基因測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)用于脹罐醬油中產(chǎn)氣菌的檢測(cè)

楊卓，楊歡嵐，姚泓，周曉偉，唐書澤，吳希陽*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 2(嶺南國際企業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 廣州，510064)

基因測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)用于脹罐醬油中產(chǎn)氣菌的檢測(cè)

楊卓1，楊歡嵐1，姚泓1，周曉偉2，唐書澤1，吳希陽1*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 2(嶺南國際企業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 廣州，510064)

以工廠脹罐醬油為研究對(duì)象，對(duì)導(dǎo)致醬油脹罐的產(chǎn)氣菌進(jìn)行分離和鑒定。使用高鹽MRS培養(yǎng)基 (含6% NaCl)分離到一種厭氧菌，經(jīng)產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)證明該菌是導(dǎo)致醬油產(chǎn)氣脹罐的原因，經(jīng)16S rDNA基因測(cè)序以及高通量測(cè)序確證該厭氧產(chǎn)氣菌為破布子乳酸桿菌 (Lactobacilluspobuzihii)；采用高鹽PDA培養(yǎng)基沒有分離到酵母菌，且用多對(duì)18S rRNA引物對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增陰性，證明醬油脹罐的原因?yàn)槲廴玖似撇甲尤樗峋覜]有酵母菌或其他真菌污染。該研究顯示了基因測(cè)序方法對(duì)于食品中未知、難培養(yǎng)微生物污染的檢測(cè)具有優(yōu)越性。

脹罐醬油；高通量測(cè)序；分離鑒定；破布子乳酸桿菌(Lactobacilluspobuzihii)

醬油是我國常用調(diào)味品，其中若存在腐敗微生物則會(huì)出現(xiàn)不良風(fēng)味，并影響口感[1]。若是醬油出現(xiàn)產(chǎn)氣、脹罐(脹袋)、爆瓶現(xiàn)象，均可能導(dǎo)致醬油的營養(yǎng)成分被破壞、pH值發(fā)生改變、產(chǎn)生有毒物質(zhì)等，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失[2]。醬油中導(dǎo)致脹罐產(chǎn)氣的微生物主要有腸桿菌、乳酸菌、酵母以及丁酸梭菌等[3-4]。醬油的生產(chǎn)常用酵母作為發(fā)酵菌，若發(fā)酵完成后對(duì)醬油的滅菌不徹底，造成酵母菌的殘留，或者酵母的二次生長(zhǎng)，將成為安全隱患導(dǎo)致醬油出現(xiàn)脹罐等不利現(xiàn)象[5-6]。在醬油發(fā)酵過程中，乳酸菌對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成有著重要的作用[7]。在醬油生產(chǎn)過程中如果還殘留有乳酸菌，某些種的乳酸菌的產(chǎn)氣特性也會(huì)造成醬油的脹罐[8]。

傳統(tǒng)微生物分離和鑒定主要通過形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)基及生化反應(yīng)等，但其特異性低、周期較長(zhǎng)[9-10]。尤其對(duì)于未知、難培養(yǎng)微生物污染的檢測(cè)極其困難，影響了食品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量與安全的檢控?，F(xiàn)代生物技術(shù)和分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，16S rRNA、18S rRNA序列測(cè)定技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等新方法出現(xiàn)，研究人員可不再完全依賴傳統(tǒng)方法來研究微生物[11]。微生物的rRNA在堿基組成、堿基的序列、生物功能及高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面表現(xiàn)出的高度保守性以及部分可變性[12-13]，人們通常利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)出通用引物從微生物標(biāo)本中擴(kuò)增出16S rRNA的基因片段，通過克隆測(cè)序、探針雜交、酶切片段多態(tài)性分析等方法獲得16S rRNA序列信息并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)來鑒定菌種[14]。這種耗時(shí)短、更精確的特點(diǎn)使16S rRNA序列測(cè)定技術(shù)成為細(xì)菌分類和鑒定的一個(gè)有力工具[15]。同樣具有相同原理的18S rRNA序列測(cè)定技術(shù)，也成為真菌鑒定的有力工具[16-19]。高通量測(cè)序被稱為新一代測(cè)序，不僅通量高，而且能夠同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品，能解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對(duì)豐度，包括細(xì)菌、真菌、酵母以及古菌，因而被廣泛應(yīng)用在食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成的研究中[20-22]。本研究以2016年廣州某醬油工廠出現(xiàn)脹罐的醬油為研究對(duì)象，分析導(dǎo)致脹罐的原因。在傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合16S rDNA高通量測(cè)序來分離和鑒定脹罐醬油樣品中的產(chǎn)氣菌，以及醬油的微生物組成，為醬油的安全檢測(cè)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

