蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的表達(dá)量與血清生殖激素水平的相關(guān)分析

武鶴松，張利平，余安妮，鄧惜緣

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

遺傳育種與繁殖

蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的表達(dá)量與血清生殖激素水平的相關(guān)分析

武鶴松，張利平，余安妮，鄧惜緣

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

為研究不同季節(jié)蒙古羊卵巢中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB（bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）基因的表達(dá)與血清中生殖激素的關(guān)聯(lián)性，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定了蒙古羊血清中促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體素（luteinizing hormone，LH）的濃度，對(duì)不同季節(jié)蒙古羊卵巢組織中BMPR-IB基因的表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）分析。結(jié)果表明：發(fā)情季節(jié)（11月份）蒙古羊血液中FSH和LH的濃度均高于非發(fā)情季節(jié)（4月份），非發(fā)情季節(jié)蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的表達(dá)量極顯著高于發(fā)情季節(jié)（P＜0.01）。說(shuō)明蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的表達(dá)量與血液激素水平有呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。

蒙古羊；BMPR-IB基因；血清；激素

在養(yǎng)羊業(yè)中，綿羊的繁殖力和經(jīng)濟(jì)效益直接相關(guān)，然而繁殖性狀受多個(gè)遺傳因素與環(huán)境因素的綜合影響，其中產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)低遺傳力的閾性狀，其遺傳力只有0.1左右，難以用常規(guī)的育種方法在短時(shí)間內(nèi)提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)，因此研究人員從基因、蛋白等方面對(duì)綿羊進(jìn)行選育，以期選育出雙羔或多羔品種，且同時(shí)縮短育種年限。

BMPR-IB基因是由Davis等在Booroola美利奴羊中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)多羔主效基因，該基因能夠在動(dòng)物多個(gè)組織器官中表達(dá)，如性腺軸、腦、骨骼肌等，主要在卵巢中表達(dá)［1-3］。綿羊BMPR-IB基因發(fā)生A746G突變（FecB突變），導(dǎo)致第249位氨基酸由谷氨酰胺（Q）轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔≧），進(jìn)而使綿羊排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)顯著增加［4-6］。1989年，該突變基因被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)命名為FecB基因（即 Fec=fecundity，B=Booroola），它對(duì)排卵數(shù)呈顯性加性效應(yīng)，在FecB三種基因型中，突變純合型（BB）平均排卵數(shù)可增加3枚，使平均產(chǎn)羔數(shù)增加1.5只；突變雜合型（B+）平均排卵數(shù)可增加1.5枚，使平均產(chǎn)羔數(shù)增加1.0只，即BB型（突變型）＞B+型（雜合型）＞++型（野生型）［7］。

雌性動(dòng)物的性周期和生殖活動(dòng)受性腺軸激素的調(diào)控，不同繁殖時(shí)期的生殖激素分泌水平不同，而生殖激素濃度的差異影響動(dòng)物的繁殖力［8］。FSH和LH都是由腦垂體嗜堿性細(xì)胞合成并釋放的一種糖蛋白類(lèi)激素，都能夠促進(jìn)卵細(xì)胞的發(fā)育、成熟和排出。FSH能夠促進(jìn)卵泡的顆粒細(xì)胞增生與分化，以及卵泡液分泌。LH還能促進(jìn)雌激素的分泌從而引起雌性動(dòng)物的正常發(fā)情［9］。有研究表明，BMPR-IB基因不同基因型Booroola母羊血液中 FSH 和 LH 含量有差異［10-11］。祁云霞等［12］研究發(fā)現(xiàn)，巴美肉羊血清FSH和LH濃度升高，導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)增加。為了解不同時(shí)期蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因mRNA的表達(dá)量和血液中FSH和LH的濃度變化是否存在某種相關(guān)，進(jìn)一步探討該基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控產(chǎn)羔性狀的機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)不同季節(jié)蒙古羊卵巢組織BMPR-IB基因的表達(dá)量與血液中生殖激素水平的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，以期為綿羊繁殖力機(jī)理的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

試驗(yàn)羊均為蒙古羊經(jīng)產(chǎn)母羊，年齡均2～3歲，且未經(jīng)激素處理，飼養(yǎng)條件和管理?xiàng)l件均一致。隨機(jī)選取蒙古羊單、雙羔母羊各3只，在發(fā)情季節(jié)（11月份）和非發(fā)情季節(jié)（4月份）分別經(jīng)頸靜脈采集血液5 mL，采血時(shí)間均為早上9：00—10：00。血液采集后室溫斜面靜置，待凝固后分離血清，存放于冰箱-20℃保存。在乏情季節(jié)隨機(jī)選取蒙古羊單、雙羔母羊各2只，發(fā)情季節(jié)隨機(jī)選取蒙古羊單羔母羊2只、雙羔母羊1只，頸靜脈放血后采集卵巢組織置于液氮中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Taq DNA聚合酶均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司，DNA Marker和RNase-freewater由北京全式金生物（TransGen Biotech）提供，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄

