不同電壓脈沖射頻對慢性坐骨神經壓迫損傷大鼠模型下丘腦β-內啡肽的影響

姬高亮 薛朝霞 耿寶梁 劉 旺

（1山西醫(yī)科大學麻醉學系，太原030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院疼痛科，太原030001；3遼寧中醫(yī)藥大學附屬第四醫(yī)院疼痛科，沈陽110100）

不同電壓脈沖射頻對慢性坐骨神經壓迫損傷大鼠模型下丘腦β-內啡肽的影響

姬高亮1薛朝霞2Δ耿寶梁3劉 旺1

（1山西醫(yī)科大學麻醉學系，太原030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院疼痛科，太原030001；3遼寧中醫(yī)藥大學附屬第四醫(yī)院疼痛科，沈陽110100）

目的：觀察不同電壓脈沖射頻(pulsed radiofrequency, PRF)對慢性坐骨神經壓迫損傷 (chronic constriction injury, CCI) 大鼠模型下丘腦β-內啡肽含量的影響，探討脈沖射頻的鎮(zhèn)痛機制。方法：雄性SD大鼠72只建立CCI疼痛模型后，隨機分為4組(n=18)：假刺激組H0、PRF低電壓組H1 (45 V)、PRF中電壓組H2 (55 V)，PRF高電壓組H3 (65 V)。PRF組：制模后7 d對其坐骨神經結扎近端行PRF，脈寬20 ms，頻率500 kHz，脈沖頻率2 Hz，持續(xù)時間2 min，治療電壓分別為45 V、55 V、65 V。假刺激組：制模后7 d在相同位置放置射頻電極，但無脈沖治療，持續(xù)時間2 min。制模前、制模后7 d、PRF后1、7和14 d測定大鼠疼痛行為學變化。PRF后1、7和14 d，每組各處死6只大鼠，測定不同時間點大鼠下丘腦中β-內啡肽表達量。結果：脈沖射頻組在治療后1天、7天和14天，與假刺激組比較，熱痛閾均明顯提高(P＜ 0.01)。其中術后第7日，中、高電壓組明顯高于低電壓組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)；在實驗結束時，與假刺激組大鼠比較，術后第1天，7天和14天，低、中、高電壓組大鼠下丘腦β-內啡肽含量明顯升高(P＜ 0.01)；術后第7、14天，與低電壓組相比，中、高組大鼠下丘腦β-內啡肽含量明顯升高(P＜ 0.01)；術后第14日，高電壓組與中電壓組相比，存在顯著差異(P＜ 0.01)。結論：電壓45 V、55 V、65 V的2 Hz脈沖射頻均可引起CCI大鼠熱痛閾的升高，可能與其增加下丘腦β-內啡肽的含量有關；脈沖射頻電壓大于55 V時，治療效果沒有進一步改善。

脈沖射頻；不同電壓；CCI大鼠；神經病理性疼痛；β-內啡肽

神經病理性疼痛 (neuropathic pain, NP)是由外傷、炎癥或其他疾病等引起神經損傷或病變所致的慢性疼痛。其病理生理學特點是痛覺的反應性增高,主要表現為痛覺過敏(hyperalgesia)和痛覺超敏(allodynia)，發(fā)病機制復雜，主要包括中樞敏化和中樞去抑制[1]。

慢性坐骨神經壓迫損傷模型(chronic const-riction injury, CCI)是研究NPP的經典模型，1988年由Bennett[2]等建立。該模型與臨床神經病理性痛特征有相似之處，被廣泛用于神經病理性疼痛的研究。目前，國內外關于動物實驗的研究發(fā)現脈沖射頻(pulsed radiofrequency, PRF)有確切的療效。Laboureyras[3]等將42℃、2 Hz、輸出電壓45 V、持續(xù)2 min的PRF作用于CCI模型大鼠的背根神經節(jié)后發(fā)現PRF可顯著降低大鼠痛覺過敏。Aksu[4]等在兔坐骨神經結扎模型中發(fā)現經外周神經的PRF也可有效緩解神經病理性疼痛。馬蕓[5]等人也發(fā)現PRF作用于CCI大鼠后明顯提高機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。近年來，國內外研究顯示某些離子通道表達、小膠質細胞的活化及相關細胞因子的上調等可能與神經病理性疼痛有關[6,7]。其中，內源性阿片肽系統(tǒng)作為PRF治療的可能性機制之一，主要通過脊髓、脊髓上和外周三種機制調控外周痛覺信息向中樞傳遞。β-內啡肽在20 世紀70 年代被發(fā)現，主要來自于垂體和下丘腦內側基底部的阿黑皮素原(proopiomelanocortin, POMC)，是體內具有嗎啡樣活性的且主要的內阿片肽之一，是對疼痛通路進行調節(jié)的主要抑制性遞質[8]。內啡肽可抑制痛覺傳導遞質P物質的釋放，可能與其陽性神經元的投射有關，從弓狀核發(fā)出投射到腦干中與傷害性刺激傳遞及鎮(zhèn)痛有關的核團從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[9]。

