草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷對(duì)二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌大鼠細(xì)胞凋亡的影響*

崔香丹 ，鄭峰 ，朱潔波 ，全吉淑 ，尹學(xué)哲

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷對(duì)二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌大鼠細(xì)胞凋亡的影響*

崔香丹1，鄭峰1，朱潔波1，全吉淑2，尹學(xué)哲1

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

目的觀察二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)大鼠肝癌的病理變化，探討草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷（IGBR）對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)p53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法132只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及IGBR組。除對(duì)照組，各組大鼠給予DEN 0.2 g/kg腹腔注射1次，而后0.05%的DEN水溶液用于自由飲水；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU）0.025 g/kg每周3次；IGBR組每日IGBR 0.5 g/kg灌胃1次。實(shí)驗(yàn)第12、20及28周末，分批處死動(dòng)物，觀察肝臟病理變化及細(xì)胞凋亡，免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)p53、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝細(xì)胞核大且深染，肝細(xì)胞變性、異型增生，有些增生灶可見癌變細(xì)胞。凋亡的肝細(xì)胞皺縮、核固縮及核仁消失。IGBR組與陽(yáng)性對(duì)照組凋亡指數(shù)高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果，p53和Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于不典型增生灶和癌灶的胞漿中。與模型對(duì)照組比較，IGBR組和陽(yáng)性對(duì)照組p53表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，而Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IGBR組和陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論大鼠肝癌發(fā)生與細(xì)胞凋亡相關(guān)，IGBR通過(guò)調(diào)控p53、Bcl-2來(lái)抑制DEN誘發(fā)大鼠肝癌。

肝癌；草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷；凋亡；p53；Bcl-2

如今，原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生呈迅猛的增加趨勢(shì)[1]，世界衛(wèi)生組織揭曉的《全球癌癥報(bào)告》表明，肝癌的新發(fā)和死亡人數(shù)中國(guó)居世界第一[2]。惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡和增殖緊密相關(guān)[3]。細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控引起的細(xì)胞環(huán)境和死亡信號(hào)變化引起的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程。腫瘤細(xì)胞與實(shí)體腫瘤中都存在細(xì)胞凋亡，且凋亡程度的好壞直接與腫瘤的發(fā)展程度相關(guān)。

草蓯蓉為中國(guó)傳統(tǒng)的民族藥，民族藥名為不老草，為我國(guó)2類保護(hù)植物，是大興安嶺高山地區(qū)、長(zhǎng)白山特有植物，可全草入藥。傳統(tǒng)醫(yī)藥典籍記載其有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便、滋補(bǔ)強(qiáng)身、延緩衰老之功效[4]。草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷（iridoid glucosidesfrom bosch niakia rossica，IGBR）是草蓯蓉提取物，具有抗癌、清除自由基及誘導(dǎo)凋亡等作用[5]。目前對(duì)IGBR抗癌機(jī)制方面的研究受到廣泛的關(guān)注。通過(guò)觀察二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）引發(fā)大鼠肝癌中IGBR對(duì)細(xì)胞凋亡的作用，闡明其抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar大鼠和 IGBR（延邊大學(xué)提供），DEN（購(gòu)自Sigma公司），p53、Bcl-2蛋白多克隆抗體、TUNEL和免疫組化試劑盒（購(gòu)自北京中杉金橋），β-actin（Cell Signaling Technology公司提供），γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl-transferase，γ-GT）試劑盒（購(gòu)自凱基生物科技有限公司）。

1.2 模型的復(fù)制與分組

Wistar雄性大鼠132只，分為4組，對(duì)照組大鼠給予生理鹽水0.1 ml/100 g體重腹腔注射1次；模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、IGBR組大鼠第1天給予DEN 0.2 g/kg腹腔注射1次，然后0.05%的DEN水溶液用于自由飲水；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU）0.025 g/kg每周3次；IGBR組大鼠每日灌胃IGBR 0.5 g/kg。實(shí)驗(yàn)第12、20周末各組處死6只、28周末各組處死20只，取心臟血，肝臟甲醛固定，石蠟包埋。

