仿刺參采苗板上細(xì)菌的分離與鑒定

盧曉平，許艷蕊，范秋蘋，王春蕾，郝魯江

(齊魯工業(yè)大學(xué) 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353)

仿刺參采苗板上細(xì)菌的分離與鑒定

盧曉平，許艷蕊，范秋蘋，王春蕾，郝魯江*

(齊魯工業(yè)大學(xué) 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353)

為了解仿刺參采苗板時(shí)期細(xì)菌的多樣性，對(duì)分離自仿刺參采苗板上的細(xì)菌進(jìn)行了分離和鑒定。應(yīng)用常規(guī)生理生化鑒定、16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明：共分離得到19株海洋細(xì)菌，鑒定為7個(gè)屬，包括短芽孢桿菌屬(Brevibacillussp.)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、Cobetia屬、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、普羅威登斯菌屬(Providenciasp.)和海洋螺菌屬(Oceanospirillaceaesp.)。從海洋環(huán)境中分離篩選細(xì)菌對(duì)海洋資源的開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義，此外對(duì)仿刺參育苗時(shí)期進(jìn)行細(xì)菌種類的鑒定有助于疾病的預(yù)防和治療，對(duì)仿刺參的水產(chǎn)養(yǎng)殖具有一定的指導(dǎo)意義。

仿刺參；細(xì)菌；分離鑒定

0 引言

海洋是生命資源的寶庫(kù)，地球上的生物80%存在于海洋中，海洋生物物種遠(yuǎn)比陸地生物豐富和復(fù)雜[1]。和植物、動(dòng)物一樣，海洋微生物也是重要的海洋自然資源。由于其耐鹽、耐冷、耐壓、耐堿等優(yōu)勢(shì)與特性，海洋微生物具有不同于陸源微生物的各種化學(xué)成分，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的化合物[2]。因此對(duì)海洋環(huán)境中的微生物進(jìn)行分離鑒定，有助于篩選產(chǎn)活性物質(zhì)的菌株，也是生產(chǎn)新型醫(yī)藥品的一個(gè)潛在來(lái)源[3]。大量研究表明，海洋細(xì)菌能夠分泌多種活性物質(zhì)，具有各種各樣的功能，如抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等[4-6]。因此分離海洋細(xì)菌，篩選有價(jià)值的菌株具有重要意義。

海洋微生物資源的研究開(kāi)發(fā)與應(yīng)用越來(lái)越受到重視，本文對(duì)仿刺參采苗板上的細(xì)菌進(jìn)行了分離與鑒定，以期為海洋資源的開(kāi)發(fā)與利用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品取自山東榮成尋山海珍品養(yǎng)殖場(chǎng)，自開(kāi)始投放幼苗附著基開(kāi)始，到幼苗從附著基上剝離，每隔一周采集樣品一次，共采集3個(gè)苗期采苗板上樣品(表1)，將采集自仿刺參采苗板上的樣品采用梯度稀釋法用無(wú)菌海水稀釋為1 000,10 000和100 000倍，采用涂布平板法接入2216E固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h。仔細(xì)觀察平板上細(xì)菌菌落形態(tài)，挑取顯著差異的菌落，采用平板劃線法純化得到異養(yǎng)菌。然后將其轉(zhuǎn)接入含有80%甘油的離心管中于4 ℃保存?zhèn)溆谩⒎蛛x得到的細(xì)菌命名為RS1～RS3，WS1，WS2，PS8，RSG1，RB1～RB6和PB1～PB6。

表1 樣品采集時(shí)間表Tab.1 Time of samples collected

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：Zobell 2216E培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，磷酸鐵 0.01 g，瓊脂 17 g，海水素 35 g，蒸餾水 1 L，調(diào)節(jié)pH至7.6～7.8。

液體培養(yǎng)基：Zobell 2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母膏 1 g，磷酸鐵 0.01 g，海水素 35 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至7.6～7.8。

1.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

觀察細(xì)菌菌落形態(tài)、革蘭氏染色和顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)[7]。

1.3.2 生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[8]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。

1.4 海洋細(xì)菌DNA的提取

按照說(shuō)明書使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提盒(上海生工生物有限公司)提取基因組DNA，取3 μL DNA產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并將產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.5 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

