié)腸長度/cm DAI評分對照組 7.65±0.62 0造模 3 d 組 7.61±0.86 2.86±1.071）造模 7 d 組 6.70±0.481）2） 10.25±1.671）2）F值 4.903 137.341 P值 0.020 0.000

2.2 結(jié)腸組織病理學變化

對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列基本整齊，固有層和黏膜層內(nèi)只有少許炎癥細胞浸潤；經(jīng)DSS誘導3 d后，結(jié)腸黏膜腺體排列稍顯紊亂，炎癥細胞浸潤增多；至第7天，結(jié)腸固有腺體減少或缺失，可見潰瘍，杯狀細胞減少，黏膜組織出現(xiàn)彌漫性炎癥細胞浸潤。見圖2。

2.3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細胞的表達

與對照組比較，造模3 d組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中MDSC百分數(shù)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.075），造模7 d組腸系膜淋巴結(jié)中MDSC百分數(shù)較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015）；進一步觀察單核細胞樣MDSC亞群（M-MDSC）和粒細胞樣MDSC亞群（G-MDSC）的比例發(fā)現(xiàn)，造模7 d組G-MDSC百分數(shù)較對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007）。脾臟MDSC及各亞群比例在3組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學變化 （×200）

表3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細胞的表達 （%，±s）

表3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細胞的表達 （%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

組別 脾臟淋巴結(jié)MDSC M-MDSC MDSC M-MDSC G-MDSC對照組 1.93±0.56 1.00±0.15 0.93±0.42 0.73±0.31 0.40±0.23 0.33±0.08造模 3 d 組 1.77±0.32 0.99±0.16 0.77±0.23 0.53±0.12 0.25±0.07 0.28±0.07造模7 d組 2.23±1.30 1.19±0.67 1.04±0.64 0.45±0.06? 0.22±0.03 0.22±0.04?F值 0.586 0.530 0.654 3.875 3.094 4.768 P值 0.567 0.597 0.531 0.042 0.073 0.024 G-MDSC

2.4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細胞的表達

與對照組和造模3 d組比較，造模7 d組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Treg細胞百分率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003和0.002）。脾臟Treg細胞百分率在3組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.426）。見表4。

表4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細胞的表達（%，±s）

表4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細胞的表達（%，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與造模 3 d組比較，P ＜0.05

組別 脾臟 淋巴結(jié)對照組 7.98±1.77 8.28±0.38造模3 d組 8.60±0.57 8.12±1.19造模 7 d 組 7.72±1.35 10.55±1.931）2）F值 0.892 8.101 P值 0.426 0.003

3 討論

雖然UC的發(fā)病機制仍不明確，但免疫紊亂被認為是疾病發(fā)生的重要原因之一，多種免疫學因素與UC發(fā)病密切相關，近年抑制性細胞在UC發(fā)病中的作用引起廣泛關注。MDSC作為獨特的抑制性細胞群體，可通過多種機制負性調(diào)控免疫應答，在腫瘤、炎癥和感染等多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、肝癌和乳腺癌等許多腫瘤組織中存在大量MDSC浸潤，參與腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受等；在肝臟疾病如急性肝損傷、病毒性肝炎和肝纖維化等發(fā)病過程中，MDSC數(shù)量增多且抑制功能增強[5-6]。本研究結(jié)果顯示，隨著炎癥進展，小鼠淋巴結(jié)中MDSC表達逐漸減少，提示MDSC與UC發(fā)病呈負相關。MDSC具有免疫抑制功能，因此，筆者推測急性腸道炎癥發(fā)生可能導致MDSC細胞數(shù)量減少及功能異常，使效應性T細胞的過度活化，黏膜炎癥加重。

小鼠MDSC主要表達CD11b和Gr-1，根據(jù)Gr-1表位不同，可進一步將MDSC分為單核細胞樣MDSC亞群和粒細胞樣MDSC亞群，2種亞群在特征、抑制功能和機制等方面均存在很大差異，其中，M-MDSC表達CD11b+Ly6G+Ly6C+，在形態(tài)上類似于單核/巨噬細胞，主要通過上調(diào)誘導性一氧化氮合成酶、精氨酸酶以及免疫抑制因子發(fā)揮抑制作用；G-MDSC表達CD11b+Ly6G+Ly6C-，形態(tài)上類似于粒系細胞，主要通過產(chǎn)生活性氧化物及與T細胞直接接觸發(fā)揮作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，不同疾病對MDSC亞群的影響不同，YOUN等[8]觀察MDSC亞群在多種荷瘤小鼠中的變化，結(jié)果顯示所有腫瘤小鼠中均存在G-MDSC高表達，而M-MDSC僅在少數(shù)模型小鼠中增高；HOCHST等[9]發(fā)現(xiàn)，在炎癥及纖維化發(fā)生過程中，肝臟內(nèi)發(fā)生大量M-MDSC聚集，而腎臟內(nèi)的優(yōu)勢亞型則是G-MDSC。筆者觀察2個亞群在UC小鼠的表達情況，結(jié)果顯示隨著炎癥的進展，淋巴結(jié)中G-MDSC減少，而M-MDSC無變化，提示在UC發(fā)病過程中，G-MDSC可能發(fā)揮著更重要的作用。

