拮抗菌株TJB-8的鑒定及抑菌物質(zhì)分析

田愛霞

（甘肅省靖遠(yuǎn)縣職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，甘肅白銀730600）

拮抗菌株TJB-8的鑒定及抑菌物質(zhì)分析

田愛霞

（甘肅省靖遠(yuǎn)縣職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，甘肅白銀730600）

菌株TJB-8是從楊樹Populus根部土壤中分離獲得的一株對楊樹腐爛病菌Cytospora chysosperma具有明顯抑菌效果的細(xì)菌?；谛螒B(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鑒定了TJB-8的分類地位，并分別采用菌絲生長速率法和二分皿法分析了其抑菌活性物質(zhì)，為菌株TJB-8的實(shí)際開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示：菌株TJB-8的無菌濾液有效抑制了楊樹腐爛病菌菌絲生長，抑制率達(dá)到97.42%（72 h），并使生長的菌絲產(chǎn)生畸形膨大；TJB-8的無菌濾液還能明顯抑制膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，細(xì)極鏈格孢菌Alternaria tenuissima，尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，禾谷鐮刀菌F.graminearum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani的生長；菌株TJB-8經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus，并發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶；此外，其產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)及揮發(fā)性氣體均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，對楊樹腐爛病菌的抑制率分別達(dá)到100%（72 h），100%（72 h）和76.08%（48 h）。蠟樣芽孢桿菌TJB-8是一株抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣且能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)的拮抗細(xì)菌，作為一種生物殺菌劑具有較高的工業(yè)開發(fā)和田間應(yīng)用的前景。圖5表4參27

森林保護(hù)學(xué)；蠟樣芽孢桿菌；抑菌活性；抑菌蛋白；脂肽；揮發(fā)性氣體

人們越來越意識到使用化學(xué)農(nóng)藥的弊端，并開始積極尋求其他防治手段來替代或減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。生物防治因其高效，對環(huán)境、生態(tài)及人類健康安全，無毒等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛重視和關(guān)注，并成為了目前植物病害防治的熱點(diǎn)。目前，很多有益微生物及其代謝產(chǎn)物被成功應(yīng)用于植物病害的生物防治中，包括真菌、細(xì)菌、放線菌、酵母等。在這些生防微生物中，芽孢桿菌屬Bacillus是近年來生物防治研究的一個重點(diǎn)方向［1］。芽孢桿菌廣泛分布于自然界各種不同環(huán)境中，包括土壤、水體、植物體表面及體內(nèi)等。其生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、抗逆性強(qiáng)、易于在植物體表面定殖與繁殖、抑菌譜廣、對人畜無害、不污染環(huán)境，且制劑生產(chǎn)的工藝簡單、制劑穩(wěn)定、儲存時間長、施用方便，不僅符合人們對環(huán)境和健康的需求，而且為農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障［1-2］。大量的研究表明：芽孢桿菌防治植物病害的作用方式多種多樣，主要有拮抗作用、競爭作用、溶菌作用、誘導(dǎo)抗性和促進(jìn)植物生長等［1］。拮抗作用是芽孢桿菌通過產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，抑制或殺死病原菌的現(xiàn)象，是芽孢桿菌最主要的作用方式，也是目前研究較為深入廣泛的一種抑菌機(jī)制［3］。芽孢桿菌主要通過2種途徑產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，分別是核糖體途徑和非核糖體途徑。核糖體合成的抑菌物質(zhì)主要有活性蛋白類、酶類、細(xì)菌素等，如鞭毛蛋白、枯草菌素、葡聚糖酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶等；非核糖體途徑合成的抑菌物質(zhì)主要有脂肽類、多肽類物質(zhì)、揮發(fā)性抑菌物質(zhì)等，如表面活性素（surfactins），伊枯草菌素（iturins），豐原素（fengycins），醇類，聚酮類，酚類，大環(huán)內(nèi)酯類等［1-5］。菌株TJB-8是從楊樹Populus根部土壤中分離得到的一株對楊樹腐爛病菌Cytospora chrysosperma具有明顯抑菌活性的拮抗細(xì)菌。本研究測定了菌株TJB-8無菌濾液的抑菌活性，鑒定了菌株，并初步分析了其抑菌活性物質(zhì)。研究結(jié)果為該菌株的進(jìn)一步工業(yè)開發(fā)和田間應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試拮抗菌株TJB-8均由甘肅省靖遠(yuǎn)縣職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校生物學(xué)實(shí)驗室分離并保存，供試病原真菌均由中國林業(yè)微生物保藏中心提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

