真蘚(Bryum argenteum)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

馬曉英, 韋 偉, 臧 程, 于 晶

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

真蘚(Bryumargenteum)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

馬曉英, 韋 偉, 臧 程, 于 晶*

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

為了確定真蘚最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系,采用PCR正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)影響ISSR-PCR試驗(yàn)的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、和TaqDNA聚合酶5個(gè)因素在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)100條引物逐一進(jìn)行溫度梯度PCR,篩選合適的引物并確定每個(gè)引物的最佳退火溫度.結(jié)果顯示優(yōu)化的20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中包括20 ng /20 μL DNA模板、0.45 μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg2+、0.4 U/20 μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/LdNTPs.利用該體系最終篩選出50條擴(kuò)增條帶清晰,重復(fù)性好,多態(tài)性高的引物并確定其退火溫度.這一體系的建立、引物的篩選及退火溫度的確立為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)苔蘚遺傳多樣性的研究提供理論基礎(chǔ).

真蘚; ISSR; 正交設(shè)計(jì); 引物篩選; 退火溫度

0 引 言

真蘚(BryumargenteumHedw.)為真蘚科真蘚屬植物,屬世界廣布種,中國各地均有分布,在薄土巖面,石縫,屋頂,以及陰溝邊緣等多種生境下均可生長(zhǎng)[1].具有清熱解毒,止血,治療鼻竇炎、細(xì)菌性痢疾、灼傷、心絞痛等功效[2-4].

目前,國內(nèi)外用于苔蘚植物遺傳關(guān)系的分子標(biāo)記技術(shù),主要有inter-simple sequence repeat(ISSR)和random amplified polymorphic DNA(RAPD)兩種.ISSR是一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記技術(shù),是1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等[5-6]基于微衛(wèi)星技術(shù)上創(chuàng)建起來的.該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單,成本低,有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)[7-10],但其結(jié)果易受反應(yīng)體系中各個(gè)因素的影響[11-13],因此要建立適合研究材料,條帶清晰,重復(fù)性好的反應(yīng)體系.不同種植物適用不同的ISSR引物,且相同引物應(yīng)用于不同種植物退火溫度也會(huì)有差異,ISSR引物退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大,且與其退火溫度(Tm)值沒有明顯的規(guī)律性[14],根據(jù)目前國內(nèi)已發(fā)表的相關(guān)報(bào)道可知,苔蘚植物相對(duì)于其他很多植物篩得的ISSR引物數(shù)目較少,且退火溫度多集中于48～55 ℃之間[15-20].

本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)反應(yīng)體系中的5種因素進(jìn)行優(yōu)化以得到最優(yōu)的ISSR-PCR反應(yīng)體系,并利用最佳PCR擴(kuò)增體系對(duì)哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物進(jìn)行篩選,對(duì)已篩得引物的退火溫度進(jìn)行總結(jié),旨在為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)苔蘚遺傳多樣性研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

所用的10×LA PCR Buffer II(Mg2+free)、MgCl2、dNTP Mixture、LA Taq聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司;所用的哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取真蘚基因組DNA.采用島津Uv1800微量分光光度計(jì)測(cè)定所提DNA的濃度和純度,OD260/OD280比值皆在1.9左右,說明DNA樣品純度較高,適合進(jìn)一步PCR擴(kuò)增反應(yīng).樣品DNA存于-20 ℃作為后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板.

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

表1 真蘚ISSR-PCR 反應(yīng)的因素和水平

用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,選擇引物UBC825,在20 μL的反應(yīng)體系中,參照汪琛穎等[20]的研究報(bào)道,對(duì)影響ISSR-PCR試驗(yàn)的模板DNA質(zhì)量濃度,引物、dNTPs、Mg2+的物質(zhì)的量濃度,和Taq DNA聚合酶生物量濃度5個(gè)因素在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化(表1),共16個(gè)處理(表2)每個(gè)處理包含2 μL10×LA PCR Buffer II(Mg2+free),用ddH2O補(bǔ)足.擴(kuò)增反應(yīng)程序94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,退火2 min,72 ℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min;4 ℃保存.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用含有溴化乙錠(EB)核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳分離,電壓100 V,60 min.并用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon 2500)進(jìn)行觀察和拍照.

