葡萄膜黑色素瘤差異表達基因的富集分析

孫曉雨 楊春花

葡萄膜黑色素瘤差異表達基因的富集分析

孫曉雨 楊春花

目的從基因轉(zhuǎn)錄組水平揭示葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機制，為臨床診療提供新工具。方法在公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO中找到葡萄膜黑色素瘤的相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)以2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換及標準化處理后，找到黑色素瘤中的差異表達基因。通過DAVID基因功能注釋和功能分類對這些基因進行生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果在葡萄膜黑色素瘤組織中共找到265個差異表達基因，包括上調(diào)基因95個，下調(diào)基因170個。基因富集分析結(jié)果顯示，這些基因的功能大致分為細胞運輸、細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞周期、信號識別及轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化調(diào)控等。結(jié)論利用生物信息學(xué)的方法能有效分析基因芯片數(shù)據(jù)并獲取生物內(nèi)在信息，黑色素瘤組織中多種基因的表達發(fā)生了改變，為確定黑色素瘤的早期診斷標志與新治療靶位提供了新的思路。

葡萄膜黑色素瘤；差異表達；基因芯片；GEO；生物信息學(xué)

作者單位：250022 濟南，山東濟南循證醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部

視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma,Rb）是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤[1]，對視力和生命均構(gòu)成了嚴重的威脅和危害。葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma），是成年人眼部發(fā)病率最高的惡性腫瘤，主要來源于葡萄膜黑色素細胞，具有增殖活性高和易于轉(zhuǎn)移等特點，容易與許多眼底疾病混淆。葡萄膜黑色素瘤的死亡率很高，主要原因是通過血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率很高，主要致死原因是肝臟轉(zhuǎn)移[2]。一旦確診腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，數(shù)月內(nèi)可致患者死亡[3]。鑒于其惡性程度高，是否能做到早期診斷對挽救患者的生命顯得尤為重要。

近年的研究證明，一些分子途徑與葡萄膜黑色素瘤的進展有關(guān)，其中GNAQ基因、GNA11基因、干細胞因子受體（c-Kit）、肝細胞生長因子（c-Met）以及微小RNA（miR34a）都通過調(diào)節(jié)特定的分子途徑影響腫瘤的進展[4-6]。張旭等[7]在高侵襲轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白的表達水平明顯升高，可作為預(yù)測葡萄膜黑色素瘤侵襲能力、轉(zhuǎn)移潛能以及患者預(yù)后的指標。但是并未進行轉(zhuǎn)錄組水平的高通量檢測，其應(yīng)用仍有較長的距離。

因此，為了給黑色素瘤的防治提供篩查標志及新的治療靶點，從基因轉(zhuǎn)錄組水平揭示其發(fā)病機制至關(guān)重要?；蛐酒鳛橐环N高效、大規(guī)模獲取生物信息的技術(shù)，能檢測和分析腫瘤組織與正常組織的差異表達基因。本研究利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO中的芯片數(shù)據(jù)，對黑色素瘤的相關(guān)基因挖掘并進行生物信息學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 基因表達數(shù)據(jù) 在GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中選擇GSE24673芯片數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析。GSE24673由Krishnakumar等人提供，芯片平臺為GPL6244（Human Gene 1.0 ST Arrays）。本研究對該平臺的所有樣本進行分析，分別是GSM607938、GSM607939、GSM607940、GSM607941、GSM607942、GSM607943、GSM607944、GSM607945、GSM607946、GSM607947和GSM607948。

1.2 實驗過程 實驗類型為芯片表達分析。實驗中對原發(fā)性視網(wǎng)膜腫瘤中退化的和分裂的RNA樣品進行了轉(zhuǎn)錄組分析。全局基因表達譜分析在對視網(wǎng)膜細胞瘤的早期診斷標記的確定方面具有巨大的應(yīng)用前景。實驗中分析了3個原發(fā)性視網(wǎng)膜腫瘤組織（一式三份）和2個正常健康成年人的視網(wǎng)膜組織中的基因表達水平。視網(wǎng)膜細胞瘤RNA的用量使用納克級別，在Human Gene 1.0 ST Arrays進行處理。該芯片數(shù)據(jù)含實驗組9個，GSM607947和GSM607948作為對照組，參照人類健康視網(wǎng)膜組織中全轉(zhuǎn)錄本。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達基因的篩選 使用GEO2R讀取芯片數(shù)據(jù)[8]，得到28,869條基因數(shù)據(jù)，對表達數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，使基因的表達值轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布。之后對數(shù)據(jù)進行過濾及分位數(shù)法標準化。

limma包用于R分析差異表達基因，該模型將標準及信號強度的關(guān)系使用線性模型進一步強化，基于貝葉斯方法來確定差異表達基因，準確率較高，是目前使用最廣泛的方法[9]。利用limma包提取線性模型中的差異表達基因，運用t檢驗（公式1）判斷對照組和實驗組基因的表達差異是否具有顯著性。