Treg細胞是機體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的主要效應細胞，可通過細胞間直接接觸及分泌抑制性細胞因子等調(diào)控免疫反應，維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。Treg細胞在控制腸道炎癥中發(fā)揮著重要作用，動物實驗和臨床研究均已證實Treg細胞數(shù)量或功能異常與UC發(fā)病密切相關，外源性輸注Treg細胞能通過抑制免疫應答而控制UC病情進展[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，UC小鼠淋巴結(jié)中Treg細胞的比例增高，與以前文獻報道相一致[12]。目前Treg細胞增高的原因尚不清楚，可能與機體免疫平衡調(diào)節(jié)有關，當UC發(fā)生時，活性CD4+T細胞亞群（如Th1、Th17等）細胞升高，為了維持機體免疫平衡，Treg細胞也反應性升高，但這些細胞數(shù)量的增加不足以抑制Th1、Th17等細胞引起的促炎反應；另外，增高的Treg細胞可能存在功能缺陷，因此在UC進展過程中，雖然Treg細胞數(shù)量增多，但黏膜局部仍出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)。作為機體內(nèi)2種重要的抑制性細胞，MDSC與Treg細胞間存在著密切聯(lián)系，MDSC可通過產(chǎn)生TGF-β、IL-10或精氨酸酶誘導Treg細胞，同時MDSC還具有將耐受原攝取并提呈給Treg細胞，促進Treg擴增的能力[13-14]；反之，Treg細胞能夠通過產(chǎn)生TGF-β調(diào)控MDSC的分化和功能[15]，提示MDSC和Treg細胞變化可能具有相關性。然而本研究結(jié)果顯示，在急性UC發(fā)生過程中MDSC比例逐漸降低，而Treg比例增高，兩者變化趨勢并不一致，由此可見，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠Treg細胞增加并非MDSC誘導所致，其具體機制有必要進一步研究和證實。

綜上所述，在UC發(fā)病過程中，淋巴結(jié)MDSC比例下降，而Treg細胞比例升高，提示兩者均與UC發(fā)生、發(fā)展密切相關，如能調(diào)控MDSC和Treg細胞的分化和功能，則可能影響UC的疾病進展。本結(jié)果為進一步揭示UC的免疫發(fā)病機制提供實驗依據(jù)，為臨床治療UC提供了新的靶點。

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（王榮兵 編輯）

Role of myeloid-derived suppressor cells and regulatory T cells in mouse models of ulcerative colitis*

Ying Lv1,Jian-hua Lu2,Zhuo Lv3,Yuan-yuan Duan3,Zhi-quan Liu2,Mei-lan Cui1,Hui-min Yan1
(1.Clinical Research Center,2.Department of Laboratory Medicine,Shijiazhuang Fifth Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050021,China;3.Hebei Medical University Graduate School,Shijiazhuang,Hebei 050017,China)

ObjectiveTo investigate the role of myeloid-derived suppressor cells(MDSC)and regulatory T(Treg)cells in development of ulcerative colitis.MethodsMouse models of ulcerative colitis were established with administration of 5%dextran sodium sulfate(DSS).Body weight and hematochezia were obtained daily.Mice were sacrificed 3 or 7 days post insult.Histological assessment of ulcerative colitis was graded with hematoxylin-eosin staining.The percentages of MDSC and Treg cells in the spleen and mesenteric lymph nodes were measured by flow cytometry.ResultsIn animals treated with DSS,body weight loss,diarrhea and hematochezia were observed on the 4th day.Histological analysis revealed colonic mucosa damage and manifestation of inflammation.The amount of Treg cells was increased,whereas the amount of MDSC was decreased significantly in mesenteric lymph nodes in 7-day model group(P＜0.05).Further observation on the subsets of MDSC suggested that the percentage of granulocyte-like MDSC decreased in the 7-day model group (P＜0.05)while no significant change of monocyte-like MDSC was observed among all the groups.There was no significant difference in the amount of Treg cells or MDSC in spleen among three groups.ConclusionAcute ulcerative colitis experiences decreased MDSC and increased Treg cells,which could contribute to the development of ulcerative colitis.

ulcerative colitis;myeloid-derived suppressor cell;regulatory T cell

R392.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.004

1005-8982（2017）27-0017-05

2017-04-30

河北省自然科學基金（No：H2015106081）；河北省醫(yī)學科學研究課題計劃項目（No：20150893）

閆會敏，E-mail：yanhm2538@163.com；Tel：0311-89109031