以上述方法提取的DNA為模板進(jìn)行16S rDNA基因片段的擴(kuò)增，所使用的引物為GM5F和907R，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，Mg2+1 μL，dNTP 0.5 μL，GM5F 1 μL， 907R 1 μL，DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL。PCR條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 S，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。0.5×TBE為電泳緩沖液，1.0%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，記錄照片。

將上述所得PCR產(chǎn)物送往上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，得到序列后，將序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.gov)進(jìn)行序列比對(duì)，使用軟件BioEdit, clustal 1.83和MEGA 4，通過(guò)Neighbor-joining構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)分離純化共分離出19株菌，其中16株是革蘭氏陰性菌，3株為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌落形態(tài)大多是圓形，少數(shù)為片狀；菌落顏色以乳黃色和淡乳白色為主，少數(shù)為無(wú)色；菌落形狀多為隆起，邊緣較為圓整，少數(shù)呈觸手狀；菌落多為不透明；少數(shù)具有遷移性；菌體形狀多為桿狀。19株細(xì)菌具體形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)表2。

表2 菌株的形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of strains

2.2 菌株生理生化結(jié)果

對(duì)分離純化出的19株細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表3所示。其中PB1淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，明膠液化試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，參考文獻(xiàn)[7]，初步判斷PB1為假交替單胞菌屬。

表3 菌株的生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strains

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)

2.3 分子鑒定

2.3.1 細(xì)菌DNA的提取

利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提盒對(duì)19株細(xì)菌進(jìn)行總DNA提取，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的部分DNA結(jié)果如圖1所示，位于23 kb處有一明顯條帶，可用于后續(xù)PCR反應(yīng)等。

圖1 部分細(xì)菌DNA的提取結(jié)果Fig.1 Profile of genomic DNA extracted from partial bacterial strainsM: λ-DNA/Hind III。泳道1～10為10株不同的細(xì)菌菌株M: λ-DNA / Hind III. Lane 1-10 is 10 strains of different bacterial strains

2.3.2 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

利用細(xì)菌通用引物GM5F和907R對(duì)19株細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從圖2中可以看出在600 bp左右有一條清晰的條帶，說(shuō)明細(xì)菌的DNA模板經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增都得到了特異性擴(kuò)增。

2.3.3 測(cè)序結(jié)果分析

將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的結(jié)果與NCBI已知的16S rDNA 進(jìn)行同源性比對(duì)，下載同源性最高的16S rDNA序列，利用MEGA 5.0進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，如圖3所示。一般來(lái)說(shuō)16S rDNA 序列相似性高于99%，屬于同一種，相似性低于98%可以認(rèn)為屬于不同的種，相似性低于93%～95%，可以認(rèn)為屬于不同的屬[11-12]。從NCBI中下載的所有序列相似度均在97%以上，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示了菌株之間的親緣關(guān)系，結(jié)合之前的形態(tài)學(xué)鑒定確定了19株細(xì)菌在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位，結(jié)果表明19株細(xì)菌屬于7個(gè)屬，包括短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、Cobetia屬、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、普羅威登斯菌屬(Providenciasp.)和海洋螺菌屬(Oceanospirillaceae sp.)。

圖2 部分細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Partial bacterial 16S rDNA amplification productM: DNA Marker G。泳道1～10為不同菌株16Sr DNA擴(kuò)增產(chǎn)物M: DNA Marker G. Lanes 1-10 is16Sr DNA amplification products of different strains

圖3 19株細(xì)菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA from 19 typical strains

3 討論與結(jié)論

海洋是生命資源的寶庫(kù)，海洋微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。海洋微生物不僅參與物質(zhì)能量循環(huán)[13]，還能產(chǎn)生新型的活性物質(zhì)，為現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)提供重要的藥物資源和酶資源[14]。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖，海洋微生物對(duì)氣候變化的影響研究對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)具有一定的指導(dǎo)意義[15]。因此，海洋微生物多樣的研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)[16]。汪琳 等[17]對(duì)九孔鮑鮑苗脫板期養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究，分離得到3大類群9個(gè)屬的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌與分離自發(fā)病的水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的細(xì)菌最相似，表明這些細(xì)菌與水產(chǎn)病害存在一定的關(guān)系。其中分離得到的假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)和Cobetia屬與本文分離得到的細(xì)菌同屬，提示本研究分離到的細(xì)菌可能與仿刺參水產(chǎn)養(yǎng)殖災(zāi)害有關(guān)，這些細(xì)菌是否是引起仿刺參發(fā)病的致病菌以及發(fā)病的具體機(jī)制還需要深入的后續(xù)研究加以證實(shí)。