2批次脹罐醬油以及正常醬油樣品來自廣州某醬油廠。均為發(fā)酵生抽，1 L PPV罐包裝,常溫保存，脹罐醬油與正常醬油pH平均值分別為4.83、5.03，檢測(cè)日期為生產(chǎn)日期的第35天。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液，廣東陸橋微生物科技有限公司；分析純NaCl，天津大茂化學(xué)試劑廠；0X TBE液、DL2000DNA maker、RR01AM TaKaRa ExTaq，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖，廣州英濰捷基貿(mào)易有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司天根；Tap PCR Master Mix(2X，Blue dye)、引物，生工生物(上海)股份有限公司；PDA培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)、冷凍高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠公司；XW-80A型渦旋混合器，其林貝爾儀器制造有限公司；AY6907型厭氧培養(yǎng)罐，美國GeneScience公司；恒溫金屬浴，上海博通化學(xué)科技有限公司；PYX-250S-A生化培養(yǎng)箱，科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；微量移液器、Mastercycler Pro PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf公司；C-22厭氧指示劑、C-1厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱株式會(huì)社；PL602-S電子天平，METTLER TPLEDO；Tocan/Tocan240凝膠成像儀，Bio-rad；DYCZ-24DN核酸電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基及配制

MRS培養(yǎng)基購自廣東陸橋微生物科技有限公司，高鹽MRS培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基里添加6% NaCl，121 ℃滅菌15 min。

滅菌醬油：取脹罐的醬油15 mL，105 ℃滅菌15 min。

PDA培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，高鹽PDA培養(yǎng)基在PDA培養(yǎng)基里添加6% NaCl，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 分離培養(yǎng)

脹罐醬油樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)進(jìn)行10倍稀釋。選擇合適的稀釋倍數(shù)吸取1 mL菌懸液倒板MRS、高鹽MRS、高鹽PDA培養(yǎng)基。將MRS、高鹽MRS平板置于37 ℃厭氧與好氧培養(yǎng)3 d，高鹽PDA平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)得到菌落總數(shù)。

1.2.3 醬油總基因組DNA的提取

取20 mL樣品于50 mL離心管中離心(12 000 g，5 min)，棄上清液，加入6 mL PBS置于渦旋混合器中重懸，重復(fù)離心與渦旋3次得到前處理液。 取2 mL前處理液使用天根公司的糞便基因組DNA提取試劑盒提取醬油總基因組DNA。將提取得到的DNA用nanodrop確定其濃度和純度后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

使用1對(duì)細(xì)菌通用引物和3對(duì)真菌通用引物對(duì)醬油總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)表1不同引物配制體系，再依據(jù)表2設(shè)置相應(yīng)的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)程序

1.2.5 DNA測(cè)序

將得出特異性條帶的產(chǎn)物和提取的DNA樣品委托廣州生工生物工程有限公司以及廣州美吉生物醫(yī)藥科技有限公司分別進(jìn)行16S rRNA測(cè)序以及高通量測(cè)序。

1.2.6 產(chǎn)氣試驗(yàn)

將從高鹽MRS培養(yǎng)基中分離得到的細(xì)菌接種到高鹽MRS肉湯、滅菌醬油以及正常醬油中加入杜氏小管37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)分離培養(yǎng)

