耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機(jī)制研究

李玲 周飛

耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機(jī)制研究

李玲 周飛

目的探討耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機(jī)制。方法選取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹諾酮類銅綠假單胞菌株，采用PCR技術(shù)培養(yǎng)，并將培養(yǎng)收集的菌株點(diǎn)狀種植在平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基是由制備的耐喹諾酮類藥物組成。對(duì)耐藥銅綠假單胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；將100例培養(yǎng)的銅綠假單胞菌株培養(yǎng)液，每份分為等量?jī)煞荩糠?00例），并將所有的銅綠假單胞菌株接種在含有耐喹諾酮類藥物的平板培養(yǎng)基上，其中一份接受常規(guī)培養(yǎng)，為對(duì)照組，一份放入含有羰基氫氯苯腙（carbonyl hydroch lorophenylhydrazone,CCCP）培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，為觀察組，對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析。結(jié)果gyrA的基因表達(dá)率為75.00%，parC的基因表達(dá)率為74.00%，明顯高于gyrB的基因表達(dá)率（23.00%）和parE的基因表達(dá)率（22.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組中存活菌株數(shù)48例（48.00%），明顯低于對(duì)照組［70例（70.00%）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05） 。結(jié)論銅綠假單胞菌耐喹諾酮類藥物的主要機(jī)制是gyrA、parC兩種基因的表達(dá)，其次銅綠假單胞菌的主動(dòng)泵出系統(tǒng)也是其耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制。在臨床中應(yīng)熟悉菌株的耐藥機(jī)制，選擇合理的抗菌藥物，可降低臨床用藥的不良事件的危險(xiǎn)性，提高治療療效，延長(zhǎng)抗菌藥物的使用壽命。

反耐喹諾酮類；銅綠假單胞菌；耐藥

作者單位：528459 中山，中山市板芙醫(yī)院

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PAE）是臨床上引起感染較為多見的病原菌之一，也是造成醫(yī)院嚴(yán)重感染和常見的致病條件菌，且感染率在近幾十年呈逐漸上升的趨勢(shì)[1]。隨著喹諾酮類廣譜抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，使得控制、治療銅綠假單胞菌引起的感染變得尤為困難[2]。目前臨床公認(rèn)為銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制包括外膜孔蛋白的通透性下降、藥物作用的靶位改變、外排泵的主動(dòng)外排及由介質(zhì)介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[3]。而由染色體介導(dǎo)引起的對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性只能由親代垂直傳給子代，且具有在不同菌株間不易傳播及傳播速度慢等特點(diǎn)[4]。但是近幾年銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物的耐藥上升速度較快，故可能發(fā)生由可移動(dòng)元件如質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[5]。為了研究耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥分子機(jī)制，為臨床選擇合理用藥提供理論基礎(chǔ)，本研究對(duì)100株耐喹諾酮類銅綠假單胞菌進(jìn)行喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹諾酮類銅綠假單胞菌株，其中30株標(biāo)本從患者的痰液中分離，30株標(biāo)本從患者的胸水中分離，20株標(biāo)本從患者的血液中分離，20株標(biāo)本從患者的尿液中分離。所有的菌株均經(jīng)VITEK-AMS鑒定，最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）均≥4 μg/mL。質(zhì)控菌株均為銅綠假單胞菌株。

1.2 方法 對(duì)收集的100株耐喹諾酮類銅綠假單胞菌采用PCR技術(shù)培養(yǎng)，并將培養(yǎng)收集的菌株點(diǎn)狀種植在平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基由制備的耐喹諾酮類藥物組成。對(duì)耐藥銅綠假單胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

將100例培養(yǎng)的銅綠假單胞菌株培養(yǎng)液，每份分為等量?jī)煞荩糠?00例），并將所有的銅綠假單胞菌株接種在含有耐喹諾酮類藥物的平板培養(yǎng)基上，其中一份接受常規(guī)培養(yǎng)，為對(duì)照組，一份放入含有羰基氫氯苯腙（carbonyl hydrochlorophenylhydrazone,CCCP）培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，為觀察組，并將濃度增加至5 mg/L（此濃度對(duì)抑制外排泵可起到有效的作用，但對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無抑制作用），在檢測(cè)CCCP存在的基礎(chǔ)上，觀察兩組中銅綠假單胞菌株的生長(zhǎng)作用。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察、檢測(cè)并比較所有培養(yǎng)基中g(shù)yrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)情況、加入CCCP后各菌株的生存情況及gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1gyrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)情況比較gyrA的基因表達(dá)率為75.00%，parC的基因表達(dá)率為74.00%，明顯高于gyrB的基因表達(dá)率（23.00%）和parE的基因表達(dá)率（22.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組銅綠假單胞菌株生長(zhǎng)情況的比較 觀察組中存活菌株數(shù)48例（48.00%），明顯低于對(duì)照組［70例（70.00%）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 100例培養(yǎng)基中g(shù)yrA、gyrB、parC和parE基因的表達(dá)比較

表2 兩組樣本中銅綠假單胞菌株生長(zhǎng)情況比較

3 討論

銅綠假單胞菌是目前醫(yī)院內(nèi)引起嚴(yán)重感染的主要病原菌之一，臨床資料[6]表明被銅綠假單胞菌感染的患者預(yù)后較差。隨著社會(huì)的發(fā)展、生活水平的提高及人們的健康理念的增強(qiáng)，抗生素在臨床廣泛應(yīng)用，甚至達(dá)到濫用的程度，引起銅綠假單胞菌對(duì)多種廣譜抗菌藥物逐漸產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致感染較難控制，對(duì)治療效果造成影響。隨著耐藥機(jī)制研究的不斷深入，銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制是使靶位點(diǎn)出現(xiàn)改變及外排泵的主動(dòng)外排和由介質(zhì)介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[7]。其中靶位點(diǎn)的主要改變包括編碼DNA促旋酶的gyrA及gyrB基因和編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV上的parC和parE基因突變。主動(dòng)泵出系統(tǒng)的組成成分包括連接蛋白、外膜蛋白及內(nèi)膜蛋白，而外排泵抑制劑CCCCP可有效抑制銅綠假單胞菌的主動(dòng)泵出系統(tǒng)[8]。

