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    五味子乙素抗腎纖維化作用及機(jī)制研究*

    2017-11-28 02:20:30鄭海洲張杰肖程程秦聰徐濤
    關(guān)鍵詞:乙素五味子腎小管

    鄭海洲,張杰,肖程程,秦聰,徐濤

    (武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 武漢 430060)

    五味子乙素抗腎纖維化作用及機(jī)制研究*

    鄭海洲,張杰,肖程程,秦聰,徐濤

    (武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 武漢 430060)

    目的探討五味子乙素對(duì)腎纖維化的改善作用及其機(jī)制。方法以分別不同劑量的五味子乙素給缺血再灌注(I/R)模型小鼠灌胃。通過(guò)Masson染色對(duì)各組小鼠腎纖維化進(jìn)行評(píng)價(jià),免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠腎組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)的表達(dá);Western blot法檢測(cè)各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ、上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和p-Smad3的表達(dá)水平。結(jié)果Masson染色結(jié)果顯示,五味子乙素治療組較I/R組小鼠腎間質(zhì)纖維化及小管萎縮減輕;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,治療組較I/R組α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)減少;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,治療組較I/R組E-cadherin表達(dá)增高,α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和p-Smad3表達(dá)均下降,且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。結(jié)論五味子乙素具有抗腎纖維化的作用,其機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān),提示五味子乙素有望成為抗腎纖維化的臨床治療藥物。

    腎纖維化;五味子乙素;缺血再灌注;治療

    慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)全球患病率為8%~16%,已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。研究表明,超過(guò)60%的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)患者會(huì)逐漸發(fā)展為 CKD,CKD 患者更易發(fā)生AKI,AKI也會(huì)加速CKD進(jìn)程[2-3]。腎間質(zhì)纖維化是各種CKD發(fā)展為終末期腎衰竭的共同途徑[4]。因此,治療腎間質(zhì)纖維化是預(yù)防與治療慢性腎臟疾病的關(guān)鍵。

    腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制,EMT是指腎小管上皮細(xì)胞的表型發(fā)生改變,喪失上皮細(xì)胞表型,獲得間質(zhì)細(xì)胞特征[5]。大量研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是最主要的促纖維化因子,五味子乙素能通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)通路發(fā)揮抗血管纖維化作用[6],五味子乙素還可減輕四氯化碳引起的肝細(xì)胞損傷,對(duì)缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷也有一定的保護(hù)作用[7]。五味子乙素對(duì)腎纖維化是否具有保護(hù)作用,目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠體內(nèi)研究,探索五味子乙素對(duì)腎臟纖維化的作用及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

    20只健康雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物號(hào):S0271605051A),體重20~25 g。五味子乙素(購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度>98%),兔抗小鼠GAPDH、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)、上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)和 p-Smad3 抗體(購(gòu)自美國(guó) Abcam公司),Masson染色試劑盒、DAB試劑盒、橄欖油、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、Marker和BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自湖北省武漢谷歌公司),微量移液器(購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司),離心機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Thermo公司),超級(jí)純水儀(購(gòu)于美國(guó)Millipore公司),顯微鏡(購(gòu)自日本Olympus公司),Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司)。

    1.2 分組及復(fù)制I/R模型

    20只小鼠隨機(jī)分成4組:①假手術(shù)組(Sham);②腎缺血再灌注模型組(I/R);③低劑量治療組(五味子乙素10 mg/kg灌胃);④高劑量治療組(五味子乙素20 mg/kg灌胃);每組5只。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉,常規(guī)消毒,于左側(cè)肋緣下切開(kāi)約1~1.5 cm,暴露左腎后仔細(xì)剔除腎蒂周?chē)窘M織以暴露血管,用微血管鉗夾閉血管25 min,以相同操作夾閉右側(cè)血管25min(右側(cè)切口比左側(cè)低約0.5 cm),血管夾閉1~2 min后可觀察到腎外觀逐漸由紅色變?yōu)樯钭仙G锌谥饘涌p合,75%酒精消毒后將小鼠置于恒溫孵化器中。Sham組僅剝離脂肪組織,不夾閉血管。治療組手術(shù)當(dāng)天即開(kāi)始給予藥物灌胃,持續(xù)15 d;Sham組及I/R組給予等量的橄欖油(10 ml/kg)灌胃 15 d。

    1.3 取材

    在I/R模型小鼠術(shù)后10周,戊巴比妥鈉腹腔麻醉后取小鼠左腎,頸椎脫臼處死小鼠。部分腎組織加4%的多聚甲醛固定以作病理分析,另一部分置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 觀察各組腎組織纖維化程度

