茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)研究進(jìn)展

項(xiàng)麗慧，林清霞，余文權(quán)，陳 林*，王振康

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福建 福州 350002)

茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)研究進(jìn)展

項(xiàng)麗慧1，林清霞1，余文權(quán)2*，陳 林1*，王振康1

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福建 福州 350002)

糖苷水解產(chǎn)生的揮發(fā)性成分是茶葉香氣的重要組成之一。本文系統(tǒng)總結(jié)了茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)的化學(xué)組成、代謝途徑、檢測方法及影響因素。

茶葉；鍵合態(tài)香氣物質(zhì)；糖苷酶；糖基轉(zhuǎn)移酶

香氣是茶葉感官品質(zhì)的重要評價(jià)指標(biāo)之一。糖苷類香氣前體物質(zhì)水解后通常表現(xiàn)出不同的香型風(fēng)味，是茶葉主要的香氣前體。糖苷類香氣前體物質(zhì)，無味、無揮發(fā)性，存在于許多植物中，如玫瑰花[1]、葡萄[2]、煙草[3]、茶葉[4]、梨[5]等。竹尾忠一[4]首次發(fā)現(xiàn)茶鮮葉中芳樟醇、香葉醇可能以葡萄糖苷的形式存在。隨后，國內(nèi)外學(xué)者對茶葉中不同的糖苷類香氣前體物質(zhì)進(jìn)行了廣泛而深入的研究，陸續(xù)分離鑒定出香葉基葡萄糖苷[6]、苯甲基葡萄糖苷[6]、香葉基櫻草糖苷[7]、芳樟基櫻草糖苷[7]等20余種糖苷類香氣前體物質(zhì)[8-15]。本文系統(tǒng)總結(jié)了茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)的化學(xué)組成、代謝途徑、檢測方法及影響因素，以期為闡明茶葉香氣物質(zhì)的形成與轉(zhuǎn)化機(jī)制、茶樹高香優(yōu)質(zhì)品種選育和茶葉增香加工技術(shù)調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 茶葉中的糖苷類香氣前體物質(zhì)

糖苷在植物中分布極廣，是糖和糖的衍生物等與另一非糖物質(zhì)(苷元)失去水分子，通過苷鍵縮合而成的化合物?；衔锱c糖結(jié)合成苷以后，水溶性增大，揮發(fā)性降低，穩(wěn)定性增強(qiáng)，生物活性或毒性亦會(huì)發(fā)生變化[16]。糖苷類香氣前體物質(zhì)指的是苷元為揮發(fā)性物質(zhì)或揮發(fā)性物質(zhì)前體的糖苷。

根據(jù)苷元的類型，茶葉中的糖苷類香氣前體物質(zhì)可分為以下幾類：脂肪族醇類、芳香族醇類、萜烯醇類、芳香族酯類等。第一、脂肪族醇類在茶鮮葉中含量較高，其沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，主要為順-3-乙烯醇，高濃度的順-3-乙烯醇呈現(xiàn)強(qiáng)烈的青草氣，稀釋后有清香的感覺；第二、芳香族醇類，沸點(diǎn)較高，其香氣特征是類似花香或果香，包括苯甲醇、苯乙醇等；第三、萜烯醇類物質(zhì)，沸點(diǎn)較高，此類化合物具有花香或果實(shí)香，對茶香形成有重要作用，包括香葉醇、芳樟醇及其氧化物等；第四、芳香族酯類主要為水楊酸甲酯，具有濃的冬青油香，不僅是茶葉的主要呈香物質(zhì)之一，還可作為誘導(dǎo)多種防御反應(yīng)的信號物質(zhì)[17,18]。張正竹等[19]研究表明在茶鮮葉中，順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物(Ⅰ、Ⅱ)、香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇和2-苯乙醇是糖苷類香氣前體物質(zhì)的主要苷元，且不同季節(jié)的茶樹鮮葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)在苷元組成上基本一致。大部分糖苷類香氣前體物質(zhì)水解后，可直接釋放揮發(fā)性苷元，但并不是所有的糖苷苷元都是揮發(fā)性物質(zhì)，如β-D-苯乙腈葡萄糖苷預(yù)先被β-葡萄糖苷酶水解成為中間產(chǎn)物苯乙腈，再被苯乙腈裂解酶[20]酶解為苯甲醛(苦杏仁香氣)。

