土田七幼嫩根莖的組培快繁

李冬梅++趙超藝++劉小飛

摘 要 以土田七的幼嫩根莖為外植體，通過(guò)對(duì)其芽啟動(dòng)誘導(dǎo)、繼代增殖及生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選，建立了土田七幼嫩根莖的離體快繁體系。結(jié)果表明：土田七幼嫩根莖的最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁；繼代增殖最佳的培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁；生根最佳的培養(yǎng)基為MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L；組培苗移栽較合適的基質(zhì)為進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土混合的基質(zhì)。

關(guān)鍵詞 土田七 ；土田七屬 ；根莖 ；繁殖

中圖分類號(hào) S682.36 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.011

Rapid Propagation of Stahlianthus involucratus via in Vitro Culture

of Young Rhizomes

LI Dongmei ZHAO Chaoyi LIU Xiaofei

（Environmental Horticulture Research Institute，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstrcat Young rhizomes of Stahlianthus involucratus were used as explants for tissue culture. Media for bud inducing， subculture and rooting were screened to establish a rapid propagation system based on young rhizomes of S. involucratus. The results showed that the optimum medium was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose+carrageenan powder 9.5 g/L+10% coconut water for inducing of adventitious buds， MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose+carrageenan powder 9.5 g/L+10% coconut water for subculture， and MS+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose+carrageenan powder 9.5 g/L+10% mashed banana + activated carbon 1.0 g/L for rooting. The optimum medium for transplanting of the rooted plantlets was the mixture of imported peat， red soil and humus soil.

Keywords Stahlianthus involucratus ； Stahlianthus ； rhizome ； propagation

土田七（Stahlianthus involucratus）屬于姜科（Zingiberaceae）土田七屬（Stahlianthus）植物，產(chǎn)于廣東、廣西、云南、福建等地；印度和錫金也有分布[1-2]。土田七植株高15～30 cm，根莖外面棕褐色，內(nèi)面棕黃色，芳香而有辛辣味，根末端膨大成球狀；葉片披針形，葉面深綠色，葉被綠色或淡紫紅色，葉柄較長(zhǎng)；花序從根莖抽出，10～15朵花聚生于鐘狀的總苞內(nèi)，總苞綠色；花白色，唇瓣中央具杏黃色斑，內(nèi)被長(zhǎng)柔毛；生于海拔800～900 m的林下、荒坡蔭濕處；花期5～7月；觀葉類，可作為林下地被和盆栽觀葉植物[1，3-4]。土田七的根莖具藥用價(jià)值，能活血散瘀，消腫止痛，主治跌打損傷，風(fēng)濕骨痛[2，4]。

土田七可通過(guò)切分根莖分株的方式繁殖，但分株繁殖速度慢，且對(duì)母株的根莖也有損傷。黃賽等[5]研究表明，以土田七的莖尖為外植體誘導(dǎo)效果最好，30 d的增殖系數(shù)為4.16，但根莖為外植體表面滅菌較為困難，消毒時(shí)間長(zhǎng)且容易污染，污染率達(dá)到34%。為了建立更優(yōu)良的土田七的根莖組培快繁體系，本研究以土田七的幼嫩根莖為外植體，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)和組培苗移栽等系列研究，建立了高效穩(wěn)定的土田七幼嫩根莖的組培快繁體系，對(duì)提高土田七種苗的繁殖速度、在園藝園林上和作為藥用植物種植的推廣應(yīng)用上具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

從野外采集的土田七根莖引種在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所觀賞植物圃，取植株新長(zhǎng)出的幼嫩根莖（圖1-A），用自來(lái)水清洗干凈后，如圖1-B所示。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

取自來(lái)水洗凈的土田七幼嫩根莖芽，以質(zhì)量百分比濃度計(jì)，先用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30 min，再用0.3%百菌清和甲基硫菌靈（1∶1）混合溶液浸泡根莖芽40 min，接著在自來(lái)水下反復(fù)沖洗根莖芽30 min。晾干表面水分后，在超凈工作臺(tái)上，切掉幼嫩根莖上的假莖，只留1～2 cm高的帶根莖的假莖，用棉球蘸取70%酒精擦拭根莖及1～2 cm高的假莖表面，最后用0.1%升汞溶液消毒15～20 min（圖2A），滅菌水沖洗4～5次，切掉根莖上1～2 cm高的假莖和根莖基部約0.2～0.4 cm的部分，留根莖，并將根莖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。endprint

