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    右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響*

    2017-11-28 02:20:31秦夢婷邱忠鵬王業(yè)忠
    關(guān)鍵詞:背角神經(jīng)病咪定

    秦夢婷,邱忠鵬,王業(yè)忠

    (石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)一科,2.骨二科,新疆 石河子 832008)

    右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響*

    秦夢婷1,邱忠鵬2,王業(yè)忠1

    (石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)一科,2.骨二科,新疆 石河子 832008)

    目的探討右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響。方法90只健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=30)、神經(jīng)病理性痛組(n=30)和右美托咪定組(n=30),利用坐骨神經(jīng)結(jié)扎的方法復(fù)制神經(jīng)病理性痛模型,右美托咪定組大鼠于術(shù)后即刻開始至處死前1天,每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定,1次/d,其他兩組大鼠給予等容量生理鹽水腹腔注射。分別于術(shù)前1 d(T0)、術(shù)后3 d(T1)、術(shù)后 7 d(T2)和術(shù)后 14 d(T3)對造模大鼠熱痛閾(TWL)和機械痛閾(MWT)進行測定,分別于 T1、T2和 T3時測定完TWL和MWT后,處死并取脊髓組織,利用實時熒光定量PCR檢測大鼠脊髓背角中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表達。結(jié)果與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時TWL均縮短,MWT均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與神經(jīng)病理性痛組比較,右美托咪定組大鼠T1~T3時TWL均延長,而MWT均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與神經(jīng)病理性痛組相比,右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論右美托咪定可有效抑制神經(jīng)病理性痛大鼠中樞痛覺敏化,其機制可能與下調(diào)脊髓背角COX-2和c-fos表達有關(guān)。

    右美托咪定;神經(jīng)病理性痛;大鼠;環(huán)氧化酶-2;c-fos

    右美托咪定是一種美托咪定的右旋異構(gòu)體,可高選擇性激動α2腎上腺素能受體,在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗交感神經(jīng)活性等方面發(fā)揮重要作用[1],有研究指出[2],右美托咪定可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛。但具體作用機制尚未完全研究清楚。有研究指出[3],外周神經(jīng)發(fā)生損傷后,環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)在脊髓背角中的表達上調(diào),通過一系列細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)而使脊髓神經(jīng)元敏化,引發(fā)并維持神經(jīng)病理性疼痛。c-fos基因在細(xì)胞分化、繁殖、生長及信息傳遞等過程中發(fā)揮重要作用[4],其在正常生理狀態(tài)下在神經(jīng)元細(xì)胞中呈極低表達水平,但當(dāng)外界出現(xiàn)機械或物理性刺激時,會導(dǎo)致脊髓中c-fos大量表達,從而導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元可塑性變化,可能是引起中樞敏化的原因之一[5]。本研究擬探討右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響,分析其鎮(zhèn)痛的可能機制,以期為臨床實踐提供理論基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組

    90只健康成年雄性Wistar大鼠,由河南省實驗動物中心提供,體重185~220 g,7周齡,飼養(yǎng)于24℃室溫條件下,相對濕度50%~60%,自由攝食和飲水。利用隨機數(shù)字表隨機分為假手術(shù)組(n=30)、神經(jīng)病理性痛組(n=30)和右美托咪定組(n=30)。

    1.2 模型復(fù)制及處理

    按照文獻[6]的步驟復(fù)制大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型:利用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后,將右后肢股骨中段皮膚切開,對肌肉進行分離,使坐骨神經(jīng)暴露,利用4-0絲線在坐骨神經(jīng)干上松扎4道,每道間隔1 mm左右,保證神經(jīng)外膜稍微受壓但又不讓血管完全阻斷,結(jié)扎過程可見大鼠肢體輕微發(fā)生抽動。操作完畢,用2 mg青霉素對切口進行外敷以防感染。假手術(shù)組大鼠僅對坐骨神經(jīng)進行分離但不行結(jié)扎,右美托咪定組大鼠于術(shù)后即刻開始至處死前1天,每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20090248,生產(chǎn)單位:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司),1次/d,其他兩組大鼠給予等容量生理鹽水腹腔注射。

    分別于術(shù)前 1 d(T0)、術(shù)后 3 d(T1)、術(shù)后 7 d(T2)和術(shù)后14 d(T3)對造模大鼠熱痛閾(thermal pain threshold,TWL) 和 機 械 痛 閾 (mechanicalpain threshold,MWT)進行測定。利用XR1102熱刺痛儀(購自上海欣軟信息科技有限公司)對熱痛閾進行測定,大鼠置于厚度為3 mm的玻璃板上,利用熱輻光源對右后肢足底部進行照射,對從開始照射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時間進行記錄,單次照射時間在20 s以內(nèi),連續(xù)進行3次,每次間隔5 min,求均值。利用von Frey纖維絲(購自美國Stoelting公司)對機械痛閾進行測定,將大鼠置于透明玻璃箱內(nèi),分別選取壓力 為 (0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和16.73 g)的von Frey纖維絲,利用初始刺激壓力為2.05 g的纖維絲垂直緩慢地對大鼠右后肢足底部進行刺激,每次間隔>30 s,以大鼠出現(xiàn)躲避、抬足或舔足反應(yīng)為陽性,以纖維絲發(fā)生90°彎曲而無反應(yīng)為陰性,采取序貫法[7]對MWT進行計算,并分別在閾值上下刺激5次,求均值。