按照RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取卵巢組織總RNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)A260/A280在1.8～2.0之間的RNA樣品的完整性。采用大連寶生物公司Prime-Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒的兩步法將前一步中提取的綿羊卵巢組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃冰箱中保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照王靜［13］的方法設(shè)計(jì)BMPR-IB基因突變位點(diǎn)的特異性引物，引物信息見(jiàn)表1。使用Roche Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)總體系為 20 μL：10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ，7 μLddH2O，上下游引物各 0.5 μL，2 μLcDNA。反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 5 min；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)每個(gè)樣品均進(jìn)行4個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過(guò)公式2-△△Ct計(jì)算BMPR-IB基因在不同組織中的表達(dá)量，采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

表1 引物序列

1.5 激素檢測(cè)

使用艾萊薩生物科技（上海）有限公司的FSH和LH的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定，每個(gè)樣本均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將檢測(cè)樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品中2種激素的濃度。測(cè)定結(jié)果用Mean±SE表示，并用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMPR-IB基因mRNA在蒙古羊卵巢組織中的表達(dá)

2.1.1 引物特異性及擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因引物與GAPDH基因引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，條帶單一無(wú)雜帶，可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 BMPR-IB基因mRNA的表達(dá) BMPR-IB基因與內(nèi)參GAPDH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值均一，熔解曲線呈單峰，無(wú)其他雜峰（見(jiàn)圖1～4），說(shuō)明熒光信號(hào)來(lái)源于特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

對(duì)發(fā)情季節(jié)和非發(fā)情季節(jié)蒙古羊單、雙羔母羊卵巢組織BMPR-IB基因的相對(duì)表達(dá)量分析可知，非發(fā)情季節(jié)蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于發(fā)情季節(jié)（P＜0.01），非發(fā)情季節(jié)蒙古羊單羔母羊卵巢BMPR-IB基因的表達(dá)量是雙羔的6倍，發(fā)情季節(jié)蒙古羊單羔母羊BMPR-IB基因的表達(dá)量是雙羔的1.5倍。

2.2 蒙古羊血液中激素的檢測(cè)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 蒙古羊非發(fā)情季節(jié)FSH標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=5.766X-0.388（R2=0.996），發(fā)情季節(jié) FSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=5.997X-0.442（R2=0.997）；非發(fā)情季節(jié) LH 標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8.438X-0.655（R2=0.998），發(fā)情季節(jié)LH標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8.556X-0.688（R2=0.998）?？芍?組標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可用于激素濃度的計(jì)算。

圖1 GAPDH基因熔解曲線1

圖2 蒙古羊BMPR-IB基因熔解曲線1

圖3 GAPDH基因熔解曲線2

圖4 蒙古羊BMPR-IB基因熔解曲線2

2.2.2 蒙古羊血液中FSH和LH的濃度 對(duì)發(fā)情季節(jié)和非發(fā)情季節(jié)蒙古羊血液中FSH和LH濃度分析可知，發(fā)情季節(jié)蒙古羊血液中以上兩種激素濃度均高于非發(fā)情季節(jié)，蒙古羊雙羔母羊血液中這兩種激素的濃度均大于單羔母羊。其中，發(fā)情季節(jié)蒙古羊雙羔母羊血液中FSH濃度極顯著高于單羔母羊（P＜0.01），非發(fā)情季節(jié)蒙古羊雙羔母羊血液中FSH濃度也極顯著高于單羔母羊（P＜0.01）；發(fā)情季節(jié)蒙古羊血液中LH濃度極顯著高于非發(fā)情季節(jié)（P＜0.01），發(fā)情季節(jié)蒙古羊單羔母羊血液中LH濃度與雙羔母羊間差異不顯著（P＞0.05），非發(fā)情季節(jié)蒙古羊單羔母羊血液中LH濃度與雙羔間差異不顯著（P ＞0.05）。

表2 不同季節(jié)蒙古羊血清FSH和LH的濃度ng/mL

3 討論

BMPR-IB是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β亞基（TGF-β）受體家族成員之一，作為一種重要的跨膜受體蛋白，主要參與TGF-β通路，在調(diào)控成骨分化、細(xì)胞擴(kuò)散及卵巢卵泡發(fā)育等過(guò)程中起重要作用，并直接影響綿羊等動(dòng)物的繁殖性狀［14］。FSH和LH與雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育和排卵密切相關(guān)。各種動(dòng)物血漿中LH的水平在卵泡早期比較平穩(wěn)，到達(dá)中期稍有升高，于排卵前達(dá)到最高峰。LH可使卵巢上的卵泡全部破裂，但只有配合FSH時(shí)才能排出成熟卵子［9］。賀建寧等［15］發(fā)現(xiàn)，發(fā)情季節(jié)灘羊血液中 FSH 和LH的分泌量高于非發(fā)情季節(jié)（P＜0.05）；本試驗(yàn)與賀建寧等的研究結(jié)果一致，且發(fā)情季節(jié)和非發(fā)情季節(jié)LH的濃度均高于FSH。何小龍等［16］的研究表明，發(fā)情期蒙古羊卵巢組織中BMPR-IB基因的表達(dá)量是非發(fā)情期的2.65倍；本試驗(yàn)中非發(fā)情季節(jié)蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的表達(dá)量極顯著高于發(fā)情季節(jié)（P＜0.01），這與何小龍等的結(jié)果相反，可能是由于發(fā)情周期中卵巢BMPR-IB基因的表達(dá)量并不一直維持在一個(gè)較高水平，其表達(dá)產(chǎn)物可能在發(fā)情周期不同階段發(fā)揮不同作用，而表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化，也可能是由于羊的個(gè)體差異產(chǎn)生該結(jié)果。蒙古羊?qū)儆诩竟?jié)性發(fā)情，且以產(chǎn)單羔為主，由于BMPR-IB基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)蒙古羊發(fā)情排卵的調(diào)控機(jī)制尚不明確，產(chǎn)生該結(jié)果的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