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室各階段溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 300 lx，光照時(shí)間控制為14 h/d。

1.2.3 試驗(yàn)配方

①初代誘導(dǎo)培養(yǎng) 試驗(yàn)了3種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：（A1）MS，pH 5.8～6.0；（A2）MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8～6.0；（A3）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)基滅菌條件125 ℃，30 min，下同。50 d后統(tǒng)計(jì)接種外植體的啟動(dòng)率和出芽指數(shù)。啟動(dòng)率=（啟動(dòng)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；出芽指數(shù)，外植體上的出芽數(shù)的平均數(shù)。

②繼代增殖培養(yǎng) 當(dāng)初代芽基部叢生芽長(zhǎng)至4～7 cm時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0～1.5 cm接種到增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽。試驗(yàn)了4種增殖培養(yǎng)基：（B1）MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8-6.0；（B2）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8-6.0；（B3）MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8-6.0；（B4）MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8～6.0。每個(gè)處理接種15個(gè)芽基部，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=統(tǒng)計(jì)時(shí)的總芽數(shù)/接種時(shí)總芽數(shù)。

③生根培養(yǎng) 選擇苗高5～7 cm的組培苗接入生根培養(yǎng)基中，每處理各接5瓶，每瓶接6株，重復(fù)3次。采用以下3種培養(yǎng)基進(jìn)行土田七組培苗的生根培養(yǎng)：（C1）MS+活性碳1.0 g/L，pH 5.8～6.0；（C2）MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+活性碳1.0 g/L，pH 5.8～6.0；（C3）MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，pH 5.8～6.0。分別在15 d后統(tǒng)計(jì)生根率和單苗平均根數(shù)。生根率=（生根的芽苗數(shù)/接種芽苗總數(shù)）×100%；單苗平均根數(shù)=總的根數(shù)/生根的苗數(shù)。

1.2.4 組培苗的移栽

當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高6～8 cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗7～10 d，取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.2%百菌清溶液浸泡30 min，移栽到進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土體積比1∶1∶1的基質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)成活率和觀察長(zhǎng)勢(shì)。成活率=成活的苗數(shù)/種的苗數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用excel 2016和SPSS16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土田七幼嫩根莖的有效芽誘導(dǎo)

土田七幼嫩根莖誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可看出，不同的激素種類和濃度對(duì)土田七幼嫩根莖的芽啟動(dòng)有明顯的影響。其中，在A3培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)約15～20 d培養(yǎng)，觀察到肉眼可見(jiàn)的綠芽點(diǎn)（圖2-B），至離體培養(yǎng)50 d左右時(shí)，出芽指數(shù)2.80，啟動(dòng)率100%，大部分外植體可以分化出2～4個(gè)芽，長(zhǎng)勢(shì)較好，是各處理中的最適培養(yǎng)基。

2.2 土田七叢生芽增殖

不同激素濃度對(duì)土田七幼嫩根莖的叢生芽增殖培養(yǎng)的影響見(jiàn)表2。從表2可看出，與B1相比，添加6-BA的濃度，可顯著增加叢生芽的增殖系數(shù)。其中，在B1培養(yǎng)基上經(jīng)約20 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為2.16，大部分叢生芽基部可分化出2～3個(gè)叢生芽；在B2培養(yǎng)基上經(jīng)約20 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為3.18，大部分叢生芽基部可分化出2～5個(gè)叢生芽，長(zhǎng)勢(shì)較好；在B3培養(yǎng)基上經(jīng)約20 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.56，大部分叢生芽基部可分化出3～7個(gè)叢生芽，長(zhǎng)勢(shì)好（圖2-C）；在B4培養(yǎng)基上經(jīng)約20 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.67，大部分叢生芽基部可分化出3～7個(gè)叢生芽，但同時(shí)有白色顆粒狀物形成（圖2-D）。因此，土田七幼嫩根莖的叢生芽增殖培養(yǎng)基以B3為最佳，即MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁，pH 5.8～6.0，有長(zhǎng)勢(shì)好、數(shù)量多的叢生芽。

