蓽茇酰胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響

張倩 徐文茂

蓽茇酰胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響

張倩 徐文茂

目的探討蓽茇酰胺（piperlongumine,PL）對(duì)膠質(zhì)瘤增殖以及侵襲的作用并闡明其作用機(jī)制。方法我們應(yīng)用蓽茇酰胺處理了兩種不同的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并用正常神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)PL對(duì)于細(xì)胞ROS水平的改變以及細(xì)胞增殖信號(hào)通路的改變。隨后檢測(cè)了PL潛在的作用靶點(diǎn)PRDX4的活性改變。結(jié)果PL能夠顯著增強(qiáng)兩種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的ROS水平以及抑制細(xì)胞增殖能力，但對(duì)正常神經(jīng)元細(xì)胞則無(wú)明顯影響。隨后的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)PL刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞后多種ROS相關(guān)的氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)因子都出現(xiàn)了上調(diào)，其中以PRDX家族中的PRDX4表達(dá)量上升最為明顯。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，抑制ROS的作用之后，PL誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的能力出現(xiàn)了抑制。結(jié)論P(yáng)L能夠通過(guò)提高PRDX4的表達(dá)從而介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，因此PL可能作為膠質(zhì)瘤的潛在治療藥物。

茇酰胺；膠質(zhì)瘤；侵襲

作者單位：250022 濟(jì)南，山東濟(jì)南循證醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)中心（張倩）；100054 北京，北京斯普林格醫(yī)學(xué)研究院分子醫(yī)學(xué)研究所（徐文茂）

高級(jí)別膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度最高以及最為常見(jiàn)的腫瘤。其中，以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma,GBM）最為高發(fā)。盡管在臨床以及實(shí)驗(yàn)室研究中都進(jìn)行了大量的工作，但患者在診斷后的生存時(shí)間通常小于14.6個(gè)月，僅僅比25年前的生存期增加了2.5個(gè)月[1]。目前，最為有效的GBM治療方法僅能短暫的增加患者的生存時(shí)間，而無(wú)法有效治療腫瘤，并且仍存在著易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特性，因此，新的GBM治療方式急需創(chuàng)新。

通過(guò)以往的研究，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的GBM都存在PRDX4的過(guò)度高表達(dá)，同時(shí)，也有研究表明，通過(guò)敲除PRDX4能夠增加ROS的表達(dá)量，進(jìn)而在體外導(dǎo)致GBM細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步在小鼠的原位GBM模型中，減少小鼠腫瘤體積，從而延長(zhǎng)小鼠生存率。上述的研究都表明，通過(guò)靶向藥物抑制PRDX4能夠通過(guò)增加ROS的水平從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞。

通過(guò)蓽茇酰胺（piperlongumine,PL）選擇性地增加ROS水平已被證明對(duì)許多腫瘤具有殺傷作用，包括乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤和GBM等[2]。PL是由植物蓽茇中提取出來(lái)的天然生物堿。更為重要的是，應(yīng)用PL的治療方式在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，還能夠減少對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，減少化療對(duì)機(jī)體的影響。以往的研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理后的腫瘤細(xì)胞中ROS水平出現(xiàn)了成倍的增長(zhǎng)，而正常細(xì)胞則沒(méi)有這種表現(xiàn)，表明PL具有腫瘤細(xì)胞靶向治療的特性。過(guò)去的研究已經(jīng)表明，PL的抗腫瘤作用與包括PRDX1的多種抗氧化蛋白密切相關(guān)[3]。更為重要的是，近期的研究表明，PL在全養(yǎng)分的培養(yǎng)條件下能夠選擇性的介導(dǎo)GBM的凋亡[4]。盡管如此，目前對(duì)于PL更為貼近臨床的研究，即在膠質(zhì)瘤癌球以及在體作用的研究仍不清楚，因此PL距離臨床抗腫瘤藥物的應(yīng)用還存在研究的空間[5]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PL處理后能夠有效增加GBM細(xì)胞中ROS的水平，同時(shí)能夠選擇性的靶向介導(dǎo)HGG細(xì)胞的凋亡而對(duì)正常腦細(xì)胞無(wú)明顯影響。究其機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)PL通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDX4的活性而增加增加其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平介導(dǎo)ROS的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251均來(lái)源于上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物處理以及細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將5.0×103的細(xì)胞種于96孔板或3.0×104細(xì)胞種于24孔板，24 h后，用以不同濃度溶于DMEM的PL（0-10 μmol/L）處理細(xì)胞1 d-6 d，隨后通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力改變。具體方法為分別在第1、2、4、6天加入10 μL的CCK-8試劑，37oC孵育2 h，測(cè)定 450 nm的OD值。