表1 茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)的化學(xué)組成

糖苷類香氣物質(zhì)中直接與苷元結(jié)合的糖基是β-D-葡萄糖。該葡萄糖還可連接一個(gè)或多個(gè)其他糖基，如木糖、芹菜糖、阿拉伯糖等。茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)的糖基種類主要包括β-D-葡萄糖苷、β-櫻草糖苷、β-芹菜糖基葡萄糖苷、β-巢菜糖苷(表1)。有文獻(xiàn)[31]提出除了以上4種糖基以外，還存在第5種糖基——野黑櫻苷(β-D-苯乙腈葡萄糖苷)[8]，其糖基為β-D-葡萄糖。

2 茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)的代謝途徑

2.1 糖苷類香氣前體物質(zhì)的生物合成

糖苷類香氣前體物質(zhì)的生物合成：在糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.x.y)催化作用下，活性糖供體與苷元相結(jié)合形成糖苷化合物[32]。糖基轉(zhuǎn)移酶分子質(zhì)量大約40～60 KD，等電點(diǎn)為4.1～6.2，對糖基受體Km為0.4～3600 μmol·L-1，最適pH值為5.9～9.0[33]。尿苷二磷酸-葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸均可作用糖基轉(zhuǎn)移酶的活性糖供體[32]，與活性糖供體相結(jié)合的受體基團(tuán)包含-COOH，-NH2，-SH，-OH，C-C等[34]。茶葉中的糖苷類香氣前體物質(zhì)與活性糖供體相結(jié)合的受體基團(tuán)主要為-OH[35]。

近年有關(guān)植物中糖苷化合物的酶促合成分子機(jī)理研究越來越多。擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5 能以多種萜醇類化合物作為糖基受體[36]，催化合成多種萜醇類糖苷化合物。茶葉中的2種糖基轉(zhuǎn)移酶CsGT1和CsGT2可以分別通過葡萄糖基化作用和木糖基化作用將游離的揮發(fā)性化合物轉(zhuǎn)化為櫻草糖苷鍵合態(tài)復(fù)合物貯存于茶葉中[37]。

2.2 糖苷類香氣前體物質(zhì)的釋放途徑

在茶葉生長及加工過程中，因蟲食、病毒侵染、失水或機(jī)械損傷等，導(dǎo)致茶葉細(xì)胞區(qū)室化功能破壞，使得茶葉中的糖苷鍵合態(tài)物質(zhì)，經(jīng)內(nèi)源及外源糖苷酶分解釋放揮發(fā)性物質(zhì)[38]。茶葉中參與糖苷類香氣前體物質(zhì)水解反應(yīng)的糖苷酶主要是β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶。

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是糖苷水解酶家族中的一大類酶，其主要功能是水解結(jié)合于底物末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，生成β-D-葡萄糖，并釋放出相應(yīng)苷元[39]。該酶存在于幾乎所有的生物體內(nèi)，是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶。目前，GENBANK中登錄的茶樹β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列有6個(gè)，登錄號分別為HQ679938.2、AM285295.2、KF933435.1、AF537127.1、KF981725.1、KT165373.1。李遠(yuǎn)華[40]認(rèn)為茶葉中β-葡萄糖苷酶主要分布在細(xì)胞質(zhì)的微粒體或溶酶體中，其分布與葉綠體有關(guān)，柵欄組織是合成β-葡萄糖苷酶的重要場所。Zhou Y[41]對茶樹β-葡萄糖苷酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明CsGH1BG1，CsGH3BG1定位于細(xì)胞質(zhì)和液泡中，CsGH5BG1定位于細(xì)胞壁，推測CsGH1BG1，CsGH3BG1可能負(fù)責(zé)茶葉加工過程中糖苷類香氣前體物質(zhì)的水解。周漢琛等[42-44]詳細(xì)介紹了β-葡萄糖苷酶的生物信息學(xué)及基因表達(dá)，及其在茶葉增香以及抗病蟲害方面的作用，表明β-葡萄糖苷酶在茶樹抵御逆境反應(yīng)中具有積極響應(yīng)作用，在茶葉加工過程中，β-葡萄糖苷酶可以促進(jìn)糖苷類香氣前體物質(zhì)的水解并釋放出揮發(fā)性苷元，為茶葉香氣成分的積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