脈沖射頻(PRF)作為一種新型的疼痛治療手段，因其創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少且作用顯著的特點[10]，在國內外被廣泛用于神經病理性疼痛的治療。1997年Sluijter提出[11]脈沖射頻的標準參數為“42℃、2 Hz、2 min”。此參數雖不會帶來嚴重術后并發(fā)癥，但其療效和有效維持時間并不理想[12,13]，在臨床使用中需要間斷多次進行重復治療，往往給患者帶來了很大的心理壓力及經濟負擔。

因此，如何在脈沖射頻可逆性損傷的范圍內，通過調整不同的脈沖射頻參數來提高疼痛治療的有效率，延長治療時限？本實驗采用隨機對照實驗設計，在大鼠CCI疼痛模型的基礎上，通過調整電壓的參數設置行PRF處理后，測量不同時間點大鼠行為學改變以及下丘腦中β-內啡肽的變化，根據檢測指標找到最適電壓，探討脈沖射頻治療神經病理性疼痛相關機制，為臨床治療提供科學依據。

方 法

1.模型制備

72只健康雄性SD大鼠(北京動物實驗中心提供)，6周齡，SPF級，體重200～220 g，動物飼養(yǎng)室有良好的通風和空氣過濾系統(tǒng)，室溫維持在25℃左右，濕度55%左右，晝／夜循環(huán)，自由攝食水。大鼠用6% 水合氯醛(每100 g注射35 mg)麻醉后，俯臥位固定于操作臺上，備皮、消毒后從右側大腿中部股骨外緣凹陷處切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經主干。用4-0絲線在坐骨神經干中部結扎4個線結，結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動而不影響神經外膜的血液流動為宜。每個線結之間間隔約1 mm，術后用醫(yī)用非吸收性外科尼龍縫合線縫合皮膚切口并消毒。

2.實驗分組

將72只大鼠按隨機數字表法分為四組（n=18），分別為假刺激組H0、PRF組H1（45 V），H2（55 V），H3（65 V）。PRF組：制模后7天，使用疼痛射頻治療系統(tǒng)（北琪R-2000B D2）對坐骨神經結扎近端(距線結5 mm處)行脈沖射頻干預：脈寬20 ms、頻率500 kHz，脈沖頻率2 Hz，持續(xù)時間2 min，脈沖電壓分別為45 V、55 V、65 V。假刺激組：制模后7 d，僅在相同位置放置射頻電極，無脈沖射頻治療，持續(xù)時間2 min。分別于脈沖射頻后1、7、14 d，每組各處死6只大鼠，通過酶聯免疫法，觀察各組大鼠下丘腦β-內啡肽的表達情況。

3. 熱痛閾行為學觀察

在制模前、制模后7 d，脈沖射頻治療后1、7和14 d (D1、D7、D14)進行行為學測定。所有測定均在固定時間 (9:00～11:00，AM) 和安靜環(huán)境下進行。按照Hargreaves報道[14]的檢測方法，使用熱刺激儀（PL-200，泰盟科技）測定大鼠的熱痛閾(paw thermal withdrawal latency, PWTL)，調整測痛儀的熱刺激強度，使正常熱痛閾在8～10 s之間。大鼠被置于單獨的透明有機玻璃容器中，預適應30 min，采用測痛儀對大鼠右側足底中部進行照射，記錄熱刺激縮足反射時間。每只大鼠每次測量3次，每次間隔5 min。單次照射不超過30 s，以免損傷照射部位。

4. 酶聯免疫法檢測下丘腦β-內啡肽

取腦：大鼠斷頭后，迅速取出腦組織，放于冰塊上，剝離下丘腦，濾紙擦拭干凈，放電子天平稱重，然后將組織放入封閉好的EP 管中，投入液氮中冷卻。將組織放入勻漿管中，用移液槍按1:9 的比例加入生理鹽水，進行勻漿。將勻漿液放入EP管中，放入離心機中，以3000 r/min 離心15 min，取上清，放入-70℃冰箱中待測下丘腦中的β-EP含量。