本研究初期為了分離導(dǎo)致醬油脹罐的產(chǎn)氣菌，采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法將醬油樣品接種到常規(guī)的細(xì)菌營養(yǎng)培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，在好氧和厭氧條件下均無菌落生長(zhǎng)。表明該未知的產(chǎn)氣菌無法在普通的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。鑒于醬油是一種高鹽含量的調(diào)味品，能在這種高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)判斷該菌是一種嗜鹽菌。將脹罐醬油樣品接種到高鹽MRS培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)結(jié)果為陰性，厭氧培養(yǎng)3 d后有菌落長(zhǎng)出，2批脹罐醬油菌落平均數(shù)分別為370 CFU/mL和610 CFU/mL，菌落形態(tài)均一，而正常醬油樣品中未檢測(cè)出菌落。2004年吳瑞華等、2006年歐陽友生等在脹罐的醬油中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣酵母[5-6]，因此為了探究是否存在產(chǎn)氣的酵母，使用高鹽PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在28 ℃下培養(yǎng)5 d未觀察到菌落。

2.2分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 PCR擴(kuò)增

挑取高鹽MRS培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，與脹罐醬油中提取得到的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌通用引物27F/1492R在1 500 bp左右有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，這表明脹罐醬油中有細(xì)菌的污染。使用3對(duì)真菌通用引物未得到PCR產(chǎn)物，表明脹罐醬油中沒有真菌的污染。未脹罐的正常醬油中無法提取到細(xì)菌基因組DNA。

2.2.2 BLAST比對(duì)結(jié)果

為了鑒定該細(xì)菌，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托廣州生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將得到的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示相似度最高的菌種名稱為破布子乳酸菌(Lactobacilluspobuzihii)(見表3)。

2.2.3 高通量測(cè)序

為了探究脹罐醬油中微生物群落結(jié)構(gòu)，將其中3瓶脹罐的醬油提取得到的DNA(編號(hào)為1、4、4-3)送至廣州美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序，得到微生物群落結(jié)構(gòu)圖(圖1)。顯示4-3號(hào)脹罐醬油中主要污染了破布子乳酸菌，而其他2個(gè)樣品中除了含有破布子乳酸菌，還存在普雷沃菌屬(Prevotella)、糞球菌屬(Faecalibacterium)、小桿菌屬(Dialister)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)。3個(gè)樣品中破布子乳酸菌的豐度各不相同，且4號(hào)樣品中普雷沃菌屬的豐度超過了破布子乳酸菌?；?-3號(hào)樣品的生產(chǎn)日期最早，1號(hào)樣品次之，4號(hào)最末，結(jié)合正常醬油中沒有提取到微生物的DNA，可能原因是作為優(yōu)勢(shì)菌群的破布子乳酸菌在脹罐醬油中不斷增殖，也與醬油中的其他菌群存在競(jìng)爭(zhēng)，隨著時(shí)間推移，最終在脹罐醬油中占主導(dǎo)地位。對(duì)比1號(hào)樣品與4號(hào)樣品可以發(fā)現(xiàn)，破布子乳酸菌對(duì)普雷沃菌屬的抑制相較于其他細(xì)菌更加明顯，具體原因有待探究。

表3 目標(biāo)菌株的16S rDNA序列BLAST比對(duì)結(jié)果

圖1 微生物群落組分圖Fig.1 Microbial community composition map

2.3產(chǎn)氣檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證破布子乳酸菌是導(dǎo)致醬油脹罐的原因，將該分離菌接種到高鹽MRS肉湯中厭氧培養(yǎng)3 d，杜氏小管里沒有觀測(cè)到氣泡，在管底部?jī)H有菌體沉淀生成。陰性對(duì)照管中沒有菌體沉淀表明不存在其他細(xì)菌的污染，這說明破布子乳酸菌不能在高鹽MRS肉湯中產(chǎn)氣。本研究所用脹罐醬油樣品均在工廠生產(chǎn)過程經(jīng)過巴氏殺菌后發(fā)現(xiàn)脹罐現(xiàn)象，因此為了盡可能在殺滅細(xì)菌的同時(shí)維持醬油的營養(yǎng)成分不受干擾，將脹罐醬油在105 ℃下滅菌作為液體培養(yǎng)基，雖然有部分美拉德反應(yīng)，但是大部分的營養(yǎng)成分保留能夠提供破布子乳酸菌的生長(zhǎng)需要，同時(shí)將正常醬油作為補(bǔ)充參照組。而將該分離菌接種到正常醬油以及滅菌的醬油中厭氧培養(yǎng)3 d后，接種了破布子乳酸菌的滅菌醬油和正常醬油中的杜氏小管里觀測(cè)到氣泡，陰性對(duì)照管中杜氏小管里沒有觀測(cè)到氣泡。表明破布子乳酸菌導(dǎo)致了醬油的脹罐，同時(shí)破布子乳酸菌需要處于醬油的理化與營養(yǎng)環(huán)境中才能產(chǎn)氣，在高鹽MRS肉湯中不能產(chǎn)氣。