拮抗菌株的培養(yǎng)和斜面保存均采用Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基；拮抗菌株種子液制備采用LB液體培養(yǎng)基；拮抗菌株的發(fā)酵培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)基［葡萄糖22.64 g，蛋白胨11.93 g，大豆粉5.00 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.00 g， 硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0.50 g， 氯化銨（NH4Cl） 3.00 g， 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.00 g，酵母浸粉1.86 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2］［6］；病原真菌的培養(yǎng)和抑菌活性的檢測均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.3 拮抗菌株TJB-8抑菌活性的探究

1.3.1 TJB-8無菌濾液的制備 挑取活化后的TJB-8單菌落，接種至盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃，200 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)24 h得到TJB-8種子液。按1%的接種量將種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28℃，200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)4 d。4℃，10 000 g的條件下離心30 min后收集上清液，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌濾液［7］。

1.3.2 TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌及其他5種病原真菌的抑制活性 抑菌活性的測定采用菌絲生長速率法［8］。將無菌濾液以體積比1∶10的比例與加熱冷卻至40～50℃的PDA混合，倒平板，在不同的平板中央分別接入直徑6 mm的病原真菌菌餅，28℃倒置培養(yǎng)，隔12 h測量病原真菌菌落直徑，直至對照組菌落直徑長至培養(yǎng)皿直徑的3/4以上為止。以不加無菌濾液的平板作為對照，設(shè)重復(fù)3個·處理-1，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率＝［（對照組菌落擴(kuò)展直徑-處理組菌落擴(kuò)展直徑）/對照組菌落擴(kuò)展直徑］×100%。其中：菌落擴(kuò)展直徑＝菌落總直徑-菌餅直徑。

1.3.3 TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響 分別挑取1.3.2中對照組和處理組中楊樹腐爛病菌的邊緣菌絲觀察TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響。

1.4 拮抗菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)及生理生化指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)［9-10］的方法對菌株的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行測定，包括革蘭氏染色、接觸酶、淀粉水解、厭氧生長、明膠液化等指標(biāo)。

1.4.2 16S rDNA基因序列測定和比對分析 采用菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法擴(kuò)增16S rDNA［11］：挑取單菌落至裝有200.0 μL無菌去離子水的離心（EP）管中，100℃煮沸10 min后，10 000 g，2 min離心取上清液，即為菌株的基因組DNA。以提取的菌株基因組DNA為模板，利用引物63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′， 1387r： 5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′［12］， 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增體系為 20 μL，含有 10×TaqE 緩沖液 2.0 μL，dNTP 1.6 μL， 引物 63f和 1387r各 1.0 μL， DNA Taq 聚合酶 0.1 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 4.0 min；94℃ 1.0 min，55℃ 1.0 min，72℃1.5 min，35個循環(huán)；72℃10.0 min。引物合成和測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。采用BLAST方法在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索和同源性比較，采用ClustalX 1.8進(jìn)行序列匹配分析，通過MEGA 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育，用Bootstrap（重復(fù)抽樣1 000次）分析評估樹的穩(wěn)定性。

1.5 拮抗菌株TJB-8抑菌物質(zhì)的初步分析

1.5.1 TJB-8產(chǎn)真菌細(xì)胞壁裂解酶特性測定 5種不同真菌細(xì)胞壁裂解酶包括β-1,3-葡聚糖酶、纖維素酶、酯酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的檢測分別采用文獻(xiàn)［9,13-15］中的方法。

1.5.2 蛋白類抑菌物質(zhì)提取及抑菌活性測定 按照1.3.1中的方法獲得TJB-8的無菌濾液，逐漸加入硫酸銨至70%的飽和度，振蕩混勻，于4℃靜置過夜。在4℃，10 000 g的條件下離心30 min后收集沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水中，再置于透析袋（8 000～14 000 D）中透析脫鹽，透析后收集透析袋中的蛋白提取物溶液，調(diào)節(jié)其pH至中性，并將其最終體積調(diào)整為原始無菌濾液體積的一半。最后再用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌蛋白提取物溶液，并置于4℃冰箱保存［7］。利用菌絲生長速率法測定蛋白提取物溶液對楊樹腐爛病菌的抑菌活性。