β-櫻草糖苷酶(EC 3.2.1.149)是催化糖苷類香氣前體物質(zhì)水解的另一主要酶類。它通過水解萜醇類糖苷香氣物質(zhì)，使茶葉呈現(xiàn)出天然花香，并對外來入侵起到一定的防御作用[45]。Bridel M[46]首次在報(bào)春花上發(fā)現(xiàn)了β-櫻草糖苷酶具有水解β-櫻草糖苷的生物活性。β-櫻草糖苷酶基因已被克隆出來[47]，GENEBANK登錄號為AB088027.1。Gui等[48]研究指出烏龍茶品種金萱在做青過程中，多次搖青產(chǎn)生的機(jī)械損傷雖然使得在制葉萎縮扭曲而細(xì)胞壁卻仍然保持完整，細(xì)胞壁中糖苷水解酶與糖苷態(tài)香氣物質(zhì)未發(fā)生接觸反應(yīng)，糖苷態(tài)香氣物質(zhì)并未出現(xiàn)下降變化，β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶的活性及其基因表達(dá)水平并未出現(xiàn)增強(qiáng)，甚至呈現(xiàn)了下降的變化趨勢，該研究對糖苷酶是否直接促進(jìn)烏龍茶花果香氣形成提出質(zhì)疑。

3 茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)的檢測方法

茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)的提取方法，主要包括乙醇浸提法[49]、甲醇浸提法[50]、熱水浸提法[7]，其分析檢測流程見圖1。張正竹[51]用沸水和沸乙醇提取茶樹鮮葉中的糖苷類香氣前體物質(zhì)進(jìn)行了對比研究，結(jié)果表明沸水提取的得率較低，僅為沸乙醇的68.85%。由于茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)標(biāo)品不易獲得，需對其進(jìn)行分離，常采用酶或酸水解，然后對水解后的糖苷苷元進(jìn)行GC-MS分析。酸水解方法在葡萄[52]、橙子[53]、梨子[54]、柑橘[55]等水果的糖苷研究應(yīng)用較多。萜烯醇類物質(zhì)在酸性條件下可發(fā)生分子重排現(xiàn)象[56]，因此局限了酸水解法在茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)分析中的應(yīng)用。與酸水解方法相比，酶水解反應(yīng)較酸水解法更溫和，水解釋放的香氣物質(zhì)更接近茶葉的香氣。通常采用從茶樹鮮葉中提取的酶進(jìn)行糖苷類香氣前體物質(zhì)的釋放。

除了上述分析方法以外，還可直接對糖苷類香氣前體物質(zhì)進(jìn)行三氟乙酰衍生化分析。這種方法可更準(zhǔn)確判斷糖苷的結(jié)構(gòu)，特別是糖基的結(jié)構(gòu)。Wang等[23]通過三氟乙?；苌ǚ治隽瞬枞~中26種糖苷類香氣前體物質(zhì)，這些糖苷主要是櫻草糖苷、葡萄糖苷和巢菜糖苷，苷元部分主要是脂肪醇類、萜烯醇類和芳香醇類等。Gu等[57]優(yōu)化了三氟乙酰衍生條件，發(fā)現(xiàn)在 60℃下反應(yīng)50 min效果最好，同時(shí)還采用GC結(jié)合電子捕獲檢測器(electron capture detector，ECD)對糖苷衍生后的氟化物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在0.05～200 mg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。此外，崔繼來[50]以苯甲醇、2-苯乙醇、順-3-己烯醇、芳樟醇和香葉醇的櫻草糖苷和葡萄糖苷作為標(biāo)品，建立了LC-MS的定量定性分析方法。戴偉東等[58]基于LC-MS和Q-TOF/MS的非靶向修飾特異性代謝組學(xué)方法，鑒定了茶葉中40種糖苷類化合物。

