直接快速多色熒光PCR技術(shù)在高危型HPV分型中的應(yīng)用探討

劉淑園 肖湘文 丁渭 曾燁 張?zhí)旌?王盼盼 陳華云

直接快速多色熒光PCR技術(shù)在高危型HPV分型中的應(yīng)用探討

劉淑園 肖湘文 丁渭 曾燁 張?zhí)旌?王盼盼 陳華云★

目的 探討直接快速多色熒光PCR技術(shù)在高危型人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染分型檢測中的應(yīng)用。 方法 對2014年3月至2014年10月794例患者宮頸粘液樣本，采用直接快速多色熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)熒光PCR技術(shù)同步進(jìn)行HPV分型檢測，并對比分析。對于檢測試劑與對比試劑檢測結(jié)果不一樣的樣本，采取測序法復(fù)核。選擇中國生物制品檢定研究院HPV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行18種HPV型別最低檢出量和特異性分析。同時測試直接快速多色熒光PCR技術(shù)在AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600等多種熒光擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增效果并進(jìn)行比較。 結(jié)果 794例樣本中，檢測試劑檢出高危型HPV陽性患者600例，陰性樣本194例。對比試劑檢出HPV陽性患者595例，陰性樣本199例。直接快速多色熒光PCR技術(shù)檢測HPV的18個型別的最低檢測量在100～1000 copies/mL之間；在AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600等儀器的比對分析中，Bio?Rad CFX96檢測結(jié)果表現(xiàn)最佳。Roche480反應(yīng)時間最長，本底相對較高。國產(chǎn)安杰思AGS9600儀器檢測與AB7500持平居中。 結(jié)論 直接快速PCR技術(shù)無需核酸提取，樣本直接進(jìn)行快速PCR擴(kuò)增，檢測時間短，反應(yīng)速度快，特異性高，重復(fù)性好，試劑本身帶有顏色示蹤，對于解決我國臨床HPV檢測的普及具有重要意義。

人乳頭狀瘤病毒；基因分型；直接快速多色熒光PCR；宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）

宮頸癌是女性第二大癌癥，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)和反復(fù)感染所致。HPV感染同99.7%的子宮頸癌相關(guān)，約70%的成年女性一生中會被HPV感染，從被感染到宮頸癌發(fā)病間期可長達(dá)20年，全世界每年新增50萬例，死亡27.5萬例，亞洲23.5萬例，中國估計(jì)有近10萬新發(fā)病例，約占世界新發(fā)病例總數(shù)的1/5［1］。致癌性高危HPV基因型的持續(xù)感染與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)［2?3］。與未感染HPV的女性相比，感染HPV16和感染HPV18后，患宮頸鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)分別要高出約400倍和250倍［1］。我國城市婦女由于缺乏有組織的篩查計(jì)劃和醫(yī)學(xué)知識，每年約有3萬名婦女死于子宮頸癌［4］。中高危型HPV與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical in?traepithelial neoplasia，CIN2/3）的發(fā)生密切相關(guān)［5］。HPV DNA檢測還可以對難以確定的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells，ASCUS）和宮頸脫落細(xì)胞輕度病變作進(jìn)一步的判斷［6］。2015年美國婦科腫瘤學(xué)會（Society of Gynecologic Oncology，SGO）/美國陰道鏡和宮頸病理學(xué)會（American Soci?ety for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）在針對宮頸癌初篩的指南中指出，高危型HPV檢測可以作為一線宮頸癌初篩方案［7?9］?，F(xiàn)有的運(yùn)用熒光PCR方法進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒基因分型檢測的技術(shù)的缺點(diǎn)主要是擴(kuò)增靈敏度低，耗時長。前期一般都需要經(jīng)過步驟繁瑣的核酸提取，然后運(yùn)用普通Taqman探針的方法進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，而且一般都是FAM和HEX兩通道檢測，無法具體區(qū)分高危HPV型別，難以滿足實(shí)際使用的需要。直接快速多色熒光PCR技術(shù)只需對樣本進(jìn)行簡單的處理即可上樣，反應(yīng)時間短，同時可以檢測13種常見高風(fēng)險(xiǎn) HPV 基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）和3種少見高風(fēng)險(xiǎn)HPV 基因型（26、53、73），還能具體分型高風(fēng)險(xiǎn)HPV 基因型16型和18型。本研究采用直接快速多色熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)熒光PCR技術(shù)同步進(jìn)行HPV分型檢測，并對比分析，探討直接快速熒光PCR技術(shù)在高危型HPV感染分型檢測中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2014年3月至2014年10月來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國人民解放軍蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院就診的經(jīng)臨床確診為HPV感染的794例患者，對其宮頸脫落細(xì)胞、生殖泌尿道分泌物取樣后封裝保存的宮頸刷、拭子或大于1 mL的細(xì)胞保存液進(jìn)行檢測分析。