1.5.3 脂肽類抑菌物質(zhì)提取及抑菌活性測定 按照1.3.1中的方法獲得TJB-8的無菌濾液，用6.0 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)無菌培養(yǎng)濾液的pH值至pH 2.0，于4℃靜置過夜。在4℃，10 000 g的條件下離心30 min后收集沉淀，用甲醇萃取3次，合并萃取液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干得到脂肽類提取物［15］。用蒸餾水將脂肽類提取物溶解至最終體積為原無菌濾液體積的一半，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌脂肽類提取物溶液，4℃保存?zhèn)溆茫?］。利用菌絲生長速率法測定脂肽類提取物溶液對楊樹腐爛病菌的抑菌活性。

1.5.4 揮發(fā)性氣體抑菌活性測定 采用二分皿法測定揮發(fā)性氣體對楊樹腐爛病菌的抑菌活性［8］。隔12 h測量病原菌菌落直徑，直至對照組菌落直徑長至培養(yǎng)皿半徑的3/4以上為止。計算抑菌率，重復(fù)3次·處理-1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對不同處理組間的差異進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌及其他5種病原真菌的抑菌活性

菌株TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌具有明顯的抑菌活性，培養(yǎng)12 h時，能有效地抑制楊樹腐爛病菌菌絲生長；隨著培養(yǎng)時間的延長，處理組的菌絲開始生長，至48 h后，處理組的菌絲停止生長。培養(yǎng)72 h后，抑制率達(dá)到97.42%（圖 1A，圖1B，表1）。無菌濾液對其他5種病原真菌也均有較好的抑菌活性。抑菌活性顯示TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌，細(xì)極鏈格孢菌Alternaria tenuissima，立枯絲核菌Rhizoctonia solani的抑菌活性最高，抑制率分別達(dá)到97.42%，96.65%和95.45%；對禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum的抑菌活性次之，抑菌率達(dá)到64.11%；對膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum的抑菌活性最低，但抑制率也分別達(dá)到58.40%和57.73%（表2）。此外，通過觀察楊樹腐爛病菌對照組和處理組菌落邊緣的菌絲發(fā)現(xiàn)，楊樹腐爛病菌菌絲經(jīng)過TJB-8無菌濾液作用后會產(chǎn)生局部膨大的畸形（圖1D），而對照組的菌絲生長正常、形態(tài)均勻（圖1C）。

表1 拮抗菌株TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of sterile culture filtrate of strain TJB-8 against Cytospora chrysosperma

圖1 拮抗菌株TJB-8無菌濾液對楊樹腐爛病菌菌絲生長及形態(tài)的影響Figure 1 Effect of sterile culture filtrate of strain TJB-8 on the growth and morphology of fungal hyphae

表2 拮抗菌株TJB-8無菌濾液的抑菌譜Table 2 Antifungal spectrum of sterile culture filtrate of strain TJB-8

2.2 拮抗菌株TJB-8的鑒定

2.2.1 形態(tài)和生理生化特征 菌株TJB-8為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌體大小為（0.8～1.1）μm×（2.1～3.0）μm，有鞭毛，產(chǎn)芽孢，兼性厭氧型。在LB培養(yǎng)基平板上菌落呈灰白色，不透明，表面光滑干燥，形狀不規(guī)則近圓形，中部隆起，不產(chǎn)色素。依據(jù)菌株的生理生化特征（表3），并利用統(tǒng)計學(xué)方法將拮抗菌株TJB-8和芽孢桿菌屬內(nèi)各個種的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行聚類分析，鑒定菌株TJB-8與蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus最為相近。

表3 菌株TJB-8生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain TJB-8

2.2.2 16S rDNA序列測定及分析 菌株TJB-8的16S rDNA PCR擴(kuò)增得到一段大小約為1.3 kb的基因片段，回收測序后，測定的片段大小為1 258 bp，提交到GenBank，序列號為KX886805。用ClustalX和MEGA軟件進(jìn)行分析，Neibour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。該菌株與模式菌株Bacillus cereus ATCC 14579相似度達(dá)100%。綜合菌株TJB-8的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析的結(jié)果，最終將菌株TJB-8鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

圖2 菌株TJB-8 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain TJB-8

2.3 拮抗菌株TJB-8產(chǎn)真菌細(xì)胞壁裂解酶特性

真菌細(xì)胞壁裂解酶特性的檢測結(jié)果顯示，只有β-1,3-葡聚糖酶（圖3A）和蛋白酶（圖3B）的檢測平板中菌體周圍產(chǎn)生明顯透明圈，而其他裂解酶檢測平板中菌體周圍未見透明圈或暈圈出現(xiàn)，表明TJB-8能產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶，而不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和脂酶。