3 討論

在對(duì)廣州某醬油廠的脹罐醬油進(jìn)行產(chǎn)氣菌研究時(shí)，因?yàn)椴涣私馕粗a(chǎn)氣菌的營養(yǎng)要求，導(dǎo)致使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法分離到目標(biāo)菌。經(jīng)提取脹罐醬油的總DNA并通過細(xì)菌16S rDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)氣菌為破布子乳酸菌。該細(xì)菌的首次報(bào)道是從臺(tái)灣高鹽發(fā)酵食品破布子中用6%NaCl的鹽度分離出來的一種耐高鹽厭氧乳酸菌[32]，本實(shí)驗(yàn)據(jù)此改用含6% NaCl的MRS培養(yǎng)基形成高鹽環(huán)境，在厭氧環(huán)境培養(yǎng)成功，從脹罐醬油中分離得到破布子乳酸菌。在對(duì)該菌進(jìn)行產(chǎn)氣驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌僅能在醬油中產(chǎn)氣，在高鹽MRS肉湯中僅能生長(zhǎng)而不產(chǎn)氣，具體原因有待進(jìn)一步探究。

2004年吳瑞華等，2006年歐陽友生等在脹氣的醬油中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣酵母[5-6]，說明酵母污染的可能性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合18S rRNA測(cè)序以及傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法排除了酵母或其他產(chǎn)氣真菌的存在，最終確認(rèn)導(dǎo)致醬油脹氣的產(chǎn)氣菌為破布子乳酸菌。顯示DNA測(cè)序分析技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌的特性，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，能極大地便利未知食品腐敗菌的檢測(cè)。

破布子乳酸菌主要用于食品破布子的發(fā)酵[32]，這是國內(nèi)第1次在脹罐醬油中發(fā)現(xiàn)。破布子乳酸菌雖然不是致病菌，但其本身具有產(chǎn)氣性，大量存在于醬油中，導(dǎo)致醬油脹罐，影響醬油的外形美觀及質(zhì)量。在微生物群落結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，脹罐醬油中除了存在大量破布子乳酸菌外，還有其他細(xì)菌的存在，很可能是灌裝醬油滅菌不徹底的原因。因此在醬油的生產(chǎn)中，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格把控滅菌環(huán)節(jié)，同時(shí)嚴(yán)格區(qū)分無菌區(qū)和有菌區(qū)，避免交叉污染，導(dǎo)致不合格產(chǎn)品的出現(xiàn)。

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Genesequencingandtraditionalmicrobialcultureforthedetectionofaerogeninswelledpackingsoysauce

YANG Zhuo1, YANG Huan-lan1, YAO Hong1, ZHOU Xiao-wei2, TANG Shu-ze1, WU Xi-yang1*

1(Department of Food Science amp; Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632,China) 2(Lingnan International Enterprise Group Co., Ltd, Guangzhou 510064,China)

In order to identify the aerogen which causes the packing soy sauce swelled, two swelled packing soy sauce from a factory in Guangzhou were analyzed. Using MRS medium with 6% NaCl to cultivate the bacteria in swelled soy sauce, an anaerobic bacteria was isolated. It was further identified asLactobacilluspobuzihiiby using 16S sequencing and high-throughput sequencing. Yeast or fungus contamination was not detected in the swelled packing soy sauce by using high-salt PDA medium cultivation and PCR amplification with 18S rRNA primers. Therefore,Lactobacilluspobuzihiicontamination was validated as the reason causing the packing soy sauce swelled. Result of this study showed the superiority of gene sequencing method in detecting the unknown and hard-cultivated microorganism in food contamination.

Swelled packing soy sauce; high-throughput sequencing; isolation and identification;Lactobacilluspobuzihii

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015065

碩士(吳希陽教授為通訊作者,E-mail：tkentwu@jnu.edu.cn)。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A050502030，2016A050503031)

2017-06-29，改回日期：2017-07-12