表2 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)

表3 細(xì)調(diào)性真蘚ISSR-PCR反應(yīng)的因素和水平

為了最終獲得清晰,可重復(fù)性好,亮度適宜,條帶多態(tài)性豐富的擴(kuò)增條帶,在L16(45)正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,縮小各個(gè)因素的濃度梯度進(jìn)行細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn).對(duì)影響ISSR-PCR試驗(yàn)的引物、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶4個(gè)因素在3個(gè)水平上進(jìn)行篩選(表3),共9個(gè)處理(表4).

表4 L9(34)細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 引物及其最佳退火溫度篩選

試驗(yàn)所用的哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物,擴(kuò)增條帶穩(wěn)定性且多態(tài)性各有不同,所以為選取背景清晰,條帶穩(wěn)定性好且多態(tài)性豐富的引物,對(duì)100條引物進(jìn)行篩選.退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有十分關(guān)鍵的影響[21],在最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上,利用PCR儀自動(dòng)生成10個(gè)溫度梯度,對(duì)所有引物逐一進(jìn)行溫度梯度PCR,以確定每個(gè)引物的最佳退火溫度.

2 結(jié)果與分析

2.1L16(45)ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 L16(45)正交試驗(yàn)電泳結(jié)果

圖2 L9(34)細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)電泳結(jié)果

圖1為L(zhǎng)16(45)正交試驗(yàn)電泳結(jié)果.由圖1可知,16個(gè)處理的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果具有一定的差異性.其中6、8、11、12、15、16無擴(kuò)增條帶,1、2、5有微弱條帶,9、10、13背景較亮條帶模糊,7、14條帶清晰但條帶數(shù)較少,3、4條帶清晰豐富且4較3擴(kuò)增結(jié)果更好.說明最優(yōu)組合偏差不大,為得到最適擴(kuò)增體系,以此為基點(diǎn),縮小各因素的濃度梯度進(jìn)行細(xì)調(diào)正交試驗(yàn).

2.2L9(34)細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)電泳結(jié)果

圖2為L(zhǎng)9(34)細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)電泳結(jié)果.由圖2可知,由于在L16(45)正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)調(diào),所以各條帶之間差異不大,除了1號(hào)處理之外均有明顯條帶,其中6號(hào)處理?xiàng)l帶數(shù)較其他處理少,8、9號(hào)處理雖然條帶數(shù)較多但條帶模糊,亮度較弱,其余2、3、4、5、7擴(kuò)增效果差異不大,綜合條帶數(shù)、亮度、清晰度、擴(kuò)增特異性等方面,確定組合3為最優(yōu)反應(yīng)體系.即20 μL最優(yōu)反應(yīng)體系中,五因素最佳水平為:20 ng/20 μLDNA 模板,0.45 μmol/L引物,2.65 mmol/L Mg2+,0.4 U/20 μL Taq DNA 聚合酶,0.45 mmol/L dNTPs.

2.3引物的篩選和退火溫度的確立

利用梯度PCR儀自動(dòng)生成10個(gè)溫度梯度,根據(jù)不同退火溫度下各引物的擴(kuò)增效果確定退火溫度,從而對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選和各引物最佳退火溫度的確立.圖3為引物840的退火溫度梯度優(yōu)化結(jié)果.圖4為引物888、890、834退火溫度梯度優(yōu)化結(jié)果.由圖3、4可知,4、16、23、32泳道的PCR擴(kuò)增條帶數(shù)量多且清晰.因此引物840、888、890、834的最佳退火溫度分別為49.1、53.9、51.6、51.0 ℃.已篩得ISSR引物及其退火溫度見表5.

圖3 引物840退火溫度梯度優(yōu)化

圖4 引物888、890、834退火溫度梯度優(yōu)化.泳道11～20對(duì)應(yīng)引物888;泳道21～30對(duì)應(yīng)引物890;泳道31～40對(duì)應(yīng)引物834

由表5可知,不同引物的最適退火溫度差異較大,為驗(yàn)證所篩得引物可以區(qū)分不同地區(qū)真蘚的差異性以及引物的有效性,選擇來自云南省大理州劍川縣(N26°32′29.784″,E99°53′12.905″)、云南省麗江市玉龍縣白沙鎮(zhèn)文海村(N27°00′48.24″,E100°09′23.92″)和浙江省杭州市龍崗鎮(zhèn)仙人塘村(N30°17′32″,E119°2′47″)、舟山市岱山蓬萊公園(N30°14′40.465″,E122°12′17.238″)4個(gè)地點(diǎn)的8份真蘚標(biāo)本,提取DNA,對(duì)已篩得的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖5),不同地點(diǎn)的真蘚DNA擴(kuò)增結(jié)果有明顯差異,且條帶清晰明亮.說明所篩得的引物和優(yōu)化的體系可用于不同地區(qū)真蘚的遺傳多樣性的研究.