1.2 試劑與儀器

直接快速多色熒光PCR技術(shù)使用的試劑來自于廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司研制的高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒（PCR?熒光探針法），該試劑盒采用的檢測方法為多重?zé)晒釶CR方法，特異性檢測HPV18種高度危險(xiǎn)型別（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82），并可通過分析熒光來區(qū)分HPV16型（HEX標(biāo)記）和HPV18型（TEXRD標(biāo)記）（剩余16個基因型用FAM標(biāo)記，Globin基因作為檢測內(nèi)標(biāo)用CY5標(biāo)記）。傳統(tǒng)熒光PCR技術(shù)使用的試劑來源于廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司的人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），該試劑為兩通道檢測。18種HPV型別最低檢出量的標(biāo)準(zhǔn)品來源于中國生物制品檢定研究院HPV標(biāo)準(zhǔn)品。特異型分析樣本為4例生殖道病原體陽性樣本，分別感染如下病原體：梅毒螺旋體（Treponema Pallidum）、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、白色念珠菌（Monil?ia albican）、陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis），且均經(jīng)相應(yīng)的試劑盒確認(rèn)為相應(yīng)病原體陽性且無HPV感染，其中梅毒螺旋體、淋球菌、白色念珠菌的濃度為106CFU/mL，陰道毛滴蟲濃度為106個/mL。PCR 擴(kuò)增儀器為 AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600熒光擴(kuò)增儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本的處理

直接快速多色熒光PCR技術(shù)樣本的處理：臨床樣本和另外4例生殖道病原體陽性樣本用滅菌生理鹽水清洗2次后離心棄上清，懸浮細(xì)胞沉淀備用；HPV標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為50 copies/mL、100 copies/mL、500 copies/mL、1000 copies/mL、10000 copies/mL后備用。

傳統(tǒng)PCR技術(shù)樣本的處理：將794例臨床樣本用病毒核酸提取試劑提取核酸備用。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 直接快速多色熒光PCR技術(shù)檢測方法

臨床樣本檢測方法：將離心處理好的794例臨床樣本分別加入直接快速多色熒光PCR擴(kuò)增體系，設(shè)置擴(kuò)增條件，在AB7500上進(jìn)行擴(kuò)增。

最低檢出量檢測方法：將梯度稀釋好（分別為50 copies/mL、100 copies/mL、500 copies/mL、1000 copies/mL、2000 copies/mL）的 18個型別的 HPV標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入直接快速多色熒光PCR擴(kuò)增體系，設(shè)置擴(kuò)增條件，在AB7500上進(jìn)行擴(kuò)增。

特異性檢測方法：選擇另外4例生殖道病原體陽性樣本，分別加入直接快速多色PCR擴(kuò)增體系，設(shè)置擴(kuò)增條件，在AB7500上進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性。

不同機(jī)型測試方法：選擇稀釋后的中國生物制品檢定研究院的HPV標(biāo)準(zhǔn)品，采用直接快速多色熒光PCR技術(shù)檢測其在AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600等多種熒光擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增效果并進(jìn)行比較。

重復(fù)性檢測方法：選擇全部18種基因型質(zhì)粒和隨機(jī)選取5個臨床樣本重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，設(shè)置擴(kuò)增條件，在AB7500上檢測其重復(fù)性。

1.3.2.2 傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測方法

將提取好794例患者宮頸粘液樣本的核酸分別加入傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增體系，設(shè)置擴(kuò)增條件，在AB7500上進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3 反應(yīng)條件

