MED1的表達對卵巢癌細胞特性的影響

鄭元慧 董男男

MED1的表達對卵巢癌細胞特性的影響

鄭元慧 董男男

目的研究卵巢癌細胞中MED1的表達對細胞生長、遷移以及侵襲能力的影響。方法通過分子手段獲得MED1沉默型卵巢癌細胞B7-D5與C4-E8，進行MTT實驗，細胞克隆實驗以及通過流式細胞儀測定分析細胞周期實驗，與MED1表達型卵巢癌細胞比較細胞生長特性；進行Transwell遷移以及侵襲實驗，對比細胞遷移和侵襲能力的變化。結果MED1沉默型卵巢癌細胞胞體外生長受到抑制，克隆數目急劇降低，被阻滯在G0/G1期的細胞明顯增多，S期細胞數目減少，遷移以及侵襲能力降低。結論MED1的沉默表達可以有效抑制卵巢癌細胞的生長以及遷移，為研發(fā)治療卵巢癌的靶向藥物奠定基礎。

轉錄中介體1；卵巢癌；細胞生長特性

作者單位：250022 濟南，山東濟南循證醫(yī)學科學研究中心基礎醫(yī)學部

卵巢癌是全球女性生殖系統死亡率最高的惡性腫瘤疾病。據美國癌癥協會統計，2012年美國新發(fā)卵巢癌病例22,280例，新死亡病例15,500例[1]。在我國所有婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率第3位，而死亡率卻居首位[2]。目前，對于卵巢癌的治療主要分為手術和化療兩種方法。手術治療與化療對患者身體傷害極大，并且復發(fā)率高，這就迫切需要卵巢癌治療的新方法。近幾年，隨著越來越多的證據支持腫瘤干細胞假說，干細胞療法也逐漸成為研究卵巢癌治療的熱門領域[3-6]。與此同時，通過研究卵巢癌細胞生長以及轉移的相關基因治療方法也成為全球學者研究的重點[7]。

本文即通過細胞分子生物學的方法，獲得MED1沉默型卵巢癌細胞，研究其與正常卵巢癌細胞在細胞生長特性以及遷移和侵襲能力上的改變情況，揭示MED1在卵巢癌細胞生長及轉移過程中起到的作用，為研發(fā)治療卵巢癌的靶向性藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人卵巢癌細胞OVA-1，購于美國ATCC公司；MED1沉默型人卵巢癌細胞B7-D5與C4-E8，均本實驗室自行制備；胎牛血清（FBS），購于Gibco公司；DEME培養(yǎng)基，購買于Gibco公司；胰蛋白酶，購于OXOID公司；DMSO，購于天津希為化工有限公司；無水乙醇、甲醛以及結晶紫染液，購于天津希為化工有限公司；所有試劑皆為分析純。

1.2 實驗儀器 6孔板、24孔板與96孔板，購買于Thermo公司；酶標儀，夠買于Bio-Rad公司；細胞培養(yǎng)箱，購買于美國施都凱儀器設備（上海）有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，購買于上海申安醫(yī)療器械廠；流式細胞儀，購買于FACSCalibur、BD Biosciences（美國）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞增殖實驗（MTT） 將細胞以每個孔200 μL接種于96孔板中（5×103個/孔-8×103個/孔），分別常規(guī)培養(yǎng)（37oC與5%CO2）2 d、4 d與6 d后，加入MTT（5 mg/mL,20 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清培養(yǎng)液，加入100 μL/孔的DMSO，振蕩10 min，選取490 nm波長用酶標儀測定OD值。

1.3.2 細胞克隆實驗 取細胞2×103個/mL，接種于6孔板中，毎孔2 mL，每隔3 d換液一次，常規(guī)培養(yǎng)3周左右，當孔中出現肉眼可見的克隆時，停止培養(yǎng)，吸取上清培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入4%甲醛進行固定，固定時間為15 min，吸取上清液，0.25%的結晶紫染色25 min，無菌水緩慢沖洗，置于無菌超凈臺中進行干燥，干燥后進行拍照、計數。

1.3.3 細胞周期實驗 取細胞約1×106個，懸于PBS中，用700 μL無水乙醇（預冷）旋轉固定3 h左右，500 μL PI染色液37oC溫育30 min，然后用40 μm尼龍網膜進行過濾，流式細胞儀（488 nm波長處檢測紅色熒光）與ModfFitLT軟件測量各個周期細胞所占比例。

1.3.4 細胞遷移實驗 取對數生長期細胞無血清培養(yǎng)1 d，制備無血清細胞懸液（細胞濃度1×105個/mL），以上室加入200 μL細胞懸液，下室加入500 μL含10%FBS培養(yǎng)液接種于24孔板小室中，常規(guī)培養(yǎng)1 d左右進行固定與染色（加入4%甲醛進行固定，固定時間為15 min，吸取上清液，0.25%的結晶紫染色25 min，無菌水緩慢沖洗，置于無菌超凈臺中進行干燥，干燥后進行拍照、計數）。

1.3.5 細胞侵襲實驗 BD Matrigel于4oC過夜，基質膠與無FBS培養(yǎng)液按1:5配置工作液，加入24孔板小室的上室中（60 μL/孔），37oC，2 h，其他同1.3.4。