1.3 PRDX4活性檢測(cè) 通過(guò)2-Cys-Peroxiredoxin活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PRDX4的活性，具體方法為，30 μg細(xì)胞裂解液或者3 μg的重組人PRDX4蛋白與硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶以及NAPDH混合。隨后加入10 mmol/L的過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)并分別在第60、90、120秒通過(guò)分光光度法檢測(cè)NADPH的消耗量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PL處理后顯著性介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 我們首先應(yīng)用不同濃度的PL分別對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及正常的人膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，PL處理后的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力被有效的降低，其中，10 μmol/L的PL處理后，與正常培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系相比較，能夠?qū)⑷四z質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251的增殖能力降低60%-90%，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，通過(guò)對(duì)正常膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞的處理我們發(fā)現(xiàn)，PL對(duì)于正常細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響，PL處理后神經(jīng)元的增殖能力未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖1。

2.2 PL處理后顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS的水平 隨后，我們檢測(cè)了PL對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用是否與其對(duì)其他腫瘤的機(jī)制類(lèi)似，即通過(guò)增加ROS的水平從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)檢測(cè)后我們發(fā)現(xiàn)，在兩組人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251中，給予PL刺激后，ROS水平分別增加了約51%和52%，而在神經(jīng)元細(xì)胞刺激后則未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明，PL的腫瘤細(xì)胞殺傷作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升相一致，為PL抗腫瘤作用的可能機(jī)制。

2.3 PL處理后能夠選擇性增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平隨后，我們有進(jìn)一步檢測(cè)了PL處理后，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251以及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL處理后，U87以及U251的凋亡率均出現(xiàn)了顯著增加，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而應(yīng)用PL處理神經(jīng)元細(xì)胞后則未見(jiàn)其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有明顯影響，見(jiàn)圖3。上述結(jié)果表明，PL能夠通過(guò)提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的ROS水平從而進(jìn)一步介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常的神經(jīng)元細(xì)胞則無(wú)影響，表現(xiàn)出膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向治療特性。

2.4 PL對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用依賴(lài)于ROS的激活 同時(shí)，為了驗(yàn)證PL對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷作用依賴(lài)于ROS的增高，我們又在PL處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中加入了一種經(jīng)典的抗氧化劑-乙酰半胱氨酸（NAC），并且發(fā)現(xiàn)，U87以及U251細(xì)胞應(yīng)用NAC處理后，其對(duì)于PL的殺傷作用明顯耐受增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。由此上述的結(jié)果明確了PL依賴(lài)ROS的增加從而介導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

2.5 PL處理后顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDX4的活性我們首先通過(guò)q-PCR檢測(cè)了PL處理后兩種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251以及正常人神經(jīng)元細(xì)胞的ROS相關(guān)調(diào)節(jié)因子中的重要一員，PRDX家族基因表達(dá)水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL處理后與神經(jīng)元細(xì)胞相比，PRDX4基因水平出現(xiàn)了顯著性增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。同樣的，對(duì)PRDX酶活性的檢測(cè)結(jié)果也表明，細(xì)胞裂解液中的PRDX的酶活性在PL處理之后明顯出現(xiàn)了抑制，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖6。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PL刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞中PRDX4的活性受到明顯的抑制，結(jié)合之前的研究證據(jù)，表明PRDX4是PL介導(dǎo)ROS從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的重要媒介。

圖1 蓽茇酰胺處理后顯著性介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

圖2 蓽茇酰胺處理后顯著性提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS的水平

圖3 蓽茇酰胺處理后能夠選擇性增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平

圖4 蓽茇酰胺對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用依賴(lài)于ROS的激活

圖5 蓽茇酰胺處理后顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDX酶的活性

圖6 蓽茇酰胺處理后顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDX4的活性

3 討論

以往關(guān)于PRDX4的研究已經(jīng)明確的表明，PRDX4在膠質(zhì)瘤中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，并且PRDX4敲除之后能夠顯著增加ROS的水平從而殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞。但是如何選擇性地靶向針對(duì)PRDX4進(jìn)行膠質(zhì)瘤治療仍然存在較大爭(zhēng)議，特別是PRDX4在多種細(xì)胞上都存在廣泛的表達(dá)。通過(guò)本研究，我們發(fā)現(xiàn)了一種天然的植物提取物PL，能夠特異性的降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDX4的活性，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[6]。

