利用FACS定量研究脂肪組織中肥大細(xì)胞的數(shù)目

張 磊, 劉 健

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

利用FACS定量研究脂肪組織中肥大細(xì)胞的數(shù)目

張 磊, 劉 健

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

肥胖會(huì)導(dǎo)致脂肪組織中各種免疫細(xì)胞數(shù)量的失衡,肥大細(xì)胞(MCs)在肥胖個(gè)體的脂肪組織中數(shù)量明顯增多,而MCs穩(wěn)定劑木犀草素(LU)可以降低高脂飲食小鼠附睪脂肪組織(EAT)中MCs的數(shù)量,并改善肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展。此前的研究是利用甲苯胺藍(lán)染色半定量EAT中MCs數(shù)量的變化。甲苯胺藍(lán)染色的特異性和統(tǒng)計(jì)精密度都存在一定的欠缺,為了更精確地研究在肥胖過(guò)程中脂肪組織中MCs數(shù)量的變化,文章建立了高精密度的流式細(xì)胞熒光分選(fluorescence activated cell sorting,FACS)技術(shù),并研究了低脂、高脂和高脂補(bǔ)充LU組小鼠EAT中MCs變化情況。FACS分析定量結(jié)果顯示,MCs在高脂飲食誘導(dǎo)下明顯升高,而飲食補(bǔ)充LU可以明顯降低MCs的數(shù)目。另外,EAT中MC蛋白酶的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)結(jié)果也支持了FACS分析的結(jié)果。因此,利用FACS分析脂肪組織中MCs數(shù)目的精確變化,為進(jìn)一步研究MCs在肥胖中的作用機(jī)制提供技術(shù)支持。

木犀草素(LU);肥大細(xì)胞(MCs);肥胖;流式細(xì)胞術(shù);附睪脂肪組織

肥胖是一種慢性低度的炎性疾病。脂肪組織尤其是內(nèi)臟脂肪組織中各種免疫細(xì)胞的失衡,分泌大量的促炎性細(xì)胞因子,引發(fā)一系列相關(guān)的代謝綜合癥[1-2]。肥大細(xì)胞(MCs)在過(guò)敏和炎性疾病中起重要的角色,廣泛分布于皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周?chē)?受到過(guò)敏原的刺激后會(huì)快速發(fā)生脫顆粒釋放介質(zhì)介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)。MCs還參與了肥胖及其相關(guān)的代謝疾病的調(diào)控。MCs在肥胖個(gè)體的脂肪組織中大量聚集[3-5]。藥物穩(wěn)定或基因缺失MCs可以有效地抵抗小鼠高脂飲食誘導(dǎo)肥胖及其相關(guān)的胰島素抵抗的發(fā)生[4]。木犀草素(LU)是一種高效的天然黃酮類(lèi)MCs穩(wěn)定劑[6],廣泛分布于各種食用性植物和藥用植物中[7]。LU不僅可以抑制IgE介導(dǎo)的MCs產(chǎn)生的參與過(guò)敏反應(yīng)遞質(zhì)釋放[8],而且可以顯著性降低脂肪細(xì)胞分化[9]和高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重和脂肪組織重量的增加[10]。

研究發(fā)現(xiàn)LU能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠附睪脂肪組織(EAT)中MCs的聚集,但檢測(cè)方法是半定量的甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色,精確度上存在一定的缺陷,并且只能分析組織局部情況,不能很好反映整體組織中MCs數(shù)量的變化。流式細(xì)胞熒光分選(fluorescence activated cell sorting,FACS)技術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段,具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。因此本文利用該技術(shù),以LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的聚集為模型來(lái)定量分析MCs數(shù)量的變化,為進(jìn)一步研究MCs在肥胖中的作用機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

C57BL/6雄性4周齡SPF級(jí)小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;LU(>98%HPLC,上海華壹生物科技有限公司);Mac2抗體(BioLegend); PE anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD117和PE-Cy7 anti-mouse Fc.εR1購(gòu)于eBioscience;Trizol 試劑盒(TaKaRa);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen);SYBR Green MIX(Bio-Rad公司);無(wú)水乙醇等常規(guī)生化試劑(國(guó)藥集團(tuán))。

1.2 儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀MoFlo XDP(Beckman Coulter);組織脫水機(jī)TKY-TSH (亞光);石蠟包埋YB-6LF (亞光);組織切片機(jī)RM2235 (德國(guó)Leica);IQ5熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)