1.4 統計學方法 采用SPSS 10.0進行數據分析，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗（MTT）結果 根據實驗方法1.3.1所示進行實驗，以時間為橫坐標，酶標儀測定的OD值為縱坐標繪制不同細胞生長曲線圖，如圖1所示。其中B7-D5與C4-E8為本實驗室篩選的MED1沉默型卵巢癌細胞，OVA-1為MED1表達型卵巢癌細胞。由圖1可知，MED1表達沉默型的卵巢癌細胞（B7-D5與C4-E8）與MED1表達型細胞相比生長明顯減慢，說明MED1沉默表達對卵巢癌細胞的生長具有抑制作用。

2.2 細胞克隆實驗結果 根據實驗方法1.3.2所示進行實驗，將細胞板倒置拍照，用肉眼計數細胞形成的克隆數，實驗數據如圖2所示。B7-D5和C4-E8細胞克隆數的統計與OVA-1細胞克隆數的統計比較具有統計學意義（P＜0.001）。可見MED1表達沉默型的卵巢癌細胞（B7-D5與C4-E8）與MED1表達型細胞相比，在細胞培養(yǎng)板上形成克隆的數目急劇減少。

2.3 細胞周期實驗結果 根據實驗方法1.3.3所示進行實驗，在同時檢測光散射情況，利用ModfFitLT軟件，根據FL2-A直方圖分析細胞周期中G0/G1、S、G2期細胞的比例，實驗結果如圖3所示?？梢奙ED1表達沉默型細胞B7-D5與C4-E8處于G0/G1期的數目明顯多于MED1表達的細胞OVA-1（P＜0.001），與此相對應的進入S期的細胞數目明顯減少，說明MED1沉默表達對于卵巢癌細胞分裂周期起到抑制作用，因此可以抑制卵巢癌細胞的生長。

2.4 細胞遷移實驗結果 根據實驗方法1.3.4所示進行實驗，結果如圖4所示。OVA-1細胞相對遷移為1.00，B7-D5與C4-E8遷移能力分別為0.20和0.22，與OVA-1相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），可見MED1表達沉默型細胞B7-D5與C4-E8遷移能力明顯降低。

2.5 細胞侵襲實驗結果 根據實驗方法1.3.4所示進行實驗，結果如圖5所示。OVA-1細胞相對遷移為1.00，B7-D5與C4-E8遷移能力分別為0.16和0.17，與OVA-1相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明MED1表達沉默型細胞B7-D5與C4-E8侵襲能力明顯降低。

3 結論

MED1是中介體復合物（Mediator Complex）的一種，是Mediator在哺乳動物中最為重要的一個亞基，又被稱之為PBP、RB18A等[8]。作為Mediator最為重要的亞基，同時也是研究最多的亞基，MED1與Mediator一樣也是mRNA合成過程中起早關鍵性的作用[9]。它能通過MAPK、PDK/Akt途徑實現磷酸化激活，并與其他共調控因子，一同調控靶基因的轉錄和表達，起到控制細胞生長的作用[10]。此前，有學者[11]研究完全敲除小鼠MED1基因，在培養(yǎng)小鼠11.5 d后，發(fā)現小鼠的胎盤以及心血管出現功能低下、發(fā)育缺陷等病癥。Hasegawa[12]與Cui[13]等研究MED1沉默型乳腺癌細胞時發(fā)現，MED1沉默表達的乳腺癌細胞生長較正常細胞明顯受到抑制。本研究也發(fā)現，MED1沉默型卵巢癌細胞的生長也明顯受到抑制。

圖1 MED1的表達對卵巢癌細胞體外生長的影響

圖2 MED1的表達對卵巢癌細胞克隆形成的影響

圖3 MED1的表達對卵巢癌細胞周期的影響

圖4 MED1表達對卵巢癌細胞遷移能力的影響

圖5 MED1表達對卵巢癌細胞侵襲能力的影響

侵襲轉移是造成腫瘤患者治療失敗甚至死亡的最主要因素[14]。而Shuman等[15]的研究發(fā)現，腫瘤的遷移及侵襲都與MMPS的表達和活化有關。MED1是與SCR以及CBP一樣都具有LXXLL結構域，并且是核受體的共激活因子的轉錄因子。有研究[16-18]表明SCR、CBP可以通過控制MMPS的表達調控乳腺癌細胞的轉移。本文研究MED1沉默型卵巢癌細胞時發(fā)現細胞的遷移和侵襲能力降低，說明MED1也可以調節(jié)卵巢癌細胞的轉移。

綜上所述，MED1在卵巢癌細胞的生長以及轉移過程中起到重要的作用。MED1的沉默表達能夠抑制卵巢癌細胞的生長以及轉移，對治療卵巢癌具有十分重要的意義。

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Effect of the expression MED1 on ovarian cell

Yuanhui ZHENG,Nannan DONG
Department of Basic Medicine,Ji'nan Evidence Based Medical Science Research Center of Shandong,Ji'nan 250022,China

ObjectiveTo explore the effect of the expression MED1 on the cell growth,migration and invasion abilities was studied.MethodsBased on the MTT experiments,cell clones experiments,the analysis of cell cycle experiments by Flow Cytometry,Transwell migration and invasion experiments,comparing the MED1 silent and the expression of ovarian cancer in the character of cell growth and the change of cell migration and invasion.ResultsComparing with normal ovarian cancer,the MED1 silent cell growth was inhibited,the number of clones were reduced,cells in G0/G1phase were increased significantly and cells in S phase were reduced,the ability of cells migration and invasion was reduced.ConclusionSilencing the expression of MED1 can effectively inhibit ovarian cancer cell growth and migration,which layed the foundation for the development of targeted drugs to treat ovarian cancer.

MED1; Ovarian cancer; Growth characteristics of the cells