纖維素降解菌CMC-4的分離鑒定、誘變和酶學(xué)特性研究①

王 霞，華 琳，張海龍，朱安寧，曹 慧*

(1 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；3 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008)

纖維素降解菌CMC-4的分離鑒定、誘變和酶學(xué)特性研究①

王 霞1，華 琳2，張海龍2，朱安寧3，曹 慧2*

(1 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；3 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008)

從秸稈還田土壤中初篩獲得一株高效纖維素降解菌CMC-4，根據(jù)菌株形態(tài)、理化性質(zhì)及16S rDNA序列分析，初步鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。以此為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝酸鈉誘變獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)纖維素酶突變株CMC-4-3。對(duì)CMC-4和CMC-4-3的產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明：CMC-4-3纖維素酶活力較CMC-4提高67.5%；其最適產(chǎn)酶條件是：37℃、pH 6.0、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、接種量2.0%、裝液量60 ml/250 ml。該菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)pH為6.0，且在4.0 ～ 7.0酶活力較穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在20～80 ℃范圍內(nèi)均保持穩(wěn)定；金屬離子Fe2+、Mg2+、Co2+、K+對(duì)酶有激活作用，其余離子均有不同程度抑制作用，而Cu2+和Ca2+抑制作用最強(qiáng)，酶活力減弱近50%，是該酶的強(qiáng)效抑制因子。誘變前后菌株產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)等部分表型發(fā)生了變化，而突變菌株顯示出了更寬泛的環(huán)境適應(yīng)范圍。據(jù)此，獲得一株高效產(chǎn)纖維素酶、耐受范圍廣的具纖維素降解能力的地衣芽孢桿菌，而CMC-4-3和CMC-4的表型可作為深入探討基因型變化的線索。

地衣芽孢桿菌；纖維素酶；誘變；酶學(xué)特性；產(chǎn)酶條件

纖維素是自然界中分布最廣的由β-1,4-糖苷鍵以線性模式連接葡萄糖組成的一種復(fù)雜多糖，是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是飼料、燃料及化學(xué)制品最豐富的有機(jī)資源[1-2]。每年光合作用固定的CO2產(chǎn)量約1011t，而其中近乎一半是由纖維素所構(gòu)成[3]。盡管纖維素資源可作為再生能源發(fā)揮巨大潛能，但其尚未得以充分、合理利用，同時(shí)其焚燒還造成了環(huán)境污染。纖維素酶是可水解纖維素內(nèi)β-1,4-糖苷鍵并釋放葡萄糖單位的一類酶，包括外切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.91)、內(nèi)切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.21)[4]。纖維素酶類在紡織、造紙、清潔劑生產(chǎn)、環(huán)保制劑及動(dòng)物飼料制造等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計(jì)纖維素酶貢獻(xiàn)了全球約8% 的工業(yè)酶需求[5]，在美國(guó)其年均市場(chǎng)價(jià)值估計(jì)達(dá)4億美元[6]，且2004—2014年間纖維素酶的使用率增加了近100%[7]。目前纖維酶主要產(chǎn)自木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)等真菌類微生物[8]，這是因?yàn)檎婢軌蚍置诎饫w維素分解酶，比源自細(xì)菌的酶類更容易被提取和純化[9]，但來(lái)源于真菌的纖維素酶耐熱性能較差[10]。纖維素加工過(guò)程通常是在較高的溫度環(huán)境下進(jìn)行，因而降低了酶活性，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)性[11]。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶多為胞內(nèi)酶，雖不易提純，卻具有生長(zhǎng)速率高、產(chǎn)酶功能多、熱耐受性能好等特點(diǎn)[8,12-13]。此外，細(xì)菌纖維素酶具有更有效的催化效率，且受到反饋調(diào)節(jié)作用相對(duì)較小，同時(shí)細(xì)菌纖維素酶為組成型表達(dá)，而自然界中真菌纖維素酶卻為誘導(dǎo)性表達(dá)[14]。因此，篩選產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌一直受到各國(guó)科研和企業(yè)界的廣泛關(guān)注。在發(fā)酵工業(yè)中，細(xì)菌是重要的種子微生物，尤其是芽孢桿菌屬細(xì)菌易于通過(guò)遺傳修飾以獲得期望酶活力并減少副產(chǎn)物產(chǎn)量，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很大應(yīng)用潛力[15]。研究發(fā)現(xiàn)該屬細(xì)菌可產(chǎn)生大量胞外水解酶，不易形成包涵體，有利于基因工程表達(dá)[13,16]。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是一種革蘭陽(yáng)性嗜熱細(xì)菌，可以產(chǎn)生孢子抵抗惡劣環(huán)境。本研究從秸稈還田土壤中分離獲得一株可降解纖維素的地衣芽孢桿菌，并進(jìn)行亞硝酸鈉誘變，對(duì)誘變前后菌株形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性展開初步研究，以期為地衣芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶研究及其在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣本