其中均值

方差

式中ni為某一條件下的實驗重復(fù)次數(shù)，Xij為某基因在第i個條件下第j次重復(fù)實驗的表達水平測量值。根據(jù)統(tǒng)計量t值，得到P值。若P值小于0.05則認為某基因在兩個不同條件下表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

運用Benjamini&Hochberg算法[10]對樣本P值進行多重檢驗FDR校正（閾值為0.05）（公式2）。篩選|logFC|＞2且P＜0.05的基因視為差異表達基因。

公式中V表示不可觀察的隨機變量，R表示可觀察的隨機變量。

1.4 差異表達基因的富集分析 將得到的差異表達基因通過Fisher精確檢驗（FisherExact Test）進行富集分析，找到這些基因的功能特點及可能參與的生物學(xué)過程，富集分析對應(yīng)的公式為：

上式中，N表示芯片上所有基因總數(shù)，n表示N中差異表達基因的總數(shù)，M表示N中屬于某個GO term的基因個數(shù)，k表示n中屬于某個GO term的基因個數(shù)。P值表示差異表達基因富集到這個GO term上的可信程度，本實驗設(shè)定P小于閾值0.05時，認為差異表達基因顯著性的富集到這個GO term上。

本實驗對差異表達基因從功能分類（functional categories）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（protein domains）兩個方面進行生物學(xué)分析。

1.5 差異表達基因的聚類分析 應(yīng)用DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）[11]中Functional Annotation Clustering，利用EASE檢驗對差異表達基因進行聚類分析，確定具有相同表達模式的基因，從而預(yù)測這些差異表達基因與黑色素瘤發(fā)生的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因的篩選結(jié)果 使用GEO2R在線軟件對芯片中的數(shù)據(jù)進行差異表達分析，共篩選得到265個滿足條件的差異表達基因，包括上調(diào)基因95個，下調(diào)基因170個。圖1列舉了前20個差異表達較顯著的基因，主要有：DCT（P=2.4E-08）、GUCY2F（P=9.9E-08）、TOP2A（P=3.3E-06）、PRAME（P=4.3E-04）、PVALB（P=6.9E-11）、RHO（P=2.4E-04）等。以基因DCT、DTL、GUCY2F和SLC4A10為例，其在實驗組與對照組中的表達值的變化見圖2。

2.2 差異表達基因的富集分析結(jié)果 通過Fisher檢驗富集分析，結(jié)合Functional categories信息（表1），發(fā)現(xiàn)這些基因的功能分類主要包含細胞分裂（P=4.57E-07,Count=16,7%）、細胞周期（P=9.7E-08,Count=22,9.7%）、細胞骨架（P=4.4E-04,Count=19,8.4%）、離子運輸（P=4.09E-04,Count=18,7.9%）、信號識別及傳導(dǎo)（P=4.09E-04,Count=53,23.3%）等。

根據(jù)Protein domains的數(shù)據(jù)庫信息（表2），發(fā)現(xiàn)這些基因的蛋白結(jié)構(gòu)域主要包括驅(qū)動蛋白保守位點（P=1.7E-03,Count=5,2.2%）、神經(jīng)遞質(zhì)離子通道跨膜區(qū)域（P=2.2E-03,Count=5,2.2%）、配體結(jié)合區(qū)域（P=2.2E-03,Count=5,2.2%）、離子通道保守位點（P=2.3E-03,Count=5,2.2%）、r-氨基丁酸A受體（P=2.6E-03,Count=4,1.8%）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性中心（P=0.01,Count=11,4.8%）等。

2.3 差異表達基因的聚類分析結(jié)果 通過Functional Annotation Clustering對差異表達基因進行聚類分析，設(shè)置Kappa Similarity Threshold為0.5且EASE為0.001時，差異表達基因的功能共分為8類。第一類為信號識別及傳導(dǎo)（Enrichment Score=7.3），第二類為細胞周期（Enrichment Score=6.1），第三類為細胞組成（Enrichment Score=5），第四類為細胞骨架（Enrichment Score=4.6），第五類為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Enrichment Score=4.4），第六類為光傳導(dǎo)（Enrichment Score=4），第七類為離子運輸（Enrichment Score=3.6），第八類為細胞分化負調(diào)控（Enrichment Score=3.3）。