2.4 拮抗菌株TJB-8蛋白類和脂肽類提取物的抑菌活性

TJB-8蛋白類和脂肽類提取物的抑菌活性檢測結(jié)果表明：TJB-8的蛋白類和脂肽類提取物均具有較強(qiáng)的抑菌活性（圖4）。蛋白類和脂肽類提取物都能完全抑制楊樹腐爛病菌菌絲生長，且抑菌活性穩(wěn)定，培養(yǎng)72 h后依然保持100%的抑制率（表4）。

2.5 拮抗菌株TJB-8揮發(fā)性氣體的抑菌活性

TJB-8揮發(fā)性氣體的抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，TJB-8的揮發(fā)性氣體對楊樹腐爛病菌具有很好的抑菌活性，能有效地抑制楊樹腐爛病菌菌絲的生長（圖5）。揮發(fā)性氣體的抑菌活性隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，但依然保持較高的抑菌率，培養(yǎng)48 h后其抑制率仍然達(dá)到76.08%（表4）。

表4 菌株TJB-8不同抑菌物質(zhì)的抑菌活性Table 4 Antifungal activities of different antifungal substances produced by strain TJB-8 against Cytospora chrysosperma

圖4 菌株TJB-8蛋白類和脂肽類提取物的抑菌活性Figure 4 Antifungal activities of crude proteins and lipopeptides produced by strain TJB-8

圖5 菌株TJB-8揮發(fā)性氣體的抑菌活性Figure 5 Antifungal activity of volatiles produced by strain TJB-8

3 討論

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于自然界土壤中，和其他種類的生防芽孢桿菌一樣都具有抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)。蠟樣芽孢桿菌能抑制包括鐮刀菌屬Fusarium，葡萄孢屬Botrytis，腐霉屬Pythium，梨孢屬 Piricularia，絲核菌屬 Rhizoctonia，假單胞菌屬Pseudomonas等植物病原菌［16-19］。本研究發(fā)現(xiàn)菌株TJB-8具有較強(qiáng)的拮抗活性和較廣的抑菌譜，其無菌濾液在PDA平板上能有效地抑制楊樹腐爛病菌的生長，抑制率達(dá)到97.42%（72 h），且能使生長的楊樹腐爛病病菌菌絲產(chǎn)生畸形膨大；同時TJB-8的無菌濾液還能有效抑制其他多種植物病原真菌菌絲生長，包括膠孢炭疽菌、細(xì)極鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和立枯絲核。通過結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析最終將TJB-8鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

通過產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)來抑制或殺死病原菌是蠟樣芽孢桿菌和其他種類芽孢桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性及較廣抑菌譜的重要原因之一［3］。通過核糖體途徑和非核糖體途徑合成的蛋白類和脂肽類抑菌物質(zhì)是蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)［3-4］。蛋白類物質(zhì)主要有蛋白酶類物質(zhì)和其他蛋白類物質(zhì)。蛋白酶類物質(zhì)常見的主要有幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和葡聚糖酶等。這些真菌細(xì)胞壁裂解酶的作用機(jī)制主要是通過裂解病原菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞破裂死亡，從而抑制或殺死病原菌［20］。大部分的生防芽孢桿菌都能產(chǎn)生1種或多種細(xì)胞壁裂解酶。CHANG等［16］發(fā)現(xiàn)生防蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus QQ308能產(chǎn)生多種抗真菌裂解酶，包括幾丁質(zhì)酶和蛋白酶。HUANG等［21］報道蠟樣芽孢桿菌28-9能產(chǎn)生一種有效抑制百合灰霉病菌Botrytis elliptica孢子萌發(fā)的幾丁質(zhì)酶。本研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌TJB-8能產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶，這可能是TJB-8無菌濾液能使楊樹腐爛病菌的菌絲產(chǎn)生畸形的重要原因之一。蠟樣芽孢桿菌還能通過核糖體途徑產(chǎn)生其他類型的蛋白類抑菌物質(zhì)。郝變青等［22］研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌BC98-1不僅能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，還能產(chǎn)生能有效抑制黃瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑菌蛋白。本研究從TJB-8無菌濾液中提取蛋白類物質(zhì)并測定其抑菌活性發(fā)現(xiàn)，其蛋白類提取物具有很強(qiáng)的抑菌活性，能100%抑制楊樹腐爛病菌的生長。除了蛋白類抑菌物質(zhì)，蠟樣芽孢桿菌通過非核糖體途徑還能產(chǎn)生多種類型的多肽類抑菌物質(zhì)。SRIRAM等［23］報道蠟樣芽孢桿菌NK1能產(chǎn)生具有抑菌活性的脂肽類物質(zhì)。SILO-SUH等［24］首次從蠟樣芽孢桿菌UW85中分離到了線形多肽類抑菌物質(zhì)zwittermicin A，能有效抑制苜蓿疫霉根腐病菌Phytophthora medicagini的菌絲生長和孢子萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)TJB-8的脂肽類提取物也具有抑菌活性，有效抑制了楊樹腐爛病菌的生長，抑制率達(dá)到100%。