    1.3 實時熒光定量PCR檢測

    分別于T1、T2和T3時隨機從各組選取10只大鼠,測定完TWL和MWT后,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,斷頭處死??焖偃〕鯨4~L6節(jié)段脊髓組織,放入已冷凍的凍存管內(nèi),再保存于液氮中以備檢。利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法對大鼠脊髓中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表達水平進行檢測,COX-2、c-fos及內(nèi)參引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計及合成。COX-2引物:正向 5'-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3',反向5'-ACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3';c-fos引物:正向5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3',反向5'-G TTGGCACTAGAGACGGACAGA-3'。取脊髓背角組織放入研缽內(nèi)進行迅速研磨,利用Trizol總RNA提取試劑盒(購自美國C&M biolabs公司)對組織中總RNA進行提取,并測定RNA純度,取A260/A280在1.8~2.0的標(biāo)本作為合格標(biāo)本。分別取2 μl總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。利用美國ABI 7500型qRT-PCR儀(購自美國ABI公司)進行PCR擴增,擴增條件:95℃預(yù)變性 30 s,94℃ 10 s,74℃ 15 s,60℃ 15 s,連續(xù)進行35個循環(huán)。利用2-△△Ct法對COX-2 mRNA和c-fos mRNA在脊髓背角組織中的表達水平進行分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間和組內(nèi)比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3組大鼠建模后情況

    3組大鼠建模后均未見切口感染。假手術(shù)組大鼠未見明顯異常,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠右后肢足趾出現(xiàn)并攏,輕度外翻狀,常表現(xiàn)懸空、抬足等異常行為。右美托咪定組大鼠在給藥后有輕度嗜睡現(xiàn)象,但容易被喚醒,醒后仍然可站立。

    2.2 3組大鼠TWL和MWT情況

    T0時,3組大鼠TWL和MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時TWL均縮短,MWT均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與神經(jīng)病理性痛組比較,右美托咪定組大鼠T1~T3時TWL均延長,而MWT均升高;與T0時比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T1~T3時TWL均縮短,MWT均降低,與T1時比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T2~T3時TWL均縮短,MWT均降低,與T2時比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T3時TWL均延長,MWT則升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.3 3組大鼠不同時點脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量

    與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與神經(jīng)病理性痛組比較,右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與T1時比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T2~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與T2時比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T3時COX-2 mRNA相對表達和c-fos mRNA相對表達量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表1 3組大鼠不同時間TWL和MWT比較 (±s)

    表1 3組大鼠不同時間TWL和MWT比較 (±s)

    注:1)與假手術(shù)組比較,P <0.05;2)與神經(jīng)病理性痛組比較,P <0.05;3)與同組內(nèi) T0時比較,P <0.05;4)與同組內(nèi) T1時比較,P <0.05;5)與同組內(nèi)T2時比較,P<0.05

    指標(biāo)組別T0(n=30)T1(n=30)T2(n=20)T3(n=10)TWL/s 假手術(shù)組(n=10) 16.7±1.1 15.7±1.0 15.3±0.9 16.2±1.2神經(jīng)病理性痛組(n=10) 16.5±0.9 11.2±0.61)3) 9.1±0.51)3)4) 9.6±0.61)3)4)5)右美托咪定組(n=10) 16.0±1.1 12.3±0.51)2)3) 9.9±0.71)2)3)4) 11.2±0.41)2)3)4)5)F值 1.140 386.187 786.553 243.898 P值 0.324 0.000 0.000 0.000 MWT/g 假手術(shù)組(n=10) 19.5±1.2 20.3±1.5 19.9±1.3 21.1±1.7神經(jīng)病理性痛組(n=10) 20.2±1.3 9.4±0.61)3) 7.2±0.41)3)4) 8.6±0.31)3)4)5)右美托咪定組(n=10) 19.9±1.4 12.6±0.81)2)3) 8.9±0.61)2)3)4) 10.1±0.51)2)3)4)5)F值 0.979 1 063.892 1 752.670 453.681 P值 0.380 0.000 0.000 0.000

    表2 3組大鼠不同時間脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量 (±s)

    表2 3組大鼠不同時間脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量 (±s)

    指標(biāo) 組別 T1 T2 T3 COX-2 mRNA 假手術(shù)組(n=10) 1.05±0.04 1.09±0.06 1.07±0.10神經(jīng)病理性痛組(n=10) 3.61±0.141) 7.43±0.251)4) 5.38±0.201)4)右美托咪定組(n=10) 2.08±0.071)2) 5.52±0.131)2)4) 2.94±0.161)2)4)F值 2033.126 5256.238 1857.225 P值 0.000 0.000 0.000