土壤采自中國(guó)科學(xué)院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站內(nèi)的保護(hù)性耕作長(zhǎng)期試驗(yàn)地。

1.2 土壤纖維素降解菌富集液制備

在裝有90 ml的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和無(wú)菌水中分別加入處理過(guò)的無(wú)淀粉濾紙和10 g新鮮土壤樣品。28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 ～ 7 d，觀察濾紙崩解情況。取10 ml崩解的土壤懸液轉(zhuǎn)接到90 ml無(wú)淀粉濾紙的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次后，制備成10-3～ 10-5濃度梯度懸液。

1.3 菌株篩選

將稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5的梯度懸液涂布于羧甲基纖維素CMC-Na平板上，30 ℃培養(yǎng)3 ～ 5 d，待長(zhǎng)出菌落后點(diǎn)接在CMC-Na固體平板上，剛果紅染色，選擇四周有透明圈的菌株劃線純化。將純化菌株點(diǎn)種到CMC-Na固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)4 d，剛果紅染色。根據(jù)水解圈直徑 (H) 與菌落直徑 (C)比值的大小初選。選出比值較大的5個(gè)菌株，取編號(hào)為CMC-1 ～ CMC-5。將CMC-1 ～ CMC-5 各自1 ml(1×109CFU) 種子液分別接種到100 ml液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 條件下培養(yǎng) 1 d，采用 3,5 -二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定粗酶酶活[18]，進(jìn)行復(fù)選，獲得目的菌株。

1.4 菌株鑒定

利用通用引物[19]擴(kuò)增目的菌株16S rRNA基因，后送金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，返回序列于NCBI中比對(duì)。同時(shí)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《Bergeys Manual of Determinative Baeteriology》[20]對(duì)目的菌株部分生理生化特性加以分析。

1.5 目的菌株誘變及產(chǎn)酶酶活驗(yàn)證

利用亞硝酸鈉法誘變菌株[21]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的菌株懸液(1×109CFU/ml)5 ml于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別加0.1 mol/L和0.05 mol/L NaNO2溶液，各自反應(yīng)5、10、15 min，同時(shí)設(shè)置對(duì)照。后加入2 ml 0.7 mol/L Na2HPO4終止誘變。誘變終止后菌液及對(duì)照菌液梯度稀釋后取10-2、10-3及10-4倍稀釋菌液200 μl涂布CMC-Na平板，30 ℃ 培養(yǎng) 3 d。利用剛果紅染色和DNS法對(duì)誘變菌單克隆產(chǎn)酶酶活驗(yàn)證，篩選優(yōu)良突變菌株。

1.6 遺傳穩(wěn)定性

將篩選出的產(chǎn)酶活性最大的優(yōu)良突變株連續(xù)傳代10次，對(duì)每代菌株產(chǎn)酶酶活用DNS法測(cè)定粗酶酶活，探究誘變菌株是否具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 出發(fā)菌株與誘變菌株產(chǎn)酶條件的研究

1.7.1 最適產(chǎn)酶裝液量 將1 ml出發(fā)菌株和誘變菌株種子液分別加入含40、60、80、100、120、140 ml CMC-Na培養(yǎng)基的三角瓶中，通氣培養(yǎng)24 h后，測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶裝液量。