揮發(fā)性氣體也是芽孢桿菌產(chǎn)生的重要抑菌活性物質(zhì)之一，這些具有抑菌活性的揮發(fā)性氣體主要包括醇類、醛類、酸類、脂類和酮類等化合物［5,25］。很多蠟樣芽孢桿菌也被報道能產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌氣體。HUANG等［26］研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌C1L產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體能有效抑制灰霉病菌Botrytis cinerea侵染煙草Nicotiana tabacum葉片，最后鑒定發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性氣體中主要的抑菌物質(zhì)是二甲基二硫（DMDS）。KAI等［27］報道蠟樣芽孢桿菌的揮發(fā)性氣體能抑制病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，并影響菌絲的形態(tài)。本研究的結(jié)果表明：菌株TJB-8的揮發(fā)性氣體能很好的抑制楊樹腐爛病菌的生長，抑制率達(dá)到76.08%。

蠟樣芽孢桿菌TJB-8抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣且能產(chǎn)生多種類型的抑菌活性物質(zhì)，顯示出了較高的研究和應(yīng)用價值。目前，對于蠟樣芽孢桿菌TJB-8的不同類型的抑菌活性物質(zhì)的具體種類及結(jié)構(gòu)還不清楚，需要后期進(jìn)一步的純化與鑒定，在田間的實(shí)際應(yīng)用效果也需要開展后續(xù)的驗證。

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Antagonistic strain of TJB-8 and its antifungal substances

TIAN Aixia
（Jingyuan Vocational Secondary Specialized School of Gansu,Baiyin 730600,Gansu,China）

Strain TJB-8 has been isolated from the root soil of poplar and has exhibited a strong inhibitory effect against Cytospora chrysosperma,a predominant fungus causing poplar canker.In order to provide technical guidance for further exploitation and utilization of TJB-8,the species of TJB-8 and its antifungal substances were investigated in this study.The strain TJB-8 was identified based on morphological and physiological characteristics,as well as a phylogenetic analysis of partial 16S rDNA sequence;the antifungal substances of TJB-8 were analyzed by colony diameter assay and two-compartment plate method.Results revealed that sterile culture filtrates of TJB-8 had a strong antifungal activity against C.chrysosperma with an inhibitory rate of 97.42%（over 72 h）.The hyphae of C.chrysosperma at the edge of the colony exhibited swelling after being treated with a sterile culture filtrate.Also,this sterile culture filtrate effectively inhibited the hyphae growth of Colletotrichum gloeosporioides,Alternaria tenuissima,Fusarium oxysporum,Fusarium graminearum,and Rhizoctonia solani.Strain TJB-8 was identified as Bacillus cereus and produced β-1,3-glucanase and protease.Moreover,TJB-8 produced high antifungal activities against C.chrysosperma with crude proteins （100%in 72 h）,lipopeptides （100%in 72 h）,and volatiles （76.08%in 48 h）.Thus,B.cereus TJB-8 was an antagonistic bacterium with strong antifungal activity,a wide inhibitory spectrum,and varied antifungal substances,having a broad prospect of industrial development and field application as a biological fungicide.［Ch,5 fig.4 tab.27 ref.］

forest protection;Bacillus cereus;antifungal activity;antifungal proteins;lipopeptides;volatiles

S763.1

A

2095-0756（2017）06-1071-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.06.015

2016-10-31；

2016-12-12

田愛霞，高級教師，從事生物學(xué)教學(xué)研究。E-mail：2021885456@qq.com