1.3 檢測(cè)方法

按γ-GT試劑盒的操作步驟測(cè)定血清中γ-GT，HE染色觀察肝臟病理變化，TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡，凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）=×100%免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)p53和Bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGBR對(duì)DEN誘發(fā)肝癌大鼠血清γ-GT含量的影響

大鼠誘癌過(guò)程中28周末，4組間γ-GT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1111.237，P=0.000）；與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組γ-GT增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與IGBR組γ-GT下降，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 肝臟組織HE染色

肝小葉和肝索排列正常，可見中央靜脈，細(xì)胞核清晰。模型對(duì)照組肝臟病理改變主要表現(xiàn)為肝臟炎癥反應(yīng)、肝硬化和肝癌。根據(jù)不同的病理變化將模型對(duì)照組病理變化分為3個(gè)階段：①肝炎階段（12周）：可見炎癥反應(yīng)、壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原沉積及凋亡小體；②肝硬化階段（20周）：可見結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞再生，不同大小的肝結(jié)節(jié)，肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞、肝索排列紊亂；③肝癌階段（28周）：可見肝細(xì)胞核深染，肝細(xì)胞變性、增生，部分可見癌細(xì)胞增生。IGBR組及陽(yáng)性對(duì)照組肝小葉破壞及肝索排列紊亂程度、細(xì)胞變性及異性增生度較模型對(duì)照組各階段均減輕，IGBR組和陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠γ-GT、AI值的比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠γ-GT、AI值的比較 （n=6，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別γ-GT/（U/L）AI/%對(duì)照組 38±3 1.5±0.6模型對(duì)照組 97±131） 12.3±0.41）陽(yáng)性對(duì)照組 91±52） 22.3±0.22）IGBR 組 97±52） 22.2±0.12）

2.3 肝細(xì)胞凋亡染色

對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞凋亡稀少，著色淺；模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡率增加，胞質(zhì)呈棕黃色，凋亡的肝細(xì)胞故縮、核濃縮、核仁消失。4組的AI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42 542.984，P=0.000）；IGBR 組與陽(yáng)性對(duì)照組AI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但高于模型對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表2 各組大鼠肝癌階段肝組織中p53表達(dá)率的比較（n=20）

2.4 p53和Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

p53和Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于癌灶的胞漿中（見表2、3和圖 1、2）。3組p53表達(dá)率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.971，P=0.046）；3組 Bcl-2表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.159，P=0.000）。較模型對(duì)照組比較，IGBR和陽(yáng)性對(duì)照組p53表達(dá)增強(qiáng)，而Bcl-2表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 p53和Bcl-2表達(dá)水平比較

4組p53的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2201.596，P=0.000），但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組Bcl-2的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 838.713，P=0.000）。與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組p53和Bcl-2表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，IGBR組和陽(yáng)性對(duì)照組p53表達(dá)水平升高，而Bcl-2表達(dá)水平降低（P＜0.05），兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

表3 各組大鼠肝癌階段肝組織中Bcl-2表達(dá)率的比較（n=20）

圖1 肝組織p53免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果 （×100）

圖2 肝組織Bcl-2免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果 （×100）

圖3 肝組織p53、Bcl-2 Western blot觀察結(jié)果

3 討論

肝癌的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，有大量的研究表明，抗凋亡因子在腫瘤細(xì)胞株和實(shí)體腫瘤中表達(dá)增加。DEN誘發(fā)的大鼠肝癌多為肝細(xì)胞肝癌，造模簡(jiǎn)單易成功。張志敏等[7]觀察到，DEN誘癌過(guò)程與人類肝細(xì)胞癌進(jìn)程相似。本實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中28周（肝癌階段）時(shí)血清γ-GT增高，且HE染色肝細(xì)胞核大、深染、變性、異型增生，部分可見癌變細(xì)胞，說(shuō)明DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型制作成功。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程控性死亡，調(diào)控機(jī)體發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[6-7]。p53與Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與增殖，且在凋亡進(jìn)程中相互影響[8]。

p53是抑癌基因，半數(shù)以上的人類癌癥有p53的缺失和突變。突變型p53促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致基因異常表達(dá)，使細(xì)胞癌變[9-11]。各種應(yīng)激使p53被不同的信號(hào)通路激活，引發(fā)下游的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。研究表明，p53基因失活與肝癌的形成與預(yù)后相關(guān)[13]。在慢性肝損傷中，肝細(xì)胞發(fā)生依賴p53的衰老程序，肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)大大增加；另外，缺失p53表達(dá)的上皮細(xì)胞更易轉(zhuǎn)化為肝癌[14]。