1.7.2 最適產(chǎn)酶接種量 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(v/v)不同接種量接入100 ml CMC-Na培養(yǎng)基中，通氣培養(yǎng)24 h后，測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶接種量。

1.7.3 最適產(chǎn)酶碳源 將各種不同碳源(CMC-Na、乳糖、麥芽糖、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖)按1% 加入培養(yǎng)基(酵母膏為氮源)，以不加任何碳源為對(duì)照(CK組)，測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶碳源。

1.7.4 最適產(chǎn)酶氮源 將各種不同氮源(酵母膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀)以1% 加入培養(yǎng)基(CMC-Na為碳源)，以不加任何氮源為對(duì)照組(CK組)，測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶氮源。

1.7.5 最適產(chǎn)酶溫度 將培養(yǎng)好的種子液按1%的接種量接種至100 ml液體CMC-Na培養(yǎng)基，后置于不同溫度、180 r/min通氣培養(yǎng)24 h，溫度梯度為20、25、30、37、42 ℃。測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶溫度。

1.7.6 最適產(chǎn)酶pH 培養(yǎng)好的種子液按1% 接種量接種至100 ml CMC-Na培養(yǎng)基中，不同pH條件37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，pH設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。測(cè)定粗酶酶活，確定最適產(chǎn)酶pH。

1.8 酶學(xué)特性的研究

1.8.1 最適反應(yīng)pH 用pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、6.4、6.8、7.0、7.4、8.0、9.0和 10.0 的緩沖液配置質(zhì)量濃度為2% 的羧甲基纖維素(CMC)底物溶液，將培養(yǎng)24 h后的菌液4 ℃、5 000 r/min離心取上清液作為纖維素酶粗酶液，在不同 pH 條件下測(cè)定酶活力。

1.8.2 pH穩(wěn)定性測(cè)定 將上述酶液分別用 pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.4、6.8、7.0、7.4、8.0、9.0和10.0的緩沖液2倍稀釋后置于4 ℃ 24 h，后在最適pH下測(cè)定殘余酶活力。

1.8.3 最適反應(yīng)溫度測(cè)定 取上述酶液經(jīng)最適pH緩沖液適當(dāng)稀釋后，和2% CMC-Na底物混合，在20、30、40、50、60、70和80 ℃溫度測(cè)定其酶活力。

1.8.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將上述酶液分別置于30、40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中水浴1 h，按照上述酶反應(yīng)最適條件測(cè)定殘余酶活力。

1.8.5 金屬離子對(duì)酶活的影響 將終濃度為1 mmol/L的金屬離子Cu2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、Ni+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cr3+、K+、Ba2+添加至酶活力測(cè)定體系中，以不添加任何金屬離子組做對(duì)照(CK)，測(cè)定不同濃度各金屬離子對(duì)酶活力的影響。酶活力測(cè)定在酶反應(yīng)最適pH和最適溫度下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20 min；酶活力定義為上述反應(yīng)條件下，1 ml發(fā)酵液1 min催化底物生成1μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位“U”。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

經(jīng)剛果紅染色初篩、分離純化獲得5株透明圈H/C值較大的菌株。測(cè)定5株分離菌株的粗酶酶活，分別為39.31、42.82、34.63、95.89、44.46 U/ml，其中CMC-4酶活力最大，以此作為出發(fā)菌株。菌株CMC-4的16S rRNA基因序列經(jīng)NCBI比對(duì)表明其與地衣芽孢桿菌屬(Bacillus licheniformis)16S rDNA序列一致性高達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示CMC-4與Bacillus licheniformis ATCC 14508、Bacillus licheniformis Pb-WC11006、Bacillus licheniformis Pb-WC 09005聚在同一分支上。鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭陽(yáng)性桿菌、產(chǎn)芽孢，其菌落圓形較小，邊緣鋸齒狀，表面非黏稠狀。生理生化實(shí)驗(yàn)顯示該菌為氧化酶陰性，過(guò)氧化氫酶、V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)合其他生理生化特征與地衣芽孢桿菌基本生理生化特征[22]比較，初步鑒定CMC-4為地衣芽孢桿菌。