直接快速多色PCR反應(yīng)條件為：50℃3 min；95℃ 5 min；95℃ 5 s 56℃ 16 s（采集熒光），45個循環(huán)。

傳統(tǒng)PCR反應(yīng)條件為：95℃15 min；94℃15 s 55℃ 45 s（采集熒光），45個循環(huán)。

1.4 結(jié)果分析

陽性判斷：熒光曲線與內(nèi)標(biāo)（CY5標(biāo)定）曲線均成S型生長；陰性判定：僅內(nèi)標(biāo)（CY5標(biāo)定）曲線成S型生長。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本次研究采用Kappa檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 直接快速多色熒光PCR技術(shù)檢測試劑性能參數(shù)分析

對中國生物制品檢定研究院HPV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，同時進(jìn)行特異性和靈敏度分析。結(jié)果4例特異性檢測樣本均為陰性，試劑特異性良好。針對18個基因型的最低檢出量分析如表1所示，部分基因型檢測示意圖如圖1所示。本研究對試劑的重復(fù)性進(jìn)行了分析，選擇全部18種基因型質(zhì)粒和5個臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，所有結(jié)果變異系數(shù)低于5%，表明試劑具有良好的重復(fù)性。

表1 18個高危型HPV病毒最低檢出量Table 1 The minimum detection volume of 18 types of high risk HPV

圖1 直接快速多色熒光HPV檢測擴(kuò)增示意圖Figure 1 The amplification diagram of direct rapid fluorescence HPV detection

2.2 AB7500FAST/Bio?Rad CFX96/Roche480/AGS 9600等機(jī)型反應(yīng)時間和結(jié)果表現(xiàn)

通過對不同機(jī)型上機(jī)開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束下機(jī)時間的總體計(jì)算，在 AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600等機(jī)型上反應(yīng)時間分別為1 h 10 min、1 h 5 min、1 h 20 min、1 h 10 min，相對于傳統(tǒng)熒光PCR檢測3.5 h，整個時間縮短了約一半，極大提高了檢測的效率。在AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600檢測的比對分析中，Bio?Rad CFX96檢測結(jié)果表現(xiàn)最佳，時間最短，曲線平滑，本底最低。Roche480在進(jìn)行多色檢測時，反應(yīng)時間最長，由于軟件本身需要進(jìn)行通道選擇，導(dǎo)致部分熒光檢測信號相對不佳，本底較高。國產(chǎn)安杰思AGS9600儀器檢測已經(jīng)可以達(dá)到進(jìn)口儀器水平。所有儀器的重復(fù)性均滿足要求。

2.3 臨床樣本結(jié)果分析

本次研究采用隨機(jī)、盲法的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共檢測樣本794例，本研究試劑檢測到600例陽性樣本，194例陰性樣本。對照試劑檢測到595例陽性樣本，199例陰性樣本。與對照試劑相比，本次研究所用試劑的陽性符合率為100%，陰性符合率為92.82%，總符合率為98.11%，Kappa值為0.950（P=0.000），表明待考評試劑盒與對照試劑盒具有很好的一致性。有5例臨床樣本對照試劑檢測陰性，經(jīng)過GP5/GP6引物擴(kuò)增并測序驗(yàn)證［11］，對照試劑存在漏檢的情況。進(jìn)一步對全部595例陽性樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，其中16型（含混合感染）占22.6%，18型（含混合感染）占10.8%。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤之一，其具有較長的癌前病變階段。人乳頭狀瘤病毒感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的主要病因［11］。HPV感染率隨著宮頸病變進(jìn)展而升高，高危型HPV基因型是宮頸癌變的早期事件，多重感染是加重宮頸病變的重要因素［12］。已有國內(nèi)外研究表明，宮頸癌99%以上是由如下8種高危HPV亞 型 引 起 ：HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV67，其 中 HPV16、HPV18、HPV45、HPV31 是主要高危型，HPV33、HPV52、HPV58、HPV67 是次要高危型［13?14］。但在國內(nèi)，HPV16、HPV52、HPV58、HPV45 發(fā)病率較高。這8種以外的其他高危型，屬于伴隨感染，不會獨(dú)立于以上8種型別存在。

