HPLC同時(shí)測定歸芍潤腸丸中4種成分的含量

鞏向丹，張瑗惠

HPLC同時(shí)測定歸芍潤腸丸中4種成分的含量

鞏向丹，張瑗惠

歸芍潤腸丸；芍藥苷；橙皮苷；柚皮苷；新橙皮苷；含量測定；高效液相色譜法

歸芍潤腸丸是由當(dāng)歸、白芍、陳皮、麩炒枳殼等12味藥組成的中藥制劑，具有養(yǎng)血生津、潤燥通便的功效，用于血虛津少，咽干腸燥，脘腹悶脹，大便秘結(jié)等癥。方中白芍與陳皮、枳殼配伍發(fā)揮養(yǎng)血、理氣、行滯的作用，白芍中的主要有效成分芍藥苷具有保肝［1］、促進(jìn)造血細(xì)胞增殖［2］等藥理作用，橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷是陳皮、枳殼中的主要成分［3，4］，對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功能具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用［5］，通過控制這4種成分的含量可確保該制劑的療效。芍藥苷常用的含量測定方法為高效液相色譜法［6］，陳皮、枳殼所含黃酮類成分的含量測定有紫外分光光度法［7］、薄層掃描法［8］、近紅外透射光譜法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］等，但使用最多的是高效液相色譜法［11］，故筆者采用高效液相色譜法同時(shí)測定歸芍潤腸丸中芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀，泵為LC-20AT、檢測器為SPD-20A UV/VIS，并配備自動進(jìn)樣器、柱溫箱、脫氣機(jī) （日本島津公司）；METTLER TOLEDO MS205DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KS-300E超聲波清洗機(jī)（寧波科生儀器廠）。

1.2 試藥 芍藥苷對照品 （批號：110736-201438，含量以96.4%計(jì)）、橙皮苷對照品 （批號：110721-201115，含量以95.3%計(jì)）、柚皮苷對照品 （批號：110722-201111，含量以93.2%計(jì)）及新橙皮苷對照品（批號：111857-201102，含量以99.6%計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院；歸芍潤腸丸3批，批號分別為 160308、160422、160522，由淄博市中醫(yī)院提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱為島津Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm；5 μm）；流動相 A為乙腈，B為0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0~10 min 15%A，10~30 min 20%A，30~45 min 80%A；檢測波長為 230 nm；流速為 1.0 ml/min；柱溫40℃。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別取芍藥苷對照品、橙皮苷對照品、柚皮苷對照品和新橙皮苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含芍藥苷0.247 2 mg、橙皮苷0.148 8 mg、柚皮苷0.159 6 mg和新橙皮苷0.246 2 mg的溶液，作為對照品儲備溶液；分別精密量取對照品儲備溶液各1 ml，置同一5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1 ml含芍藥苷、橙皮苷、 柚皮苷、 新橙皮苷分別為 49.44 μg、29.76 μg、31.92 μg、49.24 μg）。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取藥2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流 1.5 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 根據(jù)處方組成，取處方中除白芍、陳皮和麩炒枳殼外的其他藥味，粉碎成細(xì)粉，按歸芍潤腸丸制備方法制備缺白芍、陳皮、麩炒枳殼的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜圖中呈現(xiàn)與芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷對照品色譜峰保留時(shí)間相一致的色譜峰，陰性對照品色譜圖中未呈現(xiàn)與相應(yīng)對照品保留時(shí)間相一致的色譜峰，表明該測定具有較好的專屬性。結(jié)果見圖1。