5. 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數據進行分析。計量資料用均數±標準誤(±SEM)表示；對PWTL，組間比較采用方差分析，組內不同時間比較采用獨立樣本的t檢驗、LSD、SNK檢驗；對β-內啡肽含量，采用雙因素方差分析；P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

假刺激組（H0）與脈沖射頻組大鼠在造模7天后一般情況良好，均未出現足部發(fā)紅，發(fā)熱，蜷縮，自噬等癥狀，分別進行熱痛閾檢測，與造模前比較發(fā)現熱痛閾（PWTL）明顯降低(P＜ 0.01)，造模成功。各組大鼠不同時間的痛閾值(PWTL)及下丘腦β-內啡肽檢測結果均符合正態(tài)性及方差齊。在行不同電壓的脈沖射頻治療過程中，射頻針尖溫度在36～38℃之間波動。

1.熱痛閾檢測結果

脈沖射頻組在治療后1天、7天和14天，與假手術比較，痛閾均明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。其中術后第1日和14日，低、中、高電壓組間無差別；第7日，中、高電壓組明顯高于低電壓組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01, 見圖1)。

2.下丘腦β-內啡肽檢測結果

與假刺激組大鼠比較，術后第1天，7天和14天，低中高電壓組大鼠下丘腦β-內啡肽含量明顯升高(P＜ 0.01)；術后第7、14天，與低電壓組相比，中高組大鼠下丘腦β-內啡肽含量明顯升高(P＜ 0.01)；術后第14日，高電壓組與中電壓組相比，存在顯著差異(P＜ 0.05，見圖2)。

討 論

隨著人口老齡化，慢性疼痛患者數量逐年增多，對疼痛治療需求不斷提高。脈沖射頻是一種神經調節(jié)而非神經破壞作用[15]，不產生任何神經組織的長期損傷，并可能促進神經修復，是名副其實的“治病”方式，這一特點符合當前神經病理性疼痛的治療理念。為了增強療效，國內外眾多學者在臨床和實驗中進行過部分脈沖射頻參數改良的研究，但一直沒有突破性進展。Lin[16]等通過動物實驗比較不同波形的PRF對NPP的療效，發(fā)現兩種波形均有效緩解癥狀，正弦波效果更明顯。盧振和[17]在不同頻率脈沖射頻對大鼠脊髓背角C-纖維誘發(fā)電位長時程增強的影響中，發(fā)現2Hz時抑制最優(yōu)，可能是PRF發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應機制之一。吳大勝[12]成功將手動調整脈沖參數用于臨床，近期療效明顯，但未研究高電壓時感覺神經是否損傷，并且缺少遠期觀察。Kim等對PHN患者進行選擇性背根神經節(jié)脈沖射頻術，減少了藥物的使用劑量，但效果并不理想[13]。Sluijter[11]認為脈沖射頻引起臨床疼痛減輕是由于電場作用，但未見不同電壓下進行實驗的相關報道。生理機制方面，Hamann[18]等發(fā)現脈沖射頻作用于脊髓背根神經節(jié)可導致轉錄激活因子(activating transcription factor 3, ATF-3)表達上調，而在坐骨神經中不會出現此現象，這可能與組織或細胞的種類有關。武百山[19]發(fā)現脈沖射頻能明顯升高大鼠下丘腦β-內啡肽水平。劉益鳴[6]等人從蛋白表達水平說明超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channels, HCN)可能參與PRF的神經調制過程緩解神經病理痛。Vallejo[7]等人研究發(fā)現，PRF可能是通過逆轉c-fos的表達下調發(fā)揮作用，其中c-fos是疼痛通路神經元活動的一種間接標志物。李多依[20]等對CCI大鼠結扎側坐骨神經干進行PRF治療后發(fā)現可能是通過修復受損的神經起作用的。

圖1 CCI 模型大鼠熱痛閾值的比較( ±SEM )**P ＜ 0.01, 與H0 組相比; ΔΔP ＜ 0.01, 與H1 組相比Fig.1 The comparison of PWTL in CCI model rats ( ±SEM )**P ＜ 0.01, compared with group H0; ΔΔP ＜ 0.01, compared with group H1