2.2 誘變菌株酶活力及遺傳穩(wěn)定性

以CMC-4為出發(fā)菌株，NaNO2誘變獲得48個(gè)突變株，剛果紅染色篩選獲得3個(gè)水解圈H/C值較CMC-4大的突變株。DNS法測(cè)定粗酶酶活，結(jié)果表明3株突變菌粗酶酶活均比出發(fā)菌株高，其中CMC-4-3酶活力最大為160.29 U/ml，選為目的突變菌株。經(jīng)過(guò)菌株的傳代培養(yǎng)，每隔2代測(cè)定其纖維素酶活力，分析菌株CMC-4-3的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)方差分析，P=0.831(P＞0.05)，表明各代的產(chǎn)酶能力無(wú)顯著性差異，突變菌株CMC-4-3具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 出發(fā)菌株和誘變菌株的產(chǎn)酶條件

2.3.1 溫度和初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同溫度條件對(duì)菌株產(chǎn)酶活力影響結(jié)果(圖1A)表明在37 ～ 40 ℃培養(yǎng)溫度對(duì)CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶有利，且兩者最適產(chǎn)酶溫度均為37 ℃，誘變前后最適溫度未發(fā)生變化。初始pH對(duì)產(chǎn)酶影響結(jié)果顯示(圖1B)，CMC-4在初始pH 7.0產(chǎn)酶最佳，而CMC-4-3的最適產(chǎn)酶初始pH為6.0，誘變前后最適產(chǎn)酶pH發(fā)生變化。當(dāng)初始pH高于最適pH時(shí)兩者粗酶酶活均隨pH的升高而減弱，且在弱堿性環(huán)境中粗酶酶活均較酸性環(huán)境中偏高。

2.3.2 不同碳源、氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同碳源、氮源培養(yǎng)時(shí)結(jié)果(圖1C、圖1D)表明，CMC-4和CMC-4-3對(duì)碳源利用廣泛，當(dāng)碳源分別為葡萄糖和麥芽糖時(shí)它們的產(chǎn)酶較碳源為CMC-Na高。其中CMC-4最佳碳源為麥芽糖，CMC-4-3最佳碳源為葡萄糖，誘變前后最適碳源發(fā)生了改變；而對(duì)于氮源，CMC-4和CMC-4-3的最佳氮源均為蛋白胨，當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r(shí)產(chǎn)酶均最低，誘變前后最佳氮源未發(fā)生變化。

2.3.3 接種量和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 接種量影響產(chǎn)酶酶活試驗(yàn)結(jié)果(圖1E)表明當(dāng)接種量為2.0%時(shí)CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶最佳，其次是1.5%。裝液量的不同是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶氧量的主要手段之一，CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶最佳裝液量均為60 ml/ 250 ml(圖1F)，且在其他不同裝液量水平誘變前后產(chǎn)酶酶活變化較小，誘變發(fā)生前后菌株產(chǎn)酶最佳接種量和裝液量均未發(fā)生變化。

2.4 菌株產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)特性

2.4.1 酶反應(yīng)的最適pH及酶活力pH穩(wěn)定性 由圖2A可見(jiàn)，CMC-4和CMC-4-3表達(dá)的纖維素酶活力均在 pH 3.0 ～ 6.0 呈上升趨勢(shì)，在6.0時(shí)達(dá)最高峰，然后酶活逐漸下降。突變前后菌株分泌的纖維素酶其合適酶促反應(yīng) pH 為 4.0 ～ 7.0，最適反應(yīng) pH 為6.0。而pH對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響結(jié)果(圖2B)顯示這兩株菌所產(chǎn)的纖維素酶對(duì)酸堿的適應(yīng)范圍均較廣，總體上偏酸環(huán)境更有利于酶活力保持。在pH 4 ～ 7時(shí)殘留酶活力較高，超過(guò)60% 以上，而在pH＜4.0或＞7.4時(shí)酶活力則下降較快。