本研究中，通過對(duì)100例銅綠假單胞菌株采取常規(guī)培養(yǎng)，并對(duì)染色體介導(dǎo)的gyrA、gyrB、parC和parE耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果示：gyrA的基因表達(dá)率為75.00%，parC的基因表達(dá)率為74.00%，明顯高于gyrB基因（23.00%）和parE基因（22.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。編碼DNA促旋酶中的gyrA、parC基因存在高表達(dá)，這表明銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性的發(fā)生和gyrA、parC的基因突變有較大的關(guān)聯(lián)及臨床指導(dǎo)意義。因CCCP可有效抑制主動(dòng)泵出系統(tǒng)，故在加入CCCP的觀察組樣本中，耐藥菌的生存率明顯低于未加入CCCP的對(duì)照組，本研究結(jié)果顯示：觀察組中存活菌株數(shù)48例（48.00%），明顯低于對(duì)照組［70例（70.00%）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢娿~綠假單胞菌的主動(dòng)泵出系統(tǒng)也是銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要因素。

有文獻(xiàn)[9]報(bào)道在編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV上的parC和parE基因的表達(dá)量和銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物耐藥性的相關(guān)性研究中，他們之間呈明顯相關(guān)性，有明顯的臨床指導(dǎo)意義，故公認(rèn)為編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV上的parC和parE基因的突變也是引起銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。而喹諾酮類藥物作用的包括拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA旋轉(zhuǎn)酶，這兩個(gè)酶均是細(xì)菌正常生長(zhǎng)所必需的酶，兩者中任何一種酶受到破壞或抑制均會(huì)對(duì)細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)造成影響，引起細(xì)菌死亡[10]。DNA旋轉(zhuǎn)酶屬于II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，可催化閉環(huán)DNA負(fù)螺旋化，是ATP酶的能量依賴性酶，其組成成分包括CyrA、CyrB，分別是由gyrA、gyrB基因編碼。CyrB可連接ATP參與能量傳遞，而CyrA可介導(dǎo)DNA發(fā)生斷裂，其再與DNA連接，是DNA復(fù)制過程中所必需的酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV組成結(jié)構(gòu)包括2個(gè)E亞單位和2個(gè)C亞單位，所對(duì)應(yīng)的基因編碼分別為parE和parC，二者蛋白質(zhì)在核酸序列及氨基酸序列上均與DNA旋轉(zhuǎn)酶相似。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA旋轉(zhuǎn)酶的變異可引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類廣譜抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。而這些耐藥編碼基因gyrA、gyrB、parC和parE在氨基酸的序列及核苷酸順序上均有很大的相似性。在gyrA和parC基因中存在一個(gè)被命名為熱點(diǎn)的喹諾酮類耐藥決定區(qū)（quinolone resislance determining,QRDR）[11]。有文獻(xiàn)[12,13]在對(duì)銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的研究中發(fā)現(xiàn)，熱點(diǎn)是gyrA內(nèi)87位的門冬氨酸及83位的絲氨酸及parC內(nèi)83位門冬氨酸和79位的絲氨酸。正是因?yàn)檫@些氨基酸的改變而引起細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性及敏感性下降。而細(xì)菌的gyrB、parE編碼基因較少發(fā)生突變[14,15]。

綜上所述，銅綠假單胞菌耐喹諾酮類藥物的主要機(jī)制是gyrA、parC兩種基因的表達(dá)，其次銅綠假單胞菌的主動(dòng)泵出系統(tǒng)，故在臨床中應(yīng)熟悉菌株的耐藥機(jī)制，選擇合理的抗菌藥物，可降低臨床用藥的不良事件的危險(xiǎn)性，提高治療療效，延長(zhǎng)抗菌藥物的使用壽命。

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Study on molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa

Ling LI,Fei ZHOU
Banfu Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528459,China

ObjectiveTo study the molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa.MethodsFrom January 2013 to July 2015 in Banfu Hospital of Zhongshan City,100 strains of quinolone-resistantPseudomonas aeruginosawere cultured by PCR and the collected strains were planted on plate culture medium.The medium was composed of quinolones.The expressions ofgyrA,gyrB,parCandparEgenes in resistantPseudomonas aeruginosastrains were detected.The resistant strains were analyzed by adding carbonyl hydrochlorophenylhydrazone (CCCP).ResultsThe gene expression rate ofgyrAwas 75.00%; the gene expression rate ofparCwas 74.00%,which was significantly higher than that ofgyrBgene (23.00%) andparEgene(22.00%),with significant differences (P＜0.05).The number of viable strains in the observation group (48.00%)was significantly lower than that in the control group (70.00%),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe main mechanism of quinolones is the expression ofgyrAandparC,and the active pumping system ofPseudomonas aeruginosais also an important mechanism of drug resistance.Therefore,be familiar with the drug resistance mechanism and a reasonable antimicrobial drugs selection could reduce the risk of adverse events and improve the clinical efficacy.

Quinolones;Pseudomonas aeruginosa; Drug resistance