目前研究顯示，PRF治療外周神經病理性疼痛動物模型及臨床效果明顯，但國內外對PRF的參數設置尚無標準，溫度、脈寬、電壓、持續(xù)時間等都可能影響到療效。

本次實驗結果顯示，假刺激組與脈沖射頻組在脈沖射頻治療前各組動物的PWTL比較無差別，具有可比性。經過治療后，脈沖射頻組PWTL均高于假刺激組；術后第1、14天，脈沖射頻組間無明顯差別；在術后第7天時，中、高電壓組PWTL明顯高于低電壓組，但均低于模型前的PWTL。從分子水平看，脈沖射頻組大鼠下丘腦β-內啡肽含量均高于假刺激組，至術后第7、14日，中、高電壓組大鼠的β-內啡肽明顯升高。術后第14日時，高電壓組與中電壓組相比差異顯著，提示同一時間點相對較高的電壓可以維持術后更高濃度的β-內啡肽含量。結合二者，至術后第7日，明顯發(fā)現提高脈沖射頻電壓時，β-內啡肽濃度及熱痛閾值均有明顯升高，提示升高電壓所引起的體內β-內啡肽含量的升高可能是脈沖射頻緩解疼痛的機制之一；術后第14日，不同的電壓導致各組大鼠出現不同濃度的β-內啡肽，而熱痛閾值沒有明顯差異，可能提示當β-內啡肽含量升高到一定值時并不能引起行為學上的改變，但是相對高濃度的β-內啡肽可能會延長脈沖射頻的療效。在整個脈沖射頻治療過程中，監(jiān)測到射頻針尖的溫度在36～38℃之間波動，排除了溫度的熱效應因素及高溫對神經造成不可逆損傷。結合臨床上“標準參數”的脈沖射頻治療時，監(jiān)測到針尖溫度在達到預設值前，治療電壓出現一過性迅速升高然后下降的變化。這進一步提示，脈沖射頻的鎮(zhèn)痛作用可能是在電壓的場強效應作用下引起神經細胞跨膜電位的變化，從而影響疼痛信號的傳導。

圖2 CCI 模型大鼠下丘腦β- 內啡肽含量的比較( ±SEM )**P ＜ 0.01, 與H0 組相比; ΔΔP ＜ 0.01, 與H1 組相比; #P ＜ 0.05,與H2 組相比Fig.2 The comparison of content of Β-EP in hypothalamus of CCI model rats ( ±SEM )**P ＜ 0.01, compared with group H0; ΔΔP ＜ 0.01, compared with group H1; #P ＜ 0.05, compared with group H2

綜上所述，電壓45 V、55 V、65 V的2 Hz脈沖射頻均可引起CCI大鼠熱痛閾值的升高，鎮(zhèn)痛效果顯著，這可能與其增加下丘腦β-內啡肽的含量有關；然而，電壓大于55 V時，疼痛緩解沒有進一步改善，但可以維持相對高的濃度，從而可能增強脈沖射頻的時效性，這預示通過改變傳統(tǒng)脈沖射頻的治療電壓參數，可以改變目前治療不滿意的現狀。但是由于客觀實驗限制，未能進行更高電壓及更長時間的觀察，無法確定最合適的電壓參數。因此脈沖射頻治療的最適電壓，還需要進一步的實驗研究來證實。

[1]Yiming Liu, Yi Feng, Tingjie Zhang (Correponding author). Pulsed Radiofrequency Treatment Enhances Dorsal Root Ganglion Expression of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels in a Rat Model of Neuropathic Pain. J Mol Neurosci, 2015,57(1): 97 ～ 105.

[2]Bennett GJ, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain, 1988, 33: 87 ～ 107.

[3]Laboureyras E, Rivat C, Cahana A,et a1. Pulsed radiofrequency enhances morphine analgesia in neurop-athic rats. Neuroreport, 2012, 23: 535 ～ 539.

[4]Aksu R, Ugur F, Bicer C,et a1. The ef fi ciency of pulsed radiofrequency application on L5 and L6 dorsal roots in rabbits developing neuropathic pain. Reg Anesth Pain Med, 2010, 3: 1l ～ 15.

[5]馬蕓, 李振宗, 申穎,等. 脈沖射頻對大鼠坐骨神經病理性疼痛的治療作用. 中國疼痛醫(yī)學雜志, 2012,18(8): 46l ～ 463.

[6]劉益鳴, 張挺杰, 馮藝. 脈沖射頻對CCI大鼠背根神經節(jié)HCN通道的影響. 中國疼痛醫(yī)學雜志, 2013,19(6): 323 ～ 329.

[7]Vallejo R, Tilley DM, Williams J,et a1. Pulsed radiofrequency modulates pain regulatory gene expression along the nociceptive pathway. Pain Physician , 2013, 16: 601 ～613.