2.4.2 酶反應(yīng)的最適溫度及酶活力熱穩(wěn)定性 溫度對(duì)酶活力影響的結(jié)果(圖3A)表明CMC-4和CMC-4-3表達(dá)的纖維素酶酶活力在20 ～ 50 ℃呈逐漸上升趨勢(shì)，50 ℃ 時(shí)達(dá)到最高峰，后呈下降趨勢(shì)。這些結(jié)果表明酶反應(yīng)的最適溫度為50 ℃，且誘變前后未發(fā)生變化，但60 ～ 80 ℃ 間，CMC-4-3產(chǎn)生酶的活力變化輕微，而來(lái)源CMC-4的酶其活力下降明顯。溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的結(jié)果顯示誘變前后菌株來(lái)源的酶在30 ～ 70 ℃ 范圍活力較穩(wěn)定，均維持在60%以上，且誘變后菌株產(chǎn)生的酶活力溫度范圍更廣，耐低溫性(20 ℃，59.1% vs 37%)和耐熱性(80 ℃，64.3% vs 50.9%)相對(duì)較好。

圖1 不同溫度(A)、初始pH(B)、碳源(C)、氮源(D)、接種量(E)和裝液量(F)對(duì)CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶的影響Fig. 1 The effects of the temperature (A), initial pH (B), carbon sources (C), nitrogen sources (D), inoculation quantity (E), medium volume (F)on the production of cellulase in CMC-4 and CMC-4-3

圖2 pH對(duì)CMC-4和CMC-4-3所產(chǎn)酶酶活力(A)和酶活穩(wěn)定性(B)的影響Fig. 2 The effects of pH on activity (A) and stability (B) of cellulase produced by CMC-4 and CMC-4-3

圖3 溫度對(duì)CMC-4和CMC-4-3所產(chǎn)酶酶活力(A)和酶活穩(wěn)定性(B)的影響Fig. 3 The effects of temperature on activity (A) and stablity (B) of cellulase produced by CMC-4 and CMC-4-3

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響 表1為不同金屬離子對(duì)CMC-4和CMC-4-3來(lái)源纖維素酶活力影響的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)Fe2+、Mg2+、Co2+、K+對(duì)纖維素酶有激活作用；其中Fe2+和K+分別對(duì) CMC-4和CMC-4-3的酶激活作用最強(qiáng)。其余離子均有不同程度抑制作用，其中Cu2+和Ca2+抑制作用最強(qiáng)，酶活力減弱超過(guò)50%，是該酶的強(qiáng)效抑制因子。

表1 不同金屬離子對(duì)酶活力的影響Table 1 The effect of different mege sstal ions on activity of cellulase produced by CMC-4 and CMC-4-3

3 討論

由于纖維素酶的巨大作用潛力，篩選產(chǎn)纖維素酶微生物成為工農(nóng)業(yè)研究的重點(diǎn)。目前工業(yè)上纖維素酶主要來(lái)源于真菌[23]。細(xì)菌也有纖維素酶產(chǎn)生能力，一般細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶水平低，但由于其生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵周期短以及纖維素酶具有耐堿耐熱等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。芽孢桿菌具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)pH和溫度范圍廣、能分解多種底物且產(chǎn)酶活性高等特點(diǎn)[17,24]，作為纖維素產(chǎn)生菌株受到廣泛重視。本研究篩選及誘變獲得的菌株也具有上述特性。在產(chǎn)纖維素細(xì)菌研究工作中關(guān)于地衣芽胞桿菌纖維素降解的研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少涉及，國(guó)內(nèi)劉永生等[22]首次分離獲得一株具有纖維素降解能力的地衣芽孢桿菌GXN151，但該研究是從分子克隆角度篩選編碼纖維素酶的基因，并未對(duì)菌株產(chǎn)酶活性、產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)展開研究。本研究從誘變、菌株產(chǎn)酶方面綜合分析，為其應(yīng)用創(chuàng)造了基本條件。