圖1 歸芍潤腸丸HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液，分別精密吸取 1、5、10、15、20、25 μl，注入高效液相色譜儀，按規(guī)定色譜條件測定，記錄各化合物的峰面積。以對照品進(jìn)樣量X（μg）為自變量、峰面積Y為因變量進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷回歸方程為Y=1392X-10630，r=0.999 5；橙皮苷回歸方程為 Y=3874X+4916，r=1；柚皮苷回歸方程為Y=2806X+523，r=1；新橙皮苷回歸方程為Y=3083X+5605，r=1。表明芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷分別在0.049 4~1.236 0 μg 、0.029 8~0.744 0 μg、0.031 9~0.798 0 μg 和 0.049 2~1.231 0 μg 具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按規(guī)定色譜條件測定，記錄色譜圖及各化合物的峰面積。計(jì)算芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷色譜峰面積的RSD，分別為0.86%、0.14%、0.28%和0.11%。結(jié)果表明儀器具有較好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為160308的樣品，按規(guī)定方法制備供試品溶液， 分別在 0、3、6、9、12、16、24、36 h分別精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及各化合物的峰面積，計(jì)算芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD，分別為1.32%、1.04%、0.89%和0.92%。結(jié)果表明，36 h內(nèi)供試品溶液保持穩(wěn)定，可用于各化合物含量的測定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為160308的樣品，研細(xì)，取藥2 g，精密稱定，共6份，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及各化合物的峰面積，計(jì)算芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，分別為 0.823 4 mg/g、0.972 3 mg/g、0.820 3 mg/g 和0.955 7 mg/g，RSD 分別為 0.80%、1.16%、1.07%和1.05%。測定結(jié)果表明，采用本法對4種化合物進(jìn)行含量測定的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取批號為160308的樣品，其中芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量分別為0.823 4 mg/g、0.972 3 mg/g、0.820 3 mg/g 和 0.955 7 mg/g，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，共取6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.2.1項(xiàng)下的芍藥苷對照品儲備溶液3 ml、橙皮苷對照品儲備溶液5 ml、柚皮苷對照品儲備溶液5 ml、新橙皮苷對照品儲備溶液3 ml及50%甲醇25 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及各化合物的峰面積，計(jì)算芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的回收率，平均回收率分別為 98.88%、98.78%、98.60%和 100.13%，RSD分別為1.32%、1.61%、1.71%和1.64%。

2.9 樣品測定 取歸芍潤腸丸3批，按規(guī)定的方法和條件測定并計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表1。

表1 歸芍潤腸丸3批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

測定波長的選擇主要參考了 《中國藥典》2015年版一部［12］，因橙皮苷、柚皮苷及新橙皮苷均為黃酮類成分，其測定波長常選擇283 nm，芍藥苷的測定波長為230nm，試驗(yàn)中分別選擇283 nm和230 nm作為測定波長進(jìn)行測定，結(jié)果采用230 nm作為測定波長時(shí)，4種成分的色譜峰面積顯著增大，故選擇230 nm作為測定波長。在供試品溶液的制備中，對超聲提取和回流提取兩種提取方法進(jìn)行了考察，結(jié)果表明提取方法對各成分的提取效率影響均較大，回流提取效果更好；對提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明回流提取1.5 h各成分均能提取完全。

歸芍潤腸丸為大蜜丸，處方中各藥味均以粉末入藥，依據(jù)《中國藥典》2015年版一部各品種項(xiàng)下的含量限度，根據(jù)白芍、陳皮及麩炒枳殼在處方中的用量，按各成分的轉(zhuǎn)移率為100%計(jì)算，歸芍潤腸丸每1 g含芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷及新橙皮苷應(yīng)分別為 0.558 4 mg、0.406 0 mg、0.698 0 mg 及 0.523 5 mg，結(jié)合樣品含量測定結(jié)果及原料藥、樣品可能存在的變化，歸芍潤腸丸4種有效成分含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值范圍可定為每1 g含芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷及新橙皮苷分 別不得少 于 0.60 mg、0.45 mg、0.70 mg 及0.55 mg。

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R284.1

B

10.14172/j.issn1671-4008.2017.09.022

255086山東省淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院（鞏向丹）；255000山東省淄博市張店區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局（張瑗惠）

［2017－03－17 收稿，2017－04－15 修回］ ［本文編輯：王軍紅］