隨著光電技術(shù)的發(fā)展和熒光PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，已經(jīng)出現(xiàn)了可不用樣本核酸提取的直接PCR技術(shù)和基于儀器平臺的快速PCR技術(shù)，這2種技術(shù)代表了目前PCR發(fā)展的新方向［15?16］。本研究采用的直接快速熒光PCR技術(shù)屬于不提取核酸的直接PCR技術(shù)，使用新一代FAST?Taq DNA聚合酶，該酶通過基因工程改造和化學(xué)修飾，聚合酶同時具有熱啟動、快速擴(kuò)增和耐抑制物特性，熱啟動保證了反應(yīng)的敏感度和特異性、快速擴(kuò)增使得檢測時間大大縮短，耐抑制物使得反應(yīng)體系可以對含血樣本進(jìn)行擴(kuò)增不影響結(jié)果，具有極大的應(yīng)用前景。

進(jìn)一步，本研究采用多通道熒光定量PCR技術(shù)檢測HPV DNA，通過使用多種具有不同激發(fā)或發(fā)射波長的熒光物質(zhì)標(biāo)記不同或通用特異性探針進(jìn)行示蹤，從而實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)對不同基因型別進(jìn)行檢測。本研究針對WHO推薦的全部18種高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因型進(jìn)行篩查分型，同時對最高危的16、18型進(jìn)行細(xì)分，一次檢測滿足多種需要。同時，本方法在有質(zhì)粒梯度一起檢測的模式下，還可以對檢測樣本存在的病毒滴度進(jìn)行定量分析。通過本研究證實(shí)，直接快速多色熒光PCR技術(shù)檢測HPV DNA靈敏度高、重復(fù)性好、分型的同時還可以準(zhǔn)確定量，結(jié)果直觀可靠，客觀性強(qiáng)，臨床應(yīng)用前景好。

總之，基于直接快速多色熒光PCR技術(shù)進(jìn)行HPV全部高危型檢測分析，檢測速度快、特異性好、靈敏度高、重復(fù)性高、試劑本身帶有指示劑，對于臨床HPV檢測的普及具有重大價值。

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Application of direct and rapid multi?color fluorescence PCR in high risk HPV typing

LIU Shuyuan，XIAO Xiangwen，DING Wei，ZENG Ye，ZHANG Tianhai，WANG Panpan，CHEN Huayun★（Guangzhou HEAS BioTech Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong，China，510700）

Objective To explore the application of direct and rapid multi?color fluorescence PCR in the detection of high risk human papillomavirus(HPV)infection. Methods From March 2014 to October 2014,cervical mucus samples from 794 patients were detected by direct and rapid multi?color fluorescence PCR and traditional fluorescence PCR for HPV typing comparison.If the results are not consistent when compared with detection reagents(multi?color flourescence PCR)and control reagents(traditional fluorescence PCR),the sequencing method was used for verification.The minimum detectable range and specific analysis of 18 types of HPV from National Institute for Biological products were confirmed.In addition,the amplification efficiency of direct rapid multi?color fluorescence PCR were tested and compared in the instruments of AB7500FAST、Bio?Rad CFX96、Roche480、AGS9600. Results 600 positive samples and 194 negative samples were determined by the multi?color fluorescence PCR(detection reagents)in the sum of 794 samples.595 positive samples and 199 negative samples were determined by the traditional fluorescence PCR(control reagents).The minimum detection of 18 types of HPV with direct and fast multi?color PCR were located between 100～1000 copies/mL.Compared with the test results of fluorescence amplification from AB7500FAST,Roche480 and AGS9600,Bio?Rad CFX96 is the best.The reaction time of Roche480 is the longest and the background is relatively high.AGS9600 and AB7500 are in the middle levels. Conclusion Direct and rapid multi?color fluorescence PCR technology does not require nucleic acid extraction.The detection time is short,rapid reaction,high specificity,good repeatability,and reagent itself with color tracing.It is of great importance to popularize the clinical HPV detection in China.

Human papillomavirus;HPV genotyping;Direct and rapid multi?color fluorescence PCR;Cervical intraepithelial neoplasias

廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司，廣東，廣州510700

★通訊作者：陳華云，E?mail：chy@heasbio.com