溫度、培養(yǎng)基初始pH、碳源、氮源、裝液量、接種量是微生物產(chǎn)酶重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于誘變前后菌株，最適產(chǎn)酶溫度均為37 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)使得菌株生長(zhǎng)緩慢或抑制生長(zhǎng)影響產(chǎn)酶。而對(duì)于最適產(chǎn)酶初始pH，誘變前后發(fā)生了變化，CMC-4為7.0，CMC-4-3為6.0，這可能是因?yàn)檎T變使得纖維素酶等功能蛋白發(fā)生突變，進(jìn)而有利于蛋白折疊的pH范圍也發(fā)生相應(yīng)變化；菌株CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶最適氮源均為蛋白胨，而氮源為尿素時(shí)產(chǎn)酶處于最低水平，這與前人研究相符[25]。而最適產(chǎn)酶碳源對(duì)于誘導(dǎo)前后菌株則發(fā)生了變化，即由麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，這可能是因?yàn)檎T變后菌株麥芽糖水解酶活力下降造成的。

目前纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選除了尋找高活力產(chǎn)酶菌外，就是找尋具有特殊活性的產(chǎn)酶菌株，如中性堿性纖維素酶、低溫或高溫纖維素酶等[26]。多數(shù)研究中纖維素酶作用底物的最適溫度在45 ～ 65 ℃ 范圍[27-28]。本研究中出發(fā)菌株和誘變菌株纖維素酶最適pH均為50℃，在20 ～ 80 ℃ 范圍活力維持在60% 以上。但高溫時(shí)誘變菌株所產(chǎn)酶的活力變化輕微，而原始菌株酶的活力下降顯著。誘變后使得酶活力溫度范圍更廣，耐低溫性和耐熱性能力均有所提升。pH對(duì)大部分纖維素酶的活性影響較大，一般認(rèn)為纖維素酶最適反應(yīng)pH在4.0 ～ 5.5[29]，本研究中兩菌株最適反應(yīng)pH均為6.0，在pH 6.0 ～ 7.4范圍內(nèi)，相對(duì)酶活均在60%以上，且誘變后菌株維持相對(duì)酶活能力更強(qiáng)。研究人員在篩選特殊活性產(chǎn)酶菌株方面做了大量工作，如Kaur等[30]篩選到一株嗜熱菌Melanocarpus sp.可產(chǎn)生較高活力的耐熱、中性纖維素酶，有可能成為一個(gè)產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株。有研究還分離到適宜在堿性條件下生長(zhǎng)的高效纖維素降解菌，在pH 7 ～ 11的范圍內(nèi)能夠產(chǎn)生纖維素酶[31]。本研究獲得的CMC-4和突變菌株CMC-4-3是兼具可產(chǎn)生較高活力、相對(duì)耐熱耐堿特點(diǎn)纖維素酶的菌株，可以進(jìn)一步提高纖維素酶的利用范圍，為工業(yè)生產(chǎn)提供了產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株。

除了溫度和pH，影響纖維素酶降解效率的因素還包括抑制劑及激活劑。纖維素酶酶促反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生纖維二糖和葡萄糖會(huì)形成反饋抑制，而添加金屬離子則是一種普遍使用的提高酶活力發(fā)揮激活劑的新方法。但來(lái)源不同的纖維素酶因組分差異，金屬離子對(duì)其促進(jìn)作用有所不同。本研究中Fe2+、Mg2+、Co2+、K+對(duì)纖維素酶有激活作用，這些也是纖維素酶的常見(jiàn)激活性離子。而其余金屬離子均有不同程度抑制作用，其中Cu2+和Ca2+可強(qiáng)效抑制酶活性，Cu2+發(fā)揮抑制效應(yīng)與先前研究一致[32-34]；Ca2+一般對(duì)纖維素酶激活或者影響作用較小[35-36]；丁軻等[37]發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)芽孢桿菌纖維素酶活性有所抑制，但抑制效應(yīng)微小，而本研究中篩選的地衣芽孢桿菌Ca2+對(duì)其纖維素酶活力具有強(qiáng)效抑制作用?？赡蹸a2+對(duì)芽孢桿菌來(lái)源的纖維素酶均具有一定抑制作用，但抑制效應(yīng)如此強(qiáng)烈，在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)利用中應(yīng)引起關(guān)注。

