高效液相色譜法檢測玉米制品和堅果制品中的黃曲霉毒素

□ 孟之航 徐州市第一中學(xué)

□ 郁倩 徐州市疾病預(yù)防控制中心

高效液相色譜法檢測玉米制品和堅果制品中的黃曲霉毒素

□ 孟之航 徐州市第一中學(xué)

□ 郁倩 徐州市疾病預(yù)防控制中心

目的是了解市售玉米制品和堅果制品中的黃曲霉毒素污染狀況。方法為結(jié)合免疫親和樣品前處理技術(shù)，采用高效液相色譜法測定市售玉米制品、堅果制品中的4種黃曲霉毒素。檢測了25份市售玉米制品和24份堅果制品，結(jié)果顯示，其中玉米制品的陽性率為36%，堅果制品中未檢出。結(jié)論得出，目前市售食品中黃曲霉毒素污染問題主要存在于玉米及其制品中，污染程度雖不高，但由于黃曲霉毒素的強(qiáng)烈致癌作用，還是應(yīng)該引起重視。

液相色譜法 黃曲霉毒素 檢測

黃曲霉毒素（Aflatoxins，簡稱AFT）是由曲霉屬中的黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1、M2等17種。1993年，AFT被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類致癌物[1]。據(jù)估算，全世界每年約有25%的谷物受到霉菌毒素影響[2]。近20年的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，乳品等動物源性食品中黃曲霉毒素的污染率居高不下[3]。隨著人們的食品安全意識不斷提高，黃曲霉毒素的檢測已經(jīng)引起社會的廣泛關(guān)注和政府的高度重視，檢測方法將向簡便、快捷、靈敏度高的方向發(fā)展。黃曲霉毒素廣泛存在于霉變的玉米制品、花生制品、大米、堅果制品及乳制品等食品中，對人和動物均具有很強(qiáng)的致癌作用和毒性，是誘發(fā)肝癌的重要物質(zhì)之一。為了解易受到黃曲霉毒素污染的食品中黃曲霉毒素的污染狀況，探討其對人體存在的潛在風(fēng)險，本研究結(jié)合免疫親和樣品前處理技術(shù)及高效液相色譜法測定市售玉米制品、堅果制品中的黃曲霉毒素。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1100液相色譜儀，熒光檢測器（G1321B FLD）；電動振蕩器：IKA調(diào)速多用振蕩器（KS 501）；漩渦振蕩器：IKA MS 3；固相萃取儀：SUPELCO。

1.2 材料和試劑

甲醇、三氟乙酸、正己烷、乙腈均為色譜純；黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)品 (1μg/mL，Sigma公司 )；黃曲霉毒素免疫親和柱（美國Beacon）。

1.3 色譜條件

色譜柱：4.6×250mm，5μm，C18；柱溫：30℃。

流動相：乙腈-水，梯度洗脫，梯度條件見表1；流速：1.0mL/min。

表1 梯度洗脫條件

熒光檢測器：激發(fā)波長：360nm；發(fā)射波長：440nm；進(jìn)樣量：25μL。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取及凈化

將樣品打磨碎后準(zhǔn)確稱取25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加5.0g氯化鈉及甲醇-水（7+3）至125.0mL，用均質(zhì)器高速攪拌提取2min。過濾后準(zhǔn)確移取15.0mL濾液，并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，備用。移取15.0mL樣品提取液，按照免疫親和柱使用說明書，通過親和柱的凈化和濃縮。最后準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，收集洗脫液于試管中，供檢測使用。

1.4.2 樣品衍生

將試管中收集的洗脫液用氮氣吹干（在60℃下），加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30s后，在40±1℃烘箱中衍生15min。氮氣吹干，準(zhǔn)確加入200μL 85%乙腈，溶解，振蕩器上混勻，1000r/min離心15min，取上清液至自動進(jìn)樣瓶中，供測定用。

1.5 工作曲線的制備

吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)使用液，使其成一系列，60℃下氮氣吹干，注意氮吹要溫和，衍生化方法同1.4.2。

1.6 樣品的測定

黃曲霉毒素出峰順序為：AFTG1、AFTB1、AFTG2、AFTB2，以每種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度對峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣根據(jù)保留時間定性，根據(jù)峰面積定量。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)譜圖

應(yīng)用上述條件，分析了4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，黃曲霉毒素按照G1、B1、G2、B2的順序出峰，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜

2.2 方法的檢出限

在本實驗條件下，取不同濃度的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以3倍信噪比計算目標(biāo)物組分的檢出限量，B1、B2、G1、G2檢出限分別為：0.2、0.05、0.2、0.05μg/kg。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在一份空白花生樣品中，分別加入0.05、0.10、0.25μg 3種濃度的B1、B2、G1、G2，各平行測定6次，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度測定的實驗，結(jié)果見表2。其加標(biāo)回收率在82.00%~94.47%之間，RSD在1.50%~6.45%之間。

2.4 堅果制品中黃曲霉毒素檢測結(jié)果

本項研究共采集并檢測了24份堅果制品，分別為開心果、杏仁、松仁等堅果類食品，所檢樣品均未檢出黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2。

2.5 玉米粉（碴）中黃曲霉毒素檢測結(jié)果

本項研究共采集并檢測了25份市售玉米制品，分別為干玉米粒、玉米粉、玉米片，均無霉變現(xiàn)象，共檢出9份樣品含有黃曲霉毒素，陽性率36%，其中一份樣品超出國家允許限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

結(jié)果顯示，玉米制品的黃曲霉毒素污染情況較為普遍，36.0%的玉米制品受到黃曲霉毒素污染，4種毒素中以AFTB1陽性率和濃度最高，AFTB2、AFTG1和AFTG2依次降低，每種毒素的陽性率比前一種降低20%左右，變化比較平穩(wěn)。4種黃曲霉毒素中，AFTB1的陽性率和濃度都最高，是AFTS的主要組成成分?？傮w而言，AFTB2、AFTG1和AFTG2的污染水平依次降低。

本研究顯示，目前市售食品中黃曲霉毒素污染問題主要存在于玉米及其制品中，污染程度雖不高，但由于黃曲霉毒素的強(qiáng)烈致癌作用，還是應(yīng)該引起重視。糧食收獲后，要加強(qiáng)保管，嚴(yán)格控制霉菌生長條件，嚴(yán)格防霉。改善貯藏條件，抑制霉菌生長。為保障食品安全，政府部門在做好田間管理的同時，還應(yīng)加強(qiáng)日常的監(jiān)督檢查，使抽檢監(jiān)測工作穩(wěn)定化、常規(guī)化、連續(xù)化，指導(dǎo)百姓安全食用，讓人們食得放心，食得健康。

[1] 勞文艷，林素珍.黃曲霉毒素對食品的污染及危害[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報，2011，25(1):64-69．

[2] 胡娜，許楊.組合實驗設(shè)計用于黃曲霉毒素污染控制的研究[J].糧食儲藏，2006(3):39-42.

[3] 段文仲，呂紅英，龐津霞.動物源性食品中黃曲霉毒素污染控制研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(7):206-208.