3 討論

通過對芯片數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換及標準化處理并運用Benjamini&Hochberg算法對樣本P值進行多重檢驗FDR校正后，共找到265個差異表達基因。通過DAVID基因功能注釋和功能分類對這些基因進行生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因可能涉及到的生物學(xué)過程有：物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞周期、信號識別及傳導(dǎo)、細胞分化調(diào)控等，與癌癥相關(guān)的已知通路大體吻合。下面就這5方面對黑色素瘤的差異表達基因做一詳細分析。

圖1 黑色素瘤中差異表達較顯著的前20個基因

圖2 實驗組與對照組中基因DCT（A）、DTL（B）、GUCY2F（C）和SLC4A10（D）的表達值的變化

在細胞物質(zhì)運輸過程中，編碼離子通道亞單位的基因發(fā)生突變或表達異?；蝮w內(nèi)出現(xiàn)針對通道的病理性內(nèi)源性物質(zhì)時，通道的功能將出現(xiàn)不同程度的削弱或增強，從而導(dǎo)致機體整體生理功能的紊亂[12,13]。SLC38A5、SLC24A1、SLC4A10、GABRG1、KCNT2、KCNJ13、HCN1、TRPM1、CNGB1、CACNG4、SCN7A等基因在HCO3–、Cl–、K+、Ca2+、Na+等離子的跨膜運輸中起著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運調(diào)控作用。其中，是機體最重要的pH緩沖體系的組成部分，它可以加速CO2的清除，調(diào)節(jié)細胞和整個機體的pH，調(diào)控液體的流動以及酸堿分泌等[14]。SLC4家族（solute carrier 4 family）的鈉離子偶聯(lián)碳酸氫根轉(zhuǎn)運蛋白NCBT（Nacoupled HCO3–transporter）在細胞pH調(diào)控以及的跨上皮細胞轉(zhuǎn)運中具有重要作用。Parker[15]曾研究報道，由SLC4A10基因編碼的NBCn2是一種電中性的鈉離子偶聯(lián)的碳酸氫根轉(zhuǎn)運體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達極為豐富，對于神經(jīng)元的pH調(diào)控和腦脊液的產(chǎn)生等都具有重要的生理學(xué)作用。而NBCn2功能失常與癲癇、智障等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[16]。本研究中，SLC4A10在黑色素腫瘤細胞中低表達，說明HCO3–在黑色素細胞的轉(zhuǎn)運過程受到了阻礙，造成細胞生長環(huán)境失調(diào)，對細胞的腫瘤化有一定影響。

表1 差異表達基因的功能分類

微管是細胞骨架結(jié)構(gòu)的主要組成部分，由α、β-微管蛋白異二聚體組成。微管在細胞分裂中具有極其重要的作用，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點之一。此外，α、β-微管蛋白表達異常與細胞的癌變密切相關(guān)。Giarnieri等[17]研究發(fā)現(xiàn)，α、β-微管蛋白的表達與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。應(yīng)榮彪等[18]在乳腺非典型增生及導(dǎo)管內(nèi)癌中發(fā)現(xiàn)α、β-微管蛋白均出現(xiàn)過度表達。本研究中，與此相關(guān)的基因KIFC1、KIF4A、PRC1、NEK2、TTK等均呈上調(diào)表達，推測這些基因的異常表達促進了細胞惡變和癌變的進展。