    將4%多聚甲醛固定的腎組織石蠟包埋,切成4μm切片行Masson染色,顯微鏡下觀察,高倍視野下(×400),Masson染色膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色,藍(lán)染的間質(zhì)膠原纖維越多,表示腎纖維化越嚴(yán)重。Image-ProPlus 6.0分析藍(lán)染區(qū)域所占面積比,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用陽(yáng)性面積百分率(Per Area Obj/Total)表示。

    1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)

    組織切片,依次脫蠟、水化及抗原修復(fù)后,3%過(guò)氧化氫室溫孵育15 min,正常山羊血清封閉30 min,分別滴加 α-SMA(1∶100),Collagen Ⅰ(1∶150),4℃孵育過(guò)夜,PBS漂洗3次,每次5 min。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫下孵育10 min,PBS搖床漂洗,DAB染色后用蒸餾水沖洗2次終止反應(yīng),細(xì)胞核復(fù)染,梯度脫水后用中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察,高倍視野(×400)腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕黃色條索、波紋狀染色為陽(yáng)性表達(dá)。Image-Pro Plus 6.0分析α-SMA和CollagenⅠ陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域所占面積,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用陽(yáng)性面積百分率(Per AreaObj/Total)表示。

    1.6 Western blot檢測(cè)各組腎組織α-SMA、CollagenⅠ、E-cadherin、TGF-β1和p-Smad3的表達(dá)

    將腎組織剪碎研磨,加蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,提取的蛋白置于100℃恒溫器變性10 min。每孔20 μg蛋白的上樣量經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜3次后放入相應(yīng)的一抗中,4℃孵育過(guò)夜。次日取出,TBST清洗3次后放入二抗中,避光常溫孵育1 h,利用Odysey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 五味子乙素減輕I/R小鼠模型腎損傷

    Masson染色結(jié)果顯示:Sham組腎小球,腎小管形態(tài)、大小均正常,腎間質(zhì)僅腎小球系膜及基底膜、腎小管基底膜及脈管區(qū)有藍(lán)色表達(dá)區(qū)域,未見(jiàn)纖維增生;I/R組術(shù)后10周,可見(jiàn)腎間質(zhì)萎縮和壞死,間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),藍(lán)染區(qū)域較Sham組增多,腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重;五味子乙素治療組與I/R組比較,腎損傷程度減輕,膠原藍(lán)染面積減少(見(jiàn)圖1A)。各組膠原纖維陽(yáng)性面積,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.584,P=0.000)。兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),I/R模型組較Sham組膠原纖維陽(yáng)性面積增多(P=0.000);治療組與I/R組比較,膠原纖維陽(yáng)性面積減少(均P=0.000)。見(jiàn)圖1B。

    2.2 五味子乙素調(diào)節(jié)I/R模型小鼠腎組織α-SMA和collagenⅠ的表達(dá)

    各組小鼠腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)水平比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=90.850和 148.818,均P=0.000)。Sham 組腎組織α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)較少,I/R組表達(dá)較Sham組增高(均P=0.000)。五味子乙素治療組α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)較I/R組均減少(均P=0.000),高劑量組治療效果比低劑量組好。見(jiàn)圖2。

    圖1 五味子乙素治療I/R模型小鼠的腎組織染色結(jié)果 (Masson染色×400)

    圖2 五味子乙素調(diào)節(jié)I/R模型小鼠腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá) (免疫組織化學(xué)法×400)

    2.3 各組小鼠腎組織 α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達(dá)

    術(shù)后10周,各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.201、85.092及166.843,均P=0.000)。與Sham組比較,I/R組α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)量增高(均P=0.000),與I/R組比較,治療組α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)量減少(均P=0.000),且高劑量治療組表達(dá)量減少。上皮特征蛋白E-cadherin I/R組表達(dá)量較Sham組減少(P=0.000),治療組表達(dá)量比I/R組增高(均P=0.000)。見(jiàn)圖3。

    圖3 各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達(dá)

    圖4 各組小鼠腎組織TGF-β1和p-Smad3的表達(dá)

    2.4 各組小鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)

    各組小鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=245.580和 175.083,均P=0.000)。Sham 組TGF-β1和p-Smad3無(wú)表達(dá),I/R模型組表達(dá)較多(均P=0.000),治療組較I/R組表達(dá)量減少(均P=0.000)。見(jiàn)圖 4。