海洋微生物的開(kāi)發(fā)利用，關(guān)鍵是從海洋中分離得到產(chǎn)生特殊物質(zhì)的菌株，本文從仿刺參采苗板上得到的菌株做了初步的分離鑒定，共鑒定出7個(gè)屬，查閱文獻(xiàn)得知，假交替單胞菌屬能夠產(chǎn)生胞外多糖、胞外酶、毒素等活性物質(zhì)[18]，其中胞外多糖能夠幫助細(xì)菌附著在寄主表面增強(qiáng)其生存機(jī)會(huì)[19]，細(xì)菌分泌高濃度的胞外多糖也可保護(hù)自身免受冰晶的傷害[20]。LI et al[21]對(duì)Pseudoalteromonassp. SM9913所產(chǎn)胞外多糖的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有絮凝和吸附作用。本研究對(duì)分離得到的假交替單胞菌進(jìn)行了菌株發(fā)酵試驗(yàn)，利用苯酚硫酸法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)生胞外多糖的潛力，下一步將進(jìn)行胞外多糖的功能性試驗(yàn)，進(jìn)一步挖掘海洋微生物的潛力，為海洋微生物的資源開(kāi)發(fā)利用做出貢獻(xiàn)。

[1] SUN Hai-hong, MAO Wen-jun, QIAN Ye-miao, et al. Advances on the characteristics and bioactivities of exopolysaccharides from marine microorganism[J].Marine Sciences,2011,35(11):134-138.

孫海紅,毛文君,錢葉苗,等.海洋微生物活性胞外多糖的研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué),2011,35(11):134-138.

[2] JIANG Jian, YANG Bao-ling, YUAN Qi, et al. Isolation and identification of marine bacteria with antimicrobial activity[J].Biotechnology,2004,14(6):28-30.

姜健,楊寶靈,元起,等.具有抑菌活性的海洋細(xì)菌的分離與鑒定[J].生物技術(shù),2004,14(6):28-30.

[3] BERNAN V S, GREENSTEIN M, MAIESE W M. Marine microrgnisms as a source of new natural products[J]. Applied Microbial,1997,43(4):57-90.

[4] MATSUDA M, SHIGETA S, OKUTANI K. Antiviral activities of marine pseudomonas polysaccharides and their oversulfated derivative[J].Marine Biotechnology,1999,1(1):68-73.

[5] SUN Cheng, WANG Jian-wen, LEI Fang, et al. Free radical scavenging and antioxidant activities of EPS2,an exopolysaccharide produced by a marinefilamentousfungusKeissleriellasp. YS 4108[J]. Life Science,2004,75(9):1 063-1 073.

[6] LI Jiang, CHEN Kao-shan, LI Ying-yu, et al. Phylogenetic analysis of antarctic bacteriumPseudoalteromonassp. S-15-13 and the effect of its extracellular polysaccharide on proliferation of murine lymphocytes[J].Chinese Journal of Marine Drugs,2006,25(1):1-5.

李江,陳靠山,李瑩玉,等.南極細(xì)菌Pseudoalteromonassp.S-15-13的分子鑒定及其胞外多糖促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用[J].中國(guó)海洋藥物雜志,2006,25(1):1-5.

[7] DONG Xiu-zhu, CAI Miao-ying. Common bacterial system identification manual[M].Beijing:Science Press,2001:365-375.

東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:365-375.

[8] ZHOU De-qing.Microbiology experiment tutorial[M].2nd ed. Beijing: Higher Education Press,2006:367-385.

周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].第2版.北京:高等教育出版社,2006:367-385.

[9] THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, et al. The Clustal-X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research,1997,25(24):4 876-4 882.

[10] SAITOU N, NEI M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution,1987,4(4):406-425.

[11] DEVEREUX R, HE S H, DOYLE C L, et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species: Phylogenetic definition of a family[J].J Bacteriol,1990,172(7):3 609-3 619.

[12] FRY N K, WARWICK S, SAUNDERS N A, et al. The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae[J].J Gen Microbiol,1991,137(5):1 215-1 222.

[13] DAS S, MANGWANI N. Ocean acidification and marine microorganisms: Responses and consequences[J].Oceanologia,2015,57(4):349-361.