大量的篩選發(fā)現(xiàn)從自然界直接獲得高效降解、適應(yīng)性強(qiáng)的微生物幾率較小，人工誘變則成為了獲得理想菌株的改造方法?；瘜W(xué)誘變育種具有突變率較高、可定位到堿基水平、染色體畸變比例低及遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)[17]，其中亞硝酸(鹽)是最早發(fā)現(xiàn)的類誘變劑，它在提高產(chǎn)能以及改善微生物有用性能方面具有明顯的作用。本研究采用亞硝酸鈉誘變法獲得了一株高效產(chǎn)酶、耐pH和溫度范圍廣且遺傳穩(wěn)定的纖維素降解地衣芽孢桿菌CMC-4-3突變株，成功實(shí)現(xiàn)了人工改造。

4 結(jié)論

本研究從秸稈還田土壤中篩選到一株產(chǎn)酶活性較高的地衣芽孢桿菌CMC-4，成功對(duì)其誘變獲得產(chǎn)酶能力較出發(fā)菌株提高67.5%，且可穩(wěn)定遺傳的突變菌株CMC-4-3。進(jìn)一步對(duì)CMC-4和CMC-4-3產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)加以研究，確立了各自最適產(chǎn)酶條件和環(huán)境條件對(duì)其所產(chǎn)纖維素酶的影響。研究結(jié)果對(duì)于豐富纖維素酶產(chǎn)生菌株資源，以及該纖維素酶的深入研究具有參考價(jià)值。

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Isolation, Identification, Mutagenesis of Cellulose-degrading Bacterium CMC-4 and Its Enzymatic Properties

WANG Xia1, HUA Lin2, ZHANG Hailong2, ZHU Anning3, CAO Hui2*
(1 Nanjing Intitute of Environmental Sciences, MEP, Nanjing 210042, China; 2 College of Economics and Management,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

A strain with highly efficient to degrade cellulose was screened from straw returning soil, termed CMC-4. This strain was identified as Bacillus licheniformis by 16S rRNA gene sequencing, physiological and biochemical properties. Using sodium nitrite as mutagene, a mutant strain CMC-4-3 with stable high-cellulase producing was obtained. The enzymatic properties and enzyme producing conditions of CMC-4 and CMC-4-3 were analyzed. The results showed that cellulase activity of CMC-4-3 was two times as that of CMC-4. And the optimal conditions for enzyme producing of CMC-4-3 were as follows：medium Volume 60 ml/250 ml, inoculation size 2.0%, source of carbon glucose, nitrogen source peptone, the optimum temperature 37 ℃, optimum pH 6.0. The optimal pH and temperature of reaction for the cellulase were 6.0 and 50 ℃, and the enzyme activity was stable at the ranges of pH from 4.0 to 7.0 and temperature from 20 ℃ to 80 ℃. Fe2+, Mg2+, Co2+and K+could activate this cellulase, while other metal ions had some inhibiting effects on enzyme activity. Among inhibitory ions, the inhibition levels of Cu2+and Ca2+were strongest, with a 50% decrease in enzyme activity, thus proved to be the strongest inhibitors for this cellulase. Compared with wild strain CMC-4, the enzymatic properties and enzyme producing conditions for the mutant strain CMC4-3 changed partly, and showed more wide range of environment adaption. Thus a strain of Bacillus licheniformis with stable high-cellulase producing and wide adaption range was obtained. Moreover, the phenotypes of CMC-4 and CMC-4-3 could be the clue for studying genotype changes and the underlying molecular mechanism of mutation breeding.

Bacillus licheniformis; Cellulase; Mutagenesis; Enzymatic properties; Enzyme producing conditions

S154.39

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.05.010

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB100504)和江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)科研基金項(xiàng)目(0713)資助。

王霞(1978—)，女，山東泰安人，博士，主要從事生態(tài)學(xué)研究。E-mail：wangx@ofdc.org.cn