    3 討論

    腎間質(zhì)纖維化是慢性終末期腎病的主要病理變化,也是各種慢性腎病的最終結(jié)果[1,4]。IRI病理變化是急性腎小管凋亡和壞死,是AKI的主要原因。腎臟發(fā)生缺血損傷后其功能可恢復(fù)正常,但成纖維細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積,導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化,最終進(jìn)展為CKD[8]。EMT是腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要因素,包括上皮標(biāo)志物的缺失如E-cadherin以及間質(zhì)指標(biāo)的增多,如α-SMA和CollagenⅠ等[9]。雖然輸尿管梗阻是建立小鼠腎纖維化模型的傳統(tǒng)方式,但臨床上由輸尿管梗阻導(dǎo)致的腎纖維化發(fā)生率較低[10],而缺血再灌注損傷與臨床聯(lián)系緊密,AKI與CKD的病理相關(guān)性最近也已明確澄清,AKI患者比有CKD病史的患者更容易發(fā)生終末期腎臟病[11]。小鼠腎缺血再灌注模型十分契合急性腎損傷發(fā)展為慢性腎損傷的過(guò)程[11-13]。

    TGF-β1調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、纖維化和炎癥,在正?;驌p傷組織重塑中起著至關(guān)重要的作用,TGF-β1的異常調(diào)節(jié)常導(dǎo)致病理纖維化的細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過(guò)度積累[14-15]。TGF-β1是最重要的促腎纖維化因子,研究表明TGF-β1在激活下游Smad信號(hào)調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化中起著重要作用,其機(jī)制可能是通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)[5]。本實(shí)驗(yàn)Western bolt結(jié)果顯示,發(fā)生纖維化組織中TGF-β1和p-Smad3蛋白的表達(dá)量會(huì)明升高。

    五味子乙素是中藥五味子的主要活性成分,具有多種生物活性,包括抗氧化、抗炎以及抗腫瘤作用,對(duì)心、腦、肝和腎等多種器官均具有保護(hù)作用[16]。五味子乙素通過(guò)靶向針對(duì)TGF-β1,對(duì)腫瘤、血管損傷和原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓等均具有治療作用[17-18]。LEE等[19]研究發(fā)現(xiàn),五味子乙素還可抑制炎癥和防止基質(zhì)金屬蛋白酶的降解,對(duì)大鼠大腦缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷也具有保護(hù)作用。本研究中,I/R組Masson染色可見(jiàn)藍(lán)染的膠原纖維增多,間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,腎小管明顯萎縮和壞死;免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)間質(zhì)指標(biāo)蛋白α-SMA和CollagenⅠ,I/R組表達(dá)較Sham組均升高,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)通過(guò)I/R成功構(gòu)造腎纖維化模型。用五味子乙素作為治療藥物逆轉(zhuǎn)腎纖維化,從免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果可以看出五味子乙素有治療作用,五味子乙素通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá),進(jìn)而抑制p-Smad3的表達(dá)。

    綜上所述,在小鼠腎缺血再灌注損傷模型中,五味子乙素具有抗腎纖維化作用,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路,抑制細(xì)胞外基質(zhì)堆積和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而減輕腎缺血再灌注損傷引起的腎小管間質(zhì)纖維化,并提示五味子乙素有望成為抗腎纖維化的臨床治療藥物,為腎纖維化的防治提供新的思路和途徑。

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    (王榮兵 編輯)

    Protective effect of Schisandrin B on renal fibrosis and underlying mechanism*

    Hai-zhou Zheng,Jie Zhang,Cheng-cheng Xiao,Cong Qin,Tao Xu
    (Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060,China)

    ObjectiveTo investigate the protective of Schisandrin(Sch B)on renal fibrosis and underlying mechanism.MethodsMice were subjected to ischemia-reperfusion (I/R)injury in presence or absence of Sch B.Masson staining was performed for morphological grading of renal fibrosis.α-SMA and Collagen I expression in kidney tissue were determined by Immunohistochemistry.The expression levels of α-SMA,collagenⅠ,E-cadherin,transforming growth factor β1(TGF-β1)and p-Smad3 were measured by Western blot.ResultsRenal fibrosis and tubular atrophy were significantly alleviated by Sch B treatment when compared with I/R group.Immunohistochemistry staining showed that α-SMA and Collagen I in the I/R group increased significantly,which was attenuated by Sch B.Western blot suggested that,in the Sch B group,the expression of E-cadherin was increased while α-SMA,Collagen I,TGF-β1and p-Smad3 decreased dramatically in a dose dependent manner in comparison with those in the I/R group.ConclusionsData confirms that SchB can ameliorate renal fibrosis by inhibiting TGF-β/Smad signaling pathway,which could be a potential therapeutic intervention for renal fibrosis.

    renal fibrosis;Schisandrin B;ischemia reperfusion

    R692

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.001

    1005-8982(2017)27-0001-06

    2017-06-01

    國(guó)家自然科學(xué)基金(No:81470923)

    張杰,E-mail:zhangjiewhu666@163.com

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