小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)恒溫25 ℃動(dòng)物房,12 h/12 h光暗周期。將5周齡小鼠隨機(jī)分為3組(每組8只),即給于低脂飲食(research diets D12450B,10%能量源于脂肪)的正常對(duì)照組、給予高脂飲食(research diets D12451,45%能量源于脂肪)的肥胖模型組和給予添加0.01%的LU高脂飲食的處理組。喂養(yǎng)20周后處死收取組織。

1.3.2 甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色

EAT固定于4%中性甲醛后常規(guī)脫水石蠟包埋、切片及復(fù)水;復(fù)水后的切片放入蒸餾水中洗5 min;切片放入體積分?jǐn)?shù)為0.5%甲苯胺藍(lán)水溶液中,室溫染色 2 h;自來(lái)水中洗去表面染液;用體積分?jǐn)?shù)為5%乙酸水溶液中分色1 min;分色后的切片迅速放于蒸餾水洗3次,每次5 min;將切片置于室溫中自然涼干;切片浸入二甲苯中透明3 min透明;中性樹(shù)膠封片后放入70 ℃烘箱內(nèi)烘干;在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)MCs數(shù)目并拍攝圖片,并計(jì)算每平方毫米MCs的數(shù)目。

1.3.3 FACS技術(shù)

用CO2窒息小鼠后,取EAT并稱(chēng)重,用剪刀將其剪成細(xì)小碎塊,轉(zhuǎn)移到1.25 mg/mLⅡ型膠原酶溶液中,2.5 mg膠原酶每克組織;37 ℃,80 r/min消化25 min;加入預(yù)冷的0.5% BSA的PBS以終止反應(yīng),用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾,過(guò)濾下液體轉(zhuǎn)移到新的離心管中;4 ℃,400 g離心4 min棄上清;用紅細(xì)胞裂解液裂解去除紅細(xì)胞;利用含0.5% BSA的PBS清洗細(xì)胞,4 ℃,400 g離心4 min后定容到50 μL,加入0.25 μL的Fc Block,冰上靜止15 min。加入抗體,PE-CD45 0.15 μL/50 μL、PE-CY7-Fc.εR1 0.25 μL/50 μL、APC-CD117 0.25 μL/50 μL,冰上反應(yīng)90 min;用0.5% BSA的PBS清洗細(xì)胞,4 ℃,400 g離心4 min,棄上清,定容到300 μL后直接上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量PCR

EAT的總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及定量PCR的方法參考文獻(xiàn)[11]。定量PCR引物詳細(xì)序列見(jiàn)表1所列。

表1 定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色結(jié)果分析

5周齡小鼠隨機(jī)分為3組,分別給予低脂、高脂和高脂補(bǔ)充LU飲食喂養(yǎng)20周。EAT中Mcs的甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 EAT中MCs的甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色

圖2 EAT中MCs甲苯胺藍(lán)染色定量分析

通過(guò)對(duì)EAT中肥大的甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)高脂組小鼠EAT中的MCs數(shù)量顯著多于低脂組小鼠。另外,相比于高脂組小鼠,高脂+LU組小鼠能明顯降低EAT中的MCs,該結(jié)果與之前報(bào)道相一致[9]。因此,通過(guò)組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)飲食補(bǔ)充LU可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)MCs在EAT中的聚集。

2.2 FACS分析結(jié)果

通過(guò)MCs的甲苯胺藍(lán)染色及定量結(jié)果可知,LU降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪浅晒Φ?。由于甲苯胺藍(lán)對(duì)MCs染色是非特異的,并且統(tǒng)計(jì)精確度不高。為了解決該問(wèn)題,本文利用更高精密度的FACS來(lái)分析EAT中的MCs數(shù)目的變化。

首先,用膠原酶將EAT進(jìn)行消化去除成熟的脂肪細(xì)胞以分離出間質(zhì)細(xì)胞,再利用交聯(lián)不同熒光素抗小鼠的抗體PE-CD45 、PE-CY7-Fc.εR1 和APC-CD117標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞中的MCs。先用FACS中的前向和側(cè)向去除間質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞碎片,再圈出CD45陽(yáng)性的細(xì)胞,最后圈出CD117和Fc.εR1雙陽(yáng)性的細(xì)胞即為MCs,如圖3所示。