圖1 茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)檢測方法Fig. 1 Analytical methods for determination of glycoside-bound aroma precursors in tea

4 茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)的影響因素

4.1 生物因素

在茶樹生長發(fā)育過程，蟲食、病毒侵染等生物因素會(huì)影響糖苷類香氣前體物質(zhì)的水解釋放。Cho[59]研究認(rèn)為，東方美人茶(假眼小綠葉蟬聚集侵害茶樹嫩梢，受侵食后的茶芽被采摘下來，以傳統(tǒng)加工工藝生產(chǎn)出的烏龍茶)產(chǎn)生高香的原因在于葉片被小綠葉蟬取食而導(dǎo)致芳樟醇及其氧化物等化合物升高，這些物質(zhì)來源可能是從頭合成和糖苷類香氣前體物質(zhì)的水解。戚麗等[60]研究表明茶葉游離態(tài)香氣組分和糖苷類香氣前體物質(zhì)對茶云紋葉枯病致病菌均具有顯著的抑制作用。由此提出，糖苷類香氣前體物質(zhì)合成并貯存在茶樹葉片中，當(dāng)遇到茶云紋葉枯病等致病菌侵染時(shí)，在內(nèi)源糖苷酶和外源病原菌水解酶的作用下，水解并釋放出揮發(fā)性苷元，從而表現(xiàn)出抗病性。

4.2 非生物因素

茶鮮葉從茶樹母體上采摘下來后，至高溫殺青以前仍然是活體，在此過程中經(jīng)歷著光輻射、組織損傷、失水等非生物脅迫，不僅促進(jìn)了茶葉水分散失、葉片萎軟、青氣散發(fā)，并且引起了在制品糖苷類香氣前體物質(zhì)的酶促水解，從而提高了茶葉香氣品質(zhì)。Wang D等[61]發(fā)現(xiàn)在紅茶揉捻工序中櫻草糖苷明顯減少，經(jīng)發(fā)酵工序后，幾乎完全消失，而葡萄糖苷含量保持不變，說明櫻草糖苷是紅茶香氣主要前體物質(zhì)。然而在烏龍茶曬青過程中，大多數(shù)糖苷含量上升，成茶的糖苷達(dá)到最高水平[62]，這與紅茶加工中糖苷的變化趨勢不同。崔繼來[50]研究了糖苷類香氣前體物質(zhì)對紅茶和烏龍茶香氣形成的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明櫻草糖苷是紅茶香氣形成的前體物質(zhì)，葡萄糖苷對紅茶香氣形成沒有貢獻(xiàn)，這與Wang D研究結(jié)果一致；2種糖苷在烏龍茶加工過程中沒有發(fā)生水解，對烏龍茶的香氣沒有貢獻(xiàn)。Gui等[48]比較了烏龍茶殺青前各工序糖苷類香氣前體物質(zhì)的變化，結(jié)果顯示糖苷含量沒有減少，以順-3-乙烯醇為苷元的糖苷在搖青階段有所增加。謝運(yùn)海等[49]測定了漳平水仙茶加工過程中糖苷類香氣前體物質(zhì)的含量，結(jié)果表明晾青葉糖苷類香氣前體物質(zhì)較鮮葉有顯著增加，秋茶的糖苷類香氣前體物質(zhì)含量顯著高于春茶。趙飛[63]研究表明不同工藝加工制得的成品茶中糖苷前體含量差異顯著，其中烘青綠茶和炒青綠茶中的糖苷含量最高，烏龍茶次之，PCD茶(即不經(jīng)萎凋直接殺青、烘干)最低，推斷萎凋和搖青可增加糖苷類香氣前體物質(zhì)的含量，且在加工過程中，存在糖苷類香氣前體物質(zhì)的合成反應(yīng)和水解反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡。魏志文等[64]研究發(fā)現(xiàn)在綠茶加工過程中，茶鮮葉中的糖苷類香氣前體物質(zhì)只有20.34%的苷元得以釋放，而紅茶加工過程中，95.60%的苷元水解釋放出游離態(tài)香氣成分。

