‘巴厘’菠蘿離體培養(yǎng)技術(shù)

林文秋　肖熙鷗　張紅娜　劉勝輝　孫偉生　吳青松　李運(yùn)合

摘 要 以菠蘿品種‘巴厘的吸芽或腋芽為外植體，從滅菌消毒、愈傷組織和芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)和練苗移栽等方面，闡述了菠蘿組織培養(yǎng)技術(shù)及存在問題。

關(guān)鍵詞 菠蘿 ；‘巴厘 ；離體培養(yǎng)

中圖分類號 S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.010

In Vitro Culture of Yellow Mauritius Pineapple

（Ananas comosus L. Merr.）

LIN Wenqiu XIAO Xi'ou ZHANG Hongna

LIU Shenghui SUN Weisheng WU Qingsong LI Yunhe

（1 South Subtropical Crop Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524091；

2 Hainan Provincial Engineering Research Center for Pineapple Germplasm Innovation

and Utilization， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract Suckers and axillary buds of yellow Mauritius pineapple （Ananas comosus cv Yellow Mauritius） were used as explants for tissue culture， and the tissue culture and its arising problems in sterilization， callus and shoot induction， subculture for proliferation， rooting， hardening off and transplanting were described.

Keywords pineapple ； yellow Mauritius pineapple ； in vitro culture

菠蘿（Ananas comosus L.）屬于鳳梨科鳳梨屬植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的著名水果，也是世界重要的水果之一。我國是菠蘿十大主產(chǎn)國之一，其產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、海南、廣西、福建、云南等省份[1]。生產(chǎn)上主要通過從菠蘿植株上長出的各種新芽（吸芽、冠芽、裔芽和塊莖芽）進(jìn)行扦插繁殖，存在繁殖系數(shù)低[2]，生長速度慢，種苗生長不一致，容易攜帶病菌等問題[3]，不利于生產(chǎn)。而組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高，苗期一致等特點(diǎn)，有助于菠蘿品種的推廣與更新?lián)Q代。自aghion和Beauchesue[4]于1960以冠芽為外植體進(jìn)行離體繁殖獲得成功后，研究人員對不同品種的菠蘿組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，建立了不同品種的再生體系[5-7]。隨后，對影響菠蘿組織培養(yǎng)因素的研究發(fā)現(xiàn)菠蘿再生受到多種因素的調(diào)控：（1）基因型是影響菠蘿再生的重要因素之一，不同品種再生率不同[8]；（2）外植體類型影響菠蘿再生率[9-10]；（3）植物生長調(diào)節(jié)劑對菠蘿再生有著重要的作用。研究表明，適當(dāng)添加激素有助于菠蘿高效再生體系的建立。其中，6-BA在菠蘿外植體芽的增殖和分化過程中起著關(guān)鍵作用[11-12]；（4）培養(yǎng)時(shí)間和繼代次數(shù)對愈傷組織和芽的分化有影響。同一繼代次數(shù)的不同培養(yǎng)時(shí)間芽的增殖數(shù)量不同[12]。此外，不同培養(yǎng)方式愈傷組織的誘導(dǎo)和芽的分化率存在顯著差異，Ayenew等[13]研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿叢生芽在瞬時(shí)浸沒式生物反應(yīng)器下進(jìn)行培養(yǎng)，其再生率高達(dá)95%。

‘巴厘菠蘿自1953年引進(jìn)我國后，因其汁多、味甜、產(chǎn)量穩(wěn)定、田間易管理等特點(diǎn)，成為我國主栽品種之一，約占全國菠蘿種植面積的80%，主要分布在廣東徐聞地區(qū)[14]。為獲得整齊一致的‘巴厘菠蘿脫毒苗，滿足生產(chǎn)需求，降低種植成本，保存創(chuàng)新菠蘿種質(zhì)資源和今后的開發(fā)利用，筆者通過對該品種的外植體誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)及組培苗移栽等技術(shù)進(jìn)行研究，建立了‘巴厘菠蘿的高效再生體系。