圖3 FACS分析EAT中MCs

通過(guò)定量計(jì)算得到MCs在間質(zhì)細(xì)胞中所占百分比和每克脂肪組織中MCs的絕對(duì)數(shù)量，如圖4 所示,結(jié)果顯示高脂組小鼠EAT中MCs在間質(zhì)細(xì)胞中所占的比例和絕對(duì)數(shù)量都明顯提高,而高脂+LU組小鼠明顯反轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的結(jié)果。因此,流式結(jié)果不僅能顯現(xiàn)出MCs在間質(zhì)細(xì)胞中比例的變化,而且還能定量得出每克組織中所含MCs總數(shù)的改變。

通過(guò)分析甲苯胺藍(lán)染色和FACS分析定量MCs結(jié)果的相關(guān)性,甲苯胺藍(lán)染色定量的每平方毫米組織中MCs的數(shù)目與FACS定量的每克脂肪組織中MCs的個(gè)數(shù)呈正相關(guān)。說(shuō)明FACS能夠很好地定量脂肪組織中MCs的數(shù)量,如圖5所示。

Mcp是MCs分泌的重要介質(zhì),也是作為MCs的重要標(biāo)記基因。利用定量PCR檢測(cè)了低脂組、高脂組和高脂+LU組小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的mRNA表達(dá)水平,如圖6所示,相比于低脂組小鼠,高脂組小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的表達(dá)顯著性升高,然而LU處理可以明顯逆轉(zhuǎn)MC蛋白酶的升高。這一結(jié)果與FACS分析一致,飲食補(bǔ)充LU可以抑制高脂飲食小鼠EAT中MC蛋白酶的升高。因此,FACS技術(shù)能夠很好地分析EAT中MCs數(shù)量的變化。

圖4 FACS 定量 EAT中MCs的數(shù)目

圖5 MCs甲苯染色與FACS定量的相關(guān)性

圖6 EAT中MC蛋白酶的表達(dá)

3 結(jié) 論

MCs在肥胖及其相關(guān)的胰島素抵抗的產(chǎn)生中起重要作用,天然黃酮類(lèi)化合物L(fēng)U可以有效地抑制MCs的活性,并能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展。之前報(bào)道發(fā)現(xiàn)通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的聚集。本文基于甲苯胺藍(lán)染色存在一定欠缺,以飲食補(bǔ)充LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs 數(shù)量為模型,利用更高精密度的FACS分析定量EAT中MCs的數(shù)目。FACS的結(jié)果顯示MCs在高脂飲食誘導(dǎo)下明顯升高,而LU的飲食補(bǔ)充可以明顯降低MCs的數(shù)目。因此,FACS分析更能精確反映出EAT中MCs在間質(zhì)細(xì)胞中的比例和每克組織中的總數(shù)變化。通過(guò)FACS分析脂肪組織中MCs數(shù)目,為進(jìn)一步研究MCs在肥胖中的作用機(jī)制提供參考。

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QuantitativestudyofmastcellsinadiposetissueusingFACS

ZHANG Lei, LIU Jian

(School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Obesity leads to the imbalance of immune cells in adipose tissue. Mast cells(MCs) significantly increase in adipose tissue of obese individuals. Luteolin(LU), a MCs stabilizer, reduces diet-induced body weight gains and insulin resistance in mice. It was reported that LU decreased the aggregation of MCs in epididymal adipose tissue(EAT) in high fat diet(HFD) -fed mice by toluidine blue staining. Toluidine blue staining is a semi-quantity assay and nonspecific for MCs. In this paper, in order to study MCs in adipose tissue in the obese state more precisely, MCs in EAT from low fat, high fat and high fat supplement LU diets-fed mice were detected by high precision fluorescence activated cell sorting(FACS) of flow cytometry. The results of FACS analysis showed that MCs obviously increased in EAT in HFD group mice and significantly reduced in EAT in LU-fed mice. Moreover, the changes of mRNA levels of MC proteases measured by polymerase chain reaction(PCR) supported the results of FACS analysis. Consequently, FACS analysis for MCs can provide technical support for further study of the function mechanism of MCs in obesity.

luteolin(LU); mast cells(MCs); obesity; flow cytometry; epididymal adipose tissue(EAT)

2016-03-09；

2016-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171315)

張 磊(1987-),男,安徽六安人,合肥工業(yè)大學(xué)博士生; 劉 健(1970-),男,安徽合肥人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.10.022

Q291

A

1003-5060(2017)10-1416-04

(責(zé)任編輯 閆杏麗)