表5 篩得的有效ISSR引物及其退火溫度

3 結(jié)論與討論

圖5 引物825、835對(duì)來自不同地點(diǎn)的8份真蘚標(biāo)本的擴(kuò)增結(jié)果.泳道1～8對(duì)應(yīng)引物825模板為來自4個(gè)不同地區(qū)的真蘚DNA;泳道9～16對(duì)應(yīng)引物835模板為來自4個(gè)不同地區(qū)的真蘚DNA

ISSR-PCR擴(kuò)增體系中的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶的濃度均會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響,引物的濃度與條帶清晰度和背景亮度有關(guān),引物濃度過高會(huì)導(dǎo)致背景明亮條帶模糊,引物濃度過低則會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不充分[20].Mg2+的濃度會(huì)影響聚合酶的活性,從而影響擴(kuò)增效果[21],dNTPs濃度過高會(huì)影響聚合酶活性,過低會(huì)使擴(kuò)增量降低,Taq DNA聚合酶與擴(kuò)增的條帶數(shù)目有關(guān)[22],模板DNA對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較小,一般僅需微量的模板DNA,模板DNA濃度過大會(huì)使條帶變得彌散[20].所以通過正交實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)各個(gè)因素的同時(shí)找到最優(yōu)反應(yīng)體系,正交試驗(yàn)結(jié)果表明,在20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中包括20 ng/20 μL DNA模板、0.45 μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg2+、0.4 U /20 μLTaq DNA聚合酶、0.45 mmol/L dNTPs.

對(duì)于不同植物,適用的ISSR引物不同,同一ISSR引物應(yīng)用于不同植物,其退火溫度不同,退火溫度對(duì)擴(kuò)增效果起著至關(guān)重要的作用,退火溫度會(huì)影響擴(kuò)增條帶的清晰度[22-23].所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)引物設(shè)置溫度梯度進(jìn)行最適退火溫度的篩選,從100條ISSR引物中篩選出50條條帶清晰,多態(tài)性豐富,穩(wěn)定性好的ISSR引物.說明真蘚具有豐富的遺傳背景,可為今后真蘚科植物遺傳多樣性及分類學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù).

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(責(zé)任編輯:顧浩然,包震宇)

OptimizationofISSR-PCRreactionsystemandselectionofprimersinBryumargenteum

Ma Xiaoying, Wei Wei, Zang Cheng, Yu Jing*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

In order to determine optimum ISSR-PCR reaction system for mossBryumargenteum,the concentrations of template DNA primers,dNTPs,Mg2+and Taq DNA polymerase were optimized in four levels by PCR orthogonal experimental method.The appropriate primers were screened from 100 primers by temperature gradient PCR,and the optimal anneal temperature of the screened primers were determined.The results showed that the optimized 20 μL ISSR-PCR reaction system was as follows:template DNA 20 ng/20 μL,primers 0.45 μmol/L,Mg2+2.65 mmol/L,Taq DNA polymerase 0.4 U/20 μL,dNTPs 0.45 mmol/L.Using this system,50 primers with clear bands,repeatability well and polymorphism highly were selected from 100 primers.The establishment of this system,the screened primers and the annealing temperature could provide a theoretical basis for further research on the genetic diversity of bryophytes using ISSR molecular markers.

Bryumargenteum; ISSR; orthogonal design; primer screening; annealing temperature

Q 949

A

1000-5137(2017)05-0668-07

2017-08-27

國家自然科學(xué)基金(31570208);上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(17DZ2252700);上海師范大學(xué)校前瞻性預(yù)研項(xiàng)目(DYL201503)

馬曉英(1992-),女,碩士研究生,主要從事苔蘚植物分類學(xué)方面的研究.E-mail:1977805338@qq.com

導(dǎo)師簡(jiǎn)介: 于 晶(1972-),女,副教授,主要從事苔蘚植物生態(tài)學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的研究.E-mail:yujing@shnu.edu.cn

*