表2 差異表達基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。TOP2A、KIF家族（KIF14、KIF17等）、WEE1、MCM6等基因在細胞有絲分裂、減數(shù)分裂和胞質(zhì)分裂過程中起重要作用。TOP2A編碼的拓撲異構(gòu)酶II能夠在細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂期間正確分離子染色體[19]，若表達異常，可致細胞分裂紊亂。也有報道稱有絲分裂驅(qū)動蛋白KIF14過表達與一系列人類癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。楊濤等[20]在研究肝細胞肝癌組織中KIF14表達與臨床變量的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，KIF14過表達不利于手術(shù)預(yù)后，因此KIF14可作為手術(shù)預(yù)后評估的重要指標及潛在治療靶點。WEE1基因編碼產(chǎn)物是一種酪氨酸激酶的核蛋白，屬于蛋白激酶中絲氨酸/蘇氨酸家族的一員，是調(diào)控細胞周期G2期阻滯的關(guān)鍵元件，參與細胞有絲分裂前期的DNA復(fù)制及損傷修復(fù)過程[21]。MCM6（minichromosome maintenance protein 6）是微小染色體維持蛋白MCM家族的一員，存在于所有的真核細胞中，是DNA復(fù)制和延伸的關(guān)鍵蛋白，被認為是特異性細胞增殖相關(guān)因子[22,23]。本研究中，WEE1基因在黑色素腫瘤細胞中呈上調(diào)表達，說明其參與的DNA的修復(fù)異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可作為診斷早期黑色素瘤的候選基因，并為黑色素瘤的靶向分子治療提供生物學(xué)依據(jù)。MCM6在黑色素瘤組織中高表達，說明其參與的DNA的復(fù)制異常與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，可作為預(yù)防、診斷黑色素瘤的一個標記物。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常在腫瘤形成及發(fā)展的各個階段都有十分重要的意義。參與腫瘤生長調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因有GUCY2F、GNAT1、ABLIM1、ABCA8等，在黑色素瘤組織中的表達均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。Wood等[24]發(fā)現(xiàn)基因GUCY2F、EPHA3和NTRK3的低表達與乳腺癌、肺癌和胰腺癌組織細胞的惡性增殖有關(guān)。GUCY2F編碼的鳥苷酸環(huán)化酶 （soluble guanylate cyclase,sGC）作為NO受體催化細胞內(nèi)的GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，從而為蛋白激酶、磷酸二酯酶以及離子通道的調(diào)節(jié)提供第二信使。一旦NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，將會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如多種心血管疾?。ㄈ绶蝿用}高血壓、心力衰竭、動脈粥樣硬化和再狹窄等）及神經(jīng)退行性疾病等。表明GUCY2F可作為黑色素瘤的診斷標志和治療干預(yù)的靶位。

黑色素瘤特異性抗原基因（preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME）的表達主要局限于腫瘤細胞，抑制視黃酸信號受體的活性。視黃酸與受體結(jié)合之后，起始與細胞增殖抑制、細胞分化、細胞凋亡有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。據(jù)Gudas等[25]報道，PRAME可調(diào)控干細胞的分化。此外，Epping等[26,27]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PRAME對視黃酸信號受體的活性，將導(dǎo)致細胞的癌變及腫瘤的發(fā)展。本研究中，PRAME過表達異常顯著（logFC=4.19），鑒于PRAME在腫瘤中的高水平表達，分析這種蛋白質(zhì)在這些病變中的預(yù)后作用將是一項有意義的工作。

綜上所述，本研究表明利用生物信息學(xué)的方法能有效地分析基因芯片數(shù)據(jù)，從而高效、大規(guī)模地獲取生物內(nèi)在信息；揭示黑色素瘤的發(fā)生是由于多種基因表達異常所致，為確定黑色素瘤的早期診斷標志與新治療靶位提供了新的思路。

1 李鳳鳴.眼科全書.北京: 人民衛(wèi)生出版社,1996: 2381-2390.

2 吳中耀.現(xiàn)代眼腫瘤眼眶病學(xué).北京: 人民軍醫(yī)出版社,2002:251-272.

3 Egan KM,Seddon JM,Glynn RJ,et al.Epidemlologic aspects of uvel melanoma.Surv Ophthalmol,1988,32(4):239-251.

4 Van Raamsdonk CD,Griewank KG,Crosby MB,et al.Mutations in GNA11 in uveal melanoma.N Engl J Med,2010,363(23): 2191-2199.

5 All-Ericsson C,Girnita L,Muller-Brunotte A,et al.C-Kitdependent growth of uveal melanoma cells: a potential therapeutic target? Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(7):2075-2082.

6 Ye M,Hu D,Tu L,et al.Involvement of P13K/Akt signaling pathway in hepatocyte growth factor-induced migration of uveal melanoma cells.Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(2): 497-504.

7 張旭,頊曉琳,李彬,等.骨橋蛋白在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能葡萄膜黑色素瘤中的表達及意義.中華實驗眼科雜志,2012,30(3):199-203.

8 Tanya B,Stephen EW,Pierre L,et al.NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update.Nucleic Acids Res,2013,41(D1): D991-D995.