1 ‘巴厘菠蘿組織培養(yǎng)技術(shù)

1.1 取材及消毒

1.1.1 取材

供試材料為生長健壯、無病蟲害的 ‘巴厘品種的吸芽或腋芽，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃。

1.1.2 消毒

在晴天采下生長健壯的吸芽或腋芽，從基部剝除衰老葉片后，用自來水將芽沖洗干凈，在吸芽生長點(diǎn)上方約5 cm處切斷所有葉片，將芽和著生在吸芽上的白色葉基放入2% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3次，再放入0.1% HgCl消毒8 min，無菌水沖洗3次。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 直接再生途徑

用滅好菌的手術(shù)刀，將消毒好的外植體縱切成2～3塊，接種于MS+2.0 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行啟動培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30 d后，從葉腋處萌發(fā)出不定芽。將不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，繼代周期為25～30 d，增殖系數(shù)約為3（圖1）。

1.2.2 愈傷組織、芽的誘導(dǎo)和增殖

將菠蘿品種‘巴厘吸芽的葉基接種在MS+3 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)30 d后，從切口處產(chǎn)生結(jié)瘤狀愈傷組織，誘導(dǎo)率約為60%。不同培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織鮮重質(zhì)量增加率結(jié)果表明，培養(yǎng)20 d后，鮮重增加率達(dá)到最大值，隨后下降，因此，愈傷組織最佳繼代周期為20 d （圖2）。將愈傷組織轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基上，26℃，1 500 lx的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，20 d后部分愈傷組織的球形節(jié)狀表面出現(xiàn)小綠點(diǎn)，然后小綠點(diǎn)伸長長大，形成叢生芽。將叢生芽切成單株，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，芽逐漸長高，30 d后形成再生植株。繼代周期為25～30 d（圖1）。endprint

1.2.3 誘導(dǎo)生根

將獲得的組培苗切成單株轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基（MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）中，培養(yǎng)25～30 d。當(dāng)不定芽長至株高2 cm左右、有3～5片葉時(shí)，將其沿基部切下，接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，培養(yǎng)條件同繼代培養(yǎng)一致。培養(yǎng)15 d后小苗基部開始長根30 d后，長出10條左右較粗的根，生根率可達(dá)90%～100%（圖1）。

1.2.4 練苗移栽

為了提高組培苗的移栽成活率，在移栽前需進(jìn)行練苗。當(dāng)小苗有3～5條1 cm以上的不定根時(shí)，逐步開蓋練苗3～5 d，取出小苗，將根部培養(yǎng)基洗去，晾干，移到透氣性和保濕性良好的泥炭土中，澆定植的水，保持濕潤，遮蔭1～2周后長出新根和新芽。移栽成活率可達(dá)95%（圖1）。

2 存在問題及建議

在生產(chǎn)上，傳統(tǒng)的菠蘿繁殖方法是通過母體抽生的各類芽（冠芽、吸芽、裔芽）進(jìn)行無性繁殖，存在繁殖系數(shù)低，種苗一致性差，易攜帶母體的病蟲害，易發(fā)生變異，導(dǎo)致種質(zhì)的退化等問題。此外，通過無性繁殖既制約了優(yōu)良品種的推廣和應(yīng)用，也不利于品種的調(diào)整和改良。而利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以獲得大量脫毒且生產(chǎn)性狀一致的種苗，滿足生產(chǎn)需求，為進(jìn)行品種的改良和更換提供技術(shù)支撐。研究人員通過對不同菠蘿品種組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，雖然建立了不同品種的再生體系[15-19]，但都出現(xiàn)不同程度的植株變異，變異率約為0.031%～34%，阻礙了菠蘿組培苗工廠化的進(jìn)程[20-26]。因此，在菠蘿組織培養(yǎng)過程中，如何減少或者避免體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生，降低組織培養(yǎng)的成本，有利于推進(jìn)菠蘿工廠化育苗和品種的更新?lián)Q代，加快菠蘿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程。

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