    續(xù)表2

    3 討論

    神經(jīng)病理性痛作為常見的慢性疼痛,患者常出現(xiàn)異常疼痛、痛覺過敏或感覺異常等癥狀,給患者生存質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[8],本研究復(fù)制神經(jīng)病理性痛大鼠模型,結(jié)果顯示,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠右后肢足趾出現(xiàn)并攏,輕度外翻狀,常表現(xiàn)懸空、抬足等異常行為,且與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時TWL均縮短,MWT均降低,說明制備的神經(jīng)病理性痛大鼠模型復(fù)制成功。

    本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高,說明神經(jīng)病理性痛發(fā)生與脊髓背角中COX-2和c-fos表達上調(diào)有關(guān),且隨時間表達變化情況與痛閾變化相一致,提示COX-2和c-fos參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生及進展過程,分析原因,當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時,會特異性激活胞內(nèi)型磷脂酶A2活性,激發(fā)脊髓磷脂酶-環(huán)氧化酶-前列腺素級聯(lián)通路級聯(lián)放大反應(yīng)[9],使COX-2表達升高、前列腺素物質(zhì)釋放增多,從而使谷氨酸等末梢神經(jīng)興奮物質(zhì)釋放增加[10],進而激活脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加[11],而神經(jīng)元內(nèi)增高的Ca2+又可促使cAMP生成,導(dǎo)致AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化而被激活,進一步與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合而促使c-fos基因大量表達,產(chǎn)生的c-fos蛋白則可與c-jun蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,通過激活目的基因而促使炎癥因子合成及釋放,從而引起痛覺過敏[12]。

    本研究結(jié)果顯示,在給予大鼠腹腔注射右美托咪定后,模型大鼠痛閾增高,神經(jīng)病理性痛緩解,與神經(jīng)病理性痛組比較,右美托咪定組大鼠T1~T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低,提示右美托咪定可通過抑制脊髓背角組織中COX-2和c-fos的表達,而達到抑制神經(jīng)病理性痛。分析原因,右美托咪定通過抑制COX-2表達及活性,減少前列腺素的產(chǎn)生,引起谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流減少,使突觸前膜自發(fā)性釋放谷氨酸降低[13],同時,前列腺素水平的降低亦可使突觸前膜電壓依賴性Ca2+內(nèi)流減少,加之右美托咪定本身可通過特異性激活α2腎上腺素能受體,對脊髓背角神經(jīng)元Ca2+通道進行抑制[14],從而降低胞內(nèi)Ca2+水平,從而使cAMP合成減少,c-fos基因表達被抑制,炎癥因子合成減少,從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。

    綜上所述,右美托咪定可有效抑制神經(jīng)病理性痛大鼠中樞痛覺敏化,其機制可能與下調(diào)COX-2和c-fos表達有關(guān)。

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    (王榮兵 編輯)

    Effect of Dexmedetomidine on spinal expression of COX-2 and c-fos in rat models of neuropathic pain*

    Meng-ting Qin1,Zhong-peng Qiu2,Ye-zhong Wang1
    (1.Department of Critical Medicine,2.Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xingjiang 832008,China)

    ObjectiveTo investigate the effects of Dexmedetomidine on spinal expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2)and c-fos in spinal dorsal horns of rat models of neuropathic pain.MethodsA total of 90 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into sham group (n=30),neuropathic pain group(n=30)and Dexmedetomidine group(n=30).Rat models of neuropathic pain were established by sciatic nerve ligation.Sham operated rats

    all procedure except for sciatic nerve ligation.Dexmedetomidine was intraperitoneally injected(50 μg/kg)daily in the Dexmedetomidine group.Vehicle saline were administered into the remaining animals.Thermal pain threshold (TWL)and mechanical pain threshold (MWT)were measured 1 day before operation(T0),and the 3th d(T1),7th d(T2)and 14th d(T3)after surgery,then spine were harvested immediately.COX-2 and c-fos in spinal cord dorsal horns were determined by real-time quantitative PCR.ResultsCompared with the sham group,TWL and MWT in the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group decreased significantly at T1~T3(P< 0.05);TWL and MWT in the Dexmedetomidine group increased.at T1~T3(P< 0.05)compared with the neuropathic pain group.Expression levels of COX-2 mRNA and c-fos mRNA in the neuropathic pain group and the Dexmedetomidine group were increased at T1~T3dramatically (P< 0.05),but was alleviated by treatment of Dexmedetomidine compared between the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group (P<0.05).Conclusion Dexmedetomidine inhibits central neuropathic hyperalgesia in rat models of neuropathic pain,which may be related to down-regulation of COX-2 and c-fos.

    Dexmedetomidine;neuropathic pain;cyclooxygenase-2;c-fos

    R791.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.003

    1005-8982(2017)27-0012-05

    2017-05-30

    國家自然科學(xué)基金(No:81360185)

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