9 Smyth G.Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.Stat Appl Genet Mol Biol,2004,3: Article3.

10 Benjamini Y,Hochberg Y.Controlling the false discovery rate - a practical and powerful approach to multiple testing.J R Stat Soc B Met,1995,57(1): 289-300.

11 Dennis G Jr,Sherman BT,Hosack DA,et al.DAVID:Database for annotation,visualization,and integrated discovery.Genome Biol,2003,4(5): P3.

12 Chahine M,Chatelier A,Babich O,et al.Voltage-gated sodium channels in neurological disorders.CNS Neurol Disord Drug Targets,2008,7(2): 144-158.

13 Lossin C.A catalog of SCN1A variants.Brain Dev,2009,31(2): 114-130.

14 Romero MF,Fulton CM,Boron WF.The SLC4 family oftransporters.Pflugers Arch,2004,447(5): 495-509.

15 Parker MD,Musa-Aziz R,Rojas JD,et al.Characterization of human SLC4A10 as an electroneutral Na/HCO3cotransporter (NBCn2) with Cl-self-exchange activity.J Biol Chem,2008,283(19): 12777-12788.

16 Jacobs S,Ruusuvuori E,Sipila ST,et al.Mice with targeted Slc4a10 gene disruption have small brain ventricles and show reduced neuronal excitability.Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(1): 311-316.

17 Giarnieri E,De Francesco G,Carico E,et al.Alpha- and beta-tubulin expression in rectal cancer development.Anticancer Res,2005,25(5): 3237-3241.

18 應(yīng)榮彪,馮俊,李建軍,等.α、β-微管蛋白在乳腺癌變不同階段的表達及意義.中國癌癥雜志,2011,21(8): 595-598.

19 Sakaguchi A,Kikuchi A.Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase.J Cell Sci,2004,117(Pt 7): 1047-1054.

20 楊濤,孫軼飛,王立偉,等.KIF14過表達與肝細胞肝癌手術(shù)預(yù)后密切相關(guān).河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,35(3): 263-265.

21 Cozzi M,Giorgi F,Marcelli E,et al.Antitumor activity of new pyrazolo[3,4-d] pyrimidine SRC kinase inhibitors in Burkitt lymphoma cell lines and its enhancement by WEE1 inhibition.Cell Cycle,2012,11(5): 1029-1039.

22 Chong JP,Mahbubani HM,Khoo CY,et al.Purification of an MCM-containing complex as a component of the DNA replication licensing system.Nature,1995,375(6530):418-421.

23 Labib K,Tercero JA,Diffley JF,et al.Uninterrupted MCM2-7 function required for DNA replication fork progression.Science,2000,288(5471): 1643-1647.

24 Wood LD,Calhoun ES,Silliman N,et al.Somatic mutations of GUCY2F,EPHA3,and NTRK3 in human cancers.Hum Mutat,2006,27(10): 1060-1061.

25 Gudas LJ,Wagner JA.Retinoids regulate stem cell differentiation.J Cell Physiol,2011,226(6): 322-330.

26 Epping MT,Wang L,Edel MJ,et al.The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling.Cell,2005,122(6): 835-847.

27 Epping MT,Bernards R.A causal role for the human tumor antigen preferentially expressed antigen of melanoma in cancer.Cancer Res,2006,66(22):10639-10642.

Enrichment analysis of uveal melanoma-related differential expression genes

Xiaoyu SUN,Chunhua YANG Department of Basic Medicine,Ji'nan Evidence Based Medical Science Research Center of Shandong,Ji'nan 250022,China

ObjectiveTo better understand the molecular pathogenesis of uveal melanoma,and provide novel means for clinical diagnosis and treatment of this malignancy.MethodsThe gene chip data of uveal melanoma were obtained from GEO database and statistically analyzed after log2transformation and normalization to identify the differential expression genes related to uveal melanoma,follewed by bioinformatics analysis through functional annotation and functional clustering of DAVID.ResultsTwo hundred and sixty-five differentially expressed genes were identified in uveal melanoma samples,including 95 up-regulated and 170 downregulated genes.These genes were associated with the cellular transportation,cell skeletons,cell cycles,signal recognition and transduction and nervous system regulation.ConclusionBioinformatics analysis can contribute to analyzing the gene chip data effectively.The pathogenesis of uveal melanoma involves abnormal expression of multiple genes,and these data may benefit further investigations of the early diagnosis and treatment of the malignancy.

Uveal melanoma; Differential expression; Gene chip; GEO; Bioinformatics