Bcl-2是原癌基因，通過(guò)調(diào)控凋亡信號(hào)而抑制細(xì)胞凋亡，還與細(xì)胞異常增殖有關(guān)，與肝癌的發(fā)生緊密相關(guān)[15]。Bcl-2高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)其過(guò)多釋放及無(wú)限制地轉(zhuǎn)錄，使量變誘發(fā)質(zhì)變而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[16]。另外，Bcl-2與癌基因C-myc[17]和抗癌基因p53[18]互相作用，間接控制細(xì)胞程序性死亡。

本研究結(jié)果顯示，DEN誘發(fā)的大鼠肝組織中p53和Bcl-2均表達(dá)增強(qiáng)，免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)結(jié)果示IGBR與5-FU干預(yù)后，p53表達(dá)增強(qiáng)，而Bcl-2表達(dá)下降。IGBR和5-FU是通過(guò)介導(dǎo)抑癌基因和癌基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡。已有研究證明5-FU為傳統(tǒng)抗癌藥，本研究結(jié)果IGBR與5-FU作用無(wú)差異，進(jìn)一步證實(shí)IGBR的抗癌作用。

本研究中，通過(guò)IGBR對(duì)大鼠肝癌的影響，進(jìn)一步闡明IGBR抗肝癌機(jī)制，對(duì)中醫(yī)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行深入研究，并為中醫(yī)抗腫瘤提供科學(xué)依據(jù)。

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（王榮兵 編輯）

Effect of Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica on rat models of diethylnitrosamine-induced hepatocarcinomat*

Xiang-dan Cui1,Feng Zheng1,Jie-bo Zhu1,Ji-shu Quan2,Xue-zhe Yin1
(1.Yanbian University Hospital,Yanji,Jilin 133000,China;2.Yanbian University Medical School,Yanji,Jilin 133000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica (IGBR) on apoptosis and the expression of p53 and Bcl -2 proteins.MethodsA total of 132 Wistar male rats wererandomly divided into control group, model group, positive control group and IGBR group. DEN was administered once by intraperitoneal injection (0.2 g/kg), then through drinking water (0.05%) for the rest of experimental duration in each group except for the control group. Animals from the positive control group was injected with 5-FU 3 times per week (0.025 g/kg). Rats in the IGBR group were treated intragastrically with IGBR daily (0.5 g/kg). Animals were sacrificed on 12, 20 or 28 weeks post insults. Pathological alterations and apoptosis of liver cells were observed and expression of p53 as well as Bcl -2 were determined by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the control group, the enlarged and deeply stained nuclei, hepatocellular degeneration, dysplasia and cancer cell were observed in the liver tissue of the model group. Apoptotic hepatocyte showed cytoplasmic and nuclear shrinkage without nucleolus. Immunohistochemistry results showed that p53 and Bcl -2 positive signals were mainly distributed in the cytoplasm of atypical hyperplasia and carcinoma.Expression of p53 increased while Bcl-2 decreased in the IGBR group as well as the positive control group significantly compared with the model group(P＜0.05).No obvious differences were observed between the IGBR group and the positive control group (P＞0.05).ConclusionsHepatocarcinoma is closely associated with apoptosis,and IGBR inhibits DEN-induced hepatocarcinoma through mediating p53 and Bcl-2 pathway.

hepatocarcinoma; Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica (IGBR); apoptosis; p53; Bcl-2

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.002

1005-8982（2017）27-0007-05

2017-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81360651）

尹學(xué)哲，E-mail：yinxz@ybu.edu.cn；Tel：0433-2660004，15526770004