ROS參與了大量的細(xì)胞活動(dòng)。過(guò)量的ROS水平能夠引起氧化應(yīng)激、DNA損傷和基因組的不穩(wěn)定。因此，ROS水平的高低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)也是抗腫瘤治療的潛在靶標(biāo)。但是，近期的許多研究都表明，許多腫瘤中抗氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)量均高于正常組織。這些在腫瘤組織中高表達(dá)的抗氧化應(yīng)激蛋白減輕了腫瘤中ROS的水平，進(jìn)而降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少了氧化應(yīng)激對(duì)于腫瘤細(xì)胞的損傷，使腫瘤細(xì)胞更易于生存[7,8]。因此通過(guò)增加氧化應(yīng)激來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，將成為未來(lái)重要的抗腫瘤治療方法，而本實(shí)驗(yàn)中，PL通過(guò)增加ROS的水平從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖水平，是對(duì)上述理論的有力支持。

已知PL能夠與多種ROS的調(diào)節(jié)因子相互作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常的神經(jīng)元細(xì)胞。但是此前的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于CBR1、GSTZ1以及PRDX1等基因的敲除對(duì)PL介導(dǎo)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的抑制未見(jiàn)影響。由此說(shuō)明，PL在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在其他的作用靶點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)PRDX4在PL處理過(guò)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在明顯高表達(dá)，為PL作用的靶點(diǎn)提供了新的證據(jù)，同時(shí)也解釋了PL不影響正常神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制，即由于PRDX4在正常細(xì)胞中表達(dá)量較低，因此PL處理后無(wú)法滲入細(xì)胞，使其不能誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生[9]。

最后，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的藥物治療，最為重要的一點(diǎn)即是能夠順利通過(guò)血腦屏障。根據(jù)相關(guān)報(bào)道表明，PL能夠自由的通過(guò)血腦屏障。因此，通過(guò)PL抑制PRDX4的活性，進(jìn)而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ROS水平增高，抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖，將會(huì)成為未來(lái)膠質(zhì)瘤治療中的一種有效手段。

1 Markovic DS,Vinnakota K,Chirasani S,et al.Gliomas induce and exploit microglial MT1-MMP expression for tumor expansion.Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(30): 12530-12535.

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8 Suzuki-Karasaki Y,Suzuki-Karasaki M,Uchida M,et al.Depolarization controls TRAIL-sensitization and tumor-selective killing of cancer cells: Crosstalk with ROS.Front Oncol,2014,4: 128.

9 Neumann CA,Fang Q.Are peroxiredoxins tumor suppressors? Curr Opin Pharmacol,2007,7(4): 375-380.

Role of piperlongumine in glioma proliferation

Qian ZHANG1,Wenmao XU2

1Ji'nan Evidence Based Medicine Technology Development Center of Shandong,Ji'nan 250022,China;2Institute of Molecular Medicine,Beijing Springer Medical Research Institute,Beijing 100054,China

ObjectivePiperlongumine,a natural plant product,kills multiple cancer types with little effect on normal cells.Piperlongumine raises intracellular levels of reactive oxygen species (ROS),a phenomenon that may underlie the cancer-cell killing.Although these findings suggest that piperlongumine could be useful for treating cancers,the mechanism by which the drug selectively kills cancer cells remains unknown.MethodsWe treated multiple high-grade glioma (HGG) sphere cultures with piperlongumine and assessed its effects on ROS and cell growth levels as well as changes in downstream signaling.We also examined the levels of putative piperlongumine targets and their roles in HGG cell growth.ResultsPiperlongumine treatment increased ROS levels and preferentially killed HGG cells with little effect in normal brain cells.Piperlongumine reportedly increases ROS levels after interactions with several redox regulators.Furthermore,piperlongumine treatment in HGG cells,but not in normal NSCs,increased oxidative inactivation of peroxiredoxin 4 (PRDX4),an ROS-reducing enzyme that is overexpressed in HGGs.Moreover,piperlongumine’s effects was blocked after the inhibition of ROS overexpression in glioma cells.ConclusionOur results reveal that the mechanism by which piperlongumine preferentially kills HGG cells involves PRDX4 inactivation.Therefore,piperlongumine treatment could be considered as a novel therapeutic option for HGG treatment.

Piperlongumine; Glioma; Proliferation