發(fā)情季節(jié)（11月份）蒙古羊血液中FSH和LH濃度均高于非發(fā)情季節(jié)（4月份）。非發(fā)情季節(jié)蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于發(fā)情季節(jié)（P＜0.01）。說(shuō)明蒙古羊卵巢中BMPR-IB基因的相對(duì)表達(dá)量與血液激素含量有呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。

［1］Davis G H.Fecundity genes in sheep［J］.Animal Reproduction Science，2004，82/83：247-253.

［2］ZhangX，Li W，Wu Y，et al.Disruption of the sheep BMPR-IB gene by CRISPR/Cas9 in in vitro-produced embryos1 ［J］.Theriogenology，2016，91：163-172.

［3］楊華，劉守仁，鐘發(fā)剛，等.BMPR-IB基因在綿羊不同組織的表達(dá)差異性研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2009，45（11）：6-8.

［4］Souza C，Macdougall C C，Campbell B，et al.The Booroola（FecB）phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B（BMPR1B）gene［J］.Journal of Endocrinology，2001，169（2）：1-6.

［5］Wilson T，Wu X Y，Juengel J L，et al.Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor （ALK-6）that is expressed in both oocytes and granulosa cells［J］.Biology of Reproduction，2001，64（4）：1225-1235.

［6］Mulsant P，Schibler L，Monget P，et al.Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merinoewes［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，98（9）：5104-5109.

［7］Montgomery G W，Mcnatty K P，Davis G H.Physiology and molecular genetics of mutations that increase ovulation rate in sheep ［J］.Endocrine Reviews，1992，13（2）：309.

［8］楊利國(guó).動(dòng)物繁殖學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：30-92.

［9］王鋒.動(dòng)物繁殖學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012：48-53.

［10］Fleming J S，Tisdall D J，Greenwood P J，et al.Expression of the genes for alpha inhibin，beta A inhibin and follistatin in the ovaries of Booroola ewes which were homozygotes or non-carriers of the fecundity gene FecB［J］.Journal of Molecular Endocrinology，1992，8（3）：265.

［11］Mcnatty K P，Hudson N，Henderson K M，et al.Differences in gonadotrophin concentrations and pituitary responsiveness to GnRH between Booroola ewes which were homozygous（FF），heterozygous（F+）and non-carriers（++）of a major gene influencing their ovulation rate［J］.Journal of Reproductionamp;Fertility，1987，80（2）：577-588.

［12］祁云霞，何小龍，劉曉芳，等.巴美肉羊發(fā)情期血清FSH和LH濃度變化規(guī)律及其與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（7）：17-20.

［13］王靜.不同產(chǎn)羔性狀綿羊的生殖激素和BMPR-IB、GDF9及RXRG基因研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［14］潘章源，狄冉，劉秋月，等.綿羊多羔主效基因BMPR1B的研究進(jìn)展［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，36（5）：1-6.

［15］賀建寧，王金鑫，狄冉，等.常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊在不同季節(jié)生殖激素變化規(guī)律［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（10）：1547-1553.

［16］何小龍，劉永斌，王峰，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白IB型受體（BMPR-IB）基因在蒙古羊卵巢和子宮組織中的表達(dá)分析［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（8）：6-9.

Relation between Expression of BMPR-IB Gene in the Ovarian Tissue and the Concentration of Reproductive Hormones in Serum of Mongolian Sheep

Wu Hesong，Zhang Liping，Yu Anni，et al
（College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

To explore the relation between expression of BMPR-IB gene in the ovarian tissue and the level of reproductive hormones in serum of Mongolian sheep in different season，ELISA was used to examine the concentrations of FSH and LH in serum of ewes.At the same time，Real-time PCR was used to examine the expression pattern of BMPR-IB gene in the ovarian tissue.The results showed that the concentration of FSH and LH in estrus season（November）was higher than those in anestrus season（April）.In anestrus season the expression of BMPR-IB was significantly higher than that in estrus season in ovary of Mongolian ewes.

Mongolian sheep；BMPR-IB gene；serum；hormone

S826.2

A

2095-3887（2017）06-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.001

2017-09-11

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校級(jí)自立項(xiàng)目（GSAU-ZL-2015-027）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生科研訓(xùn)練項(xiàng)目（SRTP）

武鶴松（1995-），女，本科生。

張利平（1962-），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事綿羊遺傳育種與繁殖研究工作。