5 展望

茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)是重要的香氣前體，與茶葉香氣品質(zhì)和抗性密切相關(guān)。國內(nèi)外研究表明，茶葉中存在的糖苷類香氣前體物質(zhì)，通過酶促水解反應(yīng)，可釋放潛在的香氣物質(zhì)，但仍然存在如下問題有待研究：第一、高香優(yōu)質(zhì)品種選育與鑒定方面，已有報(bào)道[65]表明適制烏龍茶品種的糖苷類香氣前體物質(zhì)高于適制綠茶品種，初步推斷其可作為一種品種適制性的新指標(biāo)，但如何將指標(biāo)應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐，利用糖苷類香氣前體物質(zhì)代謝過程的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行高香茶樹品種的精準(zhǔn)篩選值得探究；第二、農(nóng)藝栽培過程的代謝調(diào)控方面，關(guān)于茶葉加工過程糖苷類香氣前體物質(zhì)的研究已被大量報(bào)道，但關(guān)于遮陰、覆蓋、施用有機(jī)肥等農(nóng)藝栽培措施對糖苷類香氣前體物質(zhì)代謝調(diào)控尚未見報(bào)道；第三、茶葉加工品質(zhì)的質(zhì)量控制方面，國內(nèi)外學(xué)者對紅茶加工過程糖苷類前體的變化規(guī)律研究結(jié)果基本一致，研究結(jié)果均表明糖苷類物質(zhì)在紅茶加工過程中得以水解，特別是櫻草糖苷，而對綠茶、烏龍茶加工過程糖苷對香氣形成的貢獻(xiàn)尚存在異議，其他茶類加工過程糖苷變化趨勢研究尚未見報(bào)道；第四、茶葉增香途徑方面，Zhang等[66]發(fā)現(xiàn)，漆酶和α-半乳糖苷酶能顯著提高鐵觀音夏暑茶的感官品質(zhì)，可考慮從茶葉加工過程中通過添加β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶，改善茶葉品質(zhì)，提高茶葉香氣。

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ResearchAdvancesonGlycoside-boundAromaPrecurosrsinTea

XIANG Li-hui1, LIN Qing-xia1, YU Wen-quan2*, CHEN Lin1*, WANG Zhen-kang1

(1.TeaResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fu’an,Fujian355015,China;2.FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350002,China)

Enzymatic digestion of glycoside-bound aroma precursors releases volatile components, which contribute significantly to the aromatic quality of tea. The structures, metabolic pathways and analytical methodologies of the glycoside-bound precursors, as well as factors affecting the aroma formation in tea are summarized.

tea; bound aroma precursors; glycosidase; glycosyltransferase

S571.1

A

2096-0220(2017)03-0132-06

2017-07-25初稿；2017-08-25修改稿

福建省科技重大專項(xiàng)專題(2017NZ0002-1)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01121)；福建省屬公益類科研院所科研基本專項(xiàng)(2016R1011-1)。

項(xiàng)麗慧(1991-)，女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶葉生物化學(xué)及茶樹分子生物學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xlh1991@foxmail.com

*通信作者：余文權(quán)(1972-)，男，博士，教授級高級農(nóng)藝師，主要從事茶學(xué)研究。E-mail:ywq333@163.com

陳林(1975-)，男，博士，副研究員，主要從事茶葉加工、茶葉生物化學(xué)及綜合利用研究。E-mail:chenlin_xy@163.com