2.3 土田七無(wú)菌小苗生根培養(yǎng)

土田七無(wú)菌小苗生根試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，添加NAA和香蕉泥，促進(jìn)壯苗生根。因此，土田七組培苗的生根培養(yǎng)中，選用配方C3：MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，可促進(jìn)植株粗壯，無(wú)菌苗表現(xiàn)最好（圖2-E）。

2.4 土田七組培苗移栽成活情況

將土田七的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，0.2%百菌清溶液浸泡30 min，移栽到進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土體積比1∶1∶1的基質(zhì)中，成活率達(dá)90%以上（圖2-F），移栽45 d后可上盆栽培，植株葉片深綠，如圖2-G所示。

3 結(jié)論與討論

前人研究表明，土田七的莖尖為外植體誘導(dǎo)效果最好，30 d的增殖系數(shù)為4.16，但根莖為外植體表面滅菌較為困難，消毒時(shí)間長(zhǎng)且容易污染，污染率達(dá)到34%[5]。筆者將土田七的幼嫩根莖只按常規(guī)的組培消毒程序消毒，發(fā)現(xiàn)土田七的幼嫩根莖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中100%污染。為此，筆者又將土田七的幼嫩根莖進(jìn)行前處理：先用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡30 min，再用0.3%百菌清和甲基硫菌靈（1∶1）混合溶液浸泡40 min，接著在自來(lái)水下反復(fù)沖洗30 min，晾干表面水分后，再在超凈工作臺(tái)上按常規(guī)的組培消毒程序消毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能有效降低土田七的幼嫩根莖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的污染率。endprint

由于姜科植物的多樣性，目前在一些姜屬（Zingiber）、姜花屬（Hedychium）和姜黃屬（Curcuma）等植物中，如紅球姜、紅姜花、白姜花、金姜花、圓瓣姜花、火炬姜、花葉良姜、宮粉郁金、春秋姜黃和黑心姜等采用不同的外植體，如葉片、莖尖、花序軸、苞片、無(wú)菌苗的下胚軸、塊莖、根狀莖、頂芽、側(cè)芽、葉基部和葉鞘，進(jìn)行了離體培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方篩選方面的研究，建立了較好的離體組織培養(yǎng)快繁體系[6-22]。本研究以土田七的幼嫩根莖為外植體建立了土田七的離體快繁體系。這與前人報(bào)道土田七根莖的芽誘導(dǎo)率偏低，芽生長(zhǎng)緩慢，芽體短的結(jié)果不一致[5]。以土田七的莖尖為外植體，繼代增殖30 d可誘導(dǎo)2～4個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)為4.16[5]；本研究以土田七的幼嫩根莖為外植體，繼代增殖20 d的最佳培養(yǎng)基可誘導(dǎo)3～7個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)為4.56，長(zhǎng)勢(shì)好。因此，土田七的幼嫩根莖為外植體進(jìn)行離體快繁是其可行的繁殖方式之一，而且同莖尖為外植體相比，明顯縮短繼代增殖周期和提高增殖系數(shù)。此外，本試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基為MS，這與黃賽[5]所用的基本培養(yǎng)基相同，不同的是，本試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基中添加了椰汁，至于椰汁在土田七叢生芽誘導(dǎo)和增殖方面的作用，尚需要做進(jìn)一步研究。

不同栽培基質(zhì)對(duì)4種姜科花卉組培苗移栽成活和生長(zhǎng)有較大影響[23]，筆者通過(guò)篩選海南三七組培苗的移栽基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土體積比1∶1∶1的混合基質(zhì)較適合海南三七的組培苗[24]。因此，用此基質(zhì)來(lái)移栽土田七的組培苗，發(fā)現(xiàn)土田七的組培苗長(zhǎng)勢(shì)也良好（圖2-F），也較適合土田七的組培苗移栽。

綜上所述，以土田七的幼嫩根莖為外植體進(jìn)行離體組培快繁，是土田七可行的組培苗繁殖方式之一。此方式最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁；繼代增殖最佳的培養(yǎng)基為：MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉9.5 g/L+10%椰汁。組培苗移栽較合適的基質(zhì)為進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土混合的基質(zhì)。

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