[14] LI Wei, ZHENG Wei, ZHENG Tian-ling. Advances in research of marine microbial diversity and molecular ecology[J].Microbiology China,2013,40(4):655-668.

李煒,鄭偉,鄭天凌.海洋微生物多樣性及其分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(4):655-668.

[15] AZAM F, WORDEN A Z. Microbes, molecules, and marine ecosystems[J].Science,2004,303(5664):1 622-1 624.

[16] XUE Chao-bo, WANG Guo-liang, JIN Shan, et al.Advances in marine microbial diversity research[J].Advances in Marine Science,2004,22(3):377-384.

薛超波,王國(guó)良,金珊,等.海洋微生物多樣性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)進(jìn)展,2004,22(3):377-384.

[17] WANG Lin, YANG Qiu-ming, HAO Jian-dong, et al.Isolation and identification of bacteria from the environment of mass mortality during Haliotisdiversicolorsupertextalarvae stage[J].Journal of Oceanography in Taiwan Strait,2009,28(2):210-216.

汪琳,楊秋明,郝劍東,等.九孔鮑鮑苗脫板期養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌分離及分子鑒定[J].臺(tái)灣海峽,2009,28(2):210-216.

[18] XI Yu, ZHU Da-heng, LIU Hong-tao, et al.Advances onPseudoalteromonasspecies and their extracellular bioactive compounds[J].Microbiology China,2005,32(3):108-112.

席宇,朱大恒,劉洪濤,等.假交替單胞菌及其胞外生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2005,32(3):108-112.

[19] POLI A, ANZELMO G, NICOLAUS B. Bacterial exopolysaccharides from extreme marine habitats: production, characterization and biological activities[J]. Mar Drugs,2010,8(6):1 779-1 802.

[20] NICHOLS C M, lARDIRE S G, BOWMAN J P, et al. Chemical characterization of exopolysaccharides from Antarctic marine bacteria[J]. Microb Ecol,2005,49(4):578-589.

[21] LI W W, ZHOU W Z, ZHANG Y Z, et al. Flocculation behavior and mechanism of an exopolysaccharide from the deep-sea psychrophilic bacteriumPseudoalteromonassp. SM9913[J]. Bioresour Technol,2008,99(15):6 893-6 899.

IsolationandidentificationofbacteriainApostichopusjaponicusseedlinginaquacultureenvironments

LU Xiao-ping, XU Yan-rui, FAN Qiu-ping, WANG Chun-lei, HAO Lu-jiang*

(QiluUniversityofTechnology,ShandongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialEngineering,Ji’nan250353,China)

To understand the diversity of bacteria during the seedling stage ofApostichopusjaponcicus, bacteria were isolated and identified. On the basis of the morphology, physiology and biochemistry, 16S rDNA sequence homology analysis, the 19 marine bacteria were identified to beBrevibacillussp.,Pseudoalteromonassp.,Cobetiasp.,Enterobactersp.,Bacillussp.,Providenciasp., andOceanospirillaceaesp.. Isolation and screening of bacteria from the marine environment is of great significance to the development and utilization of marine resources. In addition, the identification of the bacterial species in the period of seedling stage ofApostichopusjaponcicusis helpful to the prevention and treatment of disease, and it has a certain guiding significance for the aquaculture ofApostichopusjaponcicus.

Apostichopusjaponcicus; bacteria; isolation and identification

盧曉平，許艷蕊，范秋蘋，等.仿刺參采苗板上細(xì)菌的分離與鑒定[J].海洋學(xué)研究,2017,35(3):85-90,

10.3969/j.issn.1001-909X.2017.03.010.

LU Xiao-ping，XU Yan-rui，F(xiàn)AN Qiu-ping, et al. Isolation and identification of bacteria inApostichopusjaponicusseedling in aquaculture environments[J].Journal of Marine Sciences,2017,35(3):85-90, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2017.03.010.

2016-09-19

2017-02-26

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(ZR2012CM019)

盧曉平(1992-)，男，山東膠州市人，主要從事海洋細(xì)菌活性物質(zhì)篩選方面的研究。E-mail:15288863082@163.com

*

郝魯江(1972-)，男，副教授，主要從事海洋細(xì)菌活性物質(zhì)的篩選、微生物酶資源的開(kāi)發(fā)等研究。E-mail:lujiang_hao@163.com

Q93-331

A

1001-909X(2017)03-0085-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2017.03.010