[8]馬璐璐, 劉薇, 黃宇光. 疼痛的分子生物學研究新進展. 基礎醫(yī)學與臨床, 2011, 31(2): 222.

[9]王松. β-內啡肽的臨床應用研究進展. 中國綜合臨床, 2000, 16(4): 255.

[10]Simopoulos TT, Kraemer J, Nagda JV. Response topulsed and continuous radiofrequeney lesioning of thedorsal root ganglion and segmental nerves in patientswith chromc lumbar radicular pain. Pain Physician, 2008, 11: 137 ～ 144.

[11]Sluijter ME. Non-thermal radiofrequency procedures in the treatment spinal pain. Pain in Europe; Barcelona:2nd Annual Congress of the European federation of IASP Chapters, 1997, 326.

[12]劉 娜, 宮小文, 吳大勝. 手動脈沖射頻神經調控技術治療慢性神經病理性痛. 中國疼痛醫(yī)學雜志,2012, 18(9): 516 ～ 518.

[13]Kim YH, Lee CJ, Lee SC,et a1. Effect of puised radiofrequency for postherpetic neuralgia. Acta Anaesthesiol Scand, 2008, 52: 1140 ～ 1143.

[14]Hargreaves K, Dubner R, Brown F,et a1. A new and sensitive method for measuring thermal noci-ception in cutaneous hyperalgesia. Pain, 1988, 32: 77 ～ 88.

[15]賈子普, 羅芳. 脈沖射頻治療外周神經病理性疼痛模型的研究進展. 中國疼痛醫(yī)學雜志, 2015, 21(4):293 ～ 296.

[16]Lin WT, Chang CH, Cheng CY,et a1. Effects of Low Amplitude Pulsed Radiofrequency Stimulation with different Waveform in Rats for Neuropathic Pain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol SOC, 2013: 3590 ～ 3593.

[17]謝長春, 高崇榮, 盧振和. 不同頻率脈沖射頻對大鼠脊髓背角C-纖維誘發(fā)電位長時程增強的影響. 中國疼痛醫(yī)學雜志, 2006, 12(6): 325 ～ 328.

[18]Hamann W, Abou-sherif S, Thompson S,et a1. Pulsed radiofrequency applied to dorsal root ganglia causes a selective increase in ATF3 in small neurons. Eur J Pain,2006, 10: 171 ～ 176.

[19]武百山, 楊立強, 岳劍寧. 背根神經節(jié)脈沖射頻對大鼠SNI疼痛模型機械性痛閾的影響. 中國實驗診斷學 , 2012, 16: 1376 ～ 1377.

[20]李多依, 孫異臨, 曲寶清, 等. 脈沖射頻對坐骨神經慢性縮窄大鼠坐骨神經超微結構的影響. 中國疼痛醫(yī)學雜志 , 2012, 18(8): 464 ～ 467.

THE EFFECT OF DIFFERENT VOLTAGE PULSED RADIOFREQUENCY ON BETA-ENDORPHIN LEVEL IN THE HYPOTHALAMUS AFTER CHRONIC CONSTRICTION INJURY IN RATS

JI Gao-Liang1, XUE Zhao-Xia2Δ, GENG Bao-Liang3, LIU Wang1
(1Department of Anesthesiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;2Department of Pain,Shanxi Medical University First Hospital, Taiyuan, 030001, China;3Department of Pain, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital subsidiary Fourth, Shenyang 110100, China)

Objective:To observe the effect of different voltage pulsed radiofrequency (PRF) on the content of beta-endorphin in the hypothalamus of CCI rat model, and to explore the analgesic mechanism of pulsed radiofrequency.Methods:Seventy-two male SD rats were randomly divided into 4 groups (n=18): Sham operation group H0, PRF low voltage group H1 (45 V), PRF medium voltage group H2 (55 V), PRF high voltage group H3 (65 V). All rats underwent chronic constriction injury of sciatic nerve. On the 7th postoperative day in PRF groups, PRF was delivered with a pulse duration of 20 ms (500 kHz) and pulse rate of 2 Hz to the proximal sciatic nerve for 2 min. The treatment voltage was 45 V, 55 V and 65 V respectively;While in H0 group, PRF needles were placed in the proximal sciatic nerve for 2 min without radiofrequency current. Pain behavioral changes were measured before operation, 7 days after operation, and 1, 7, 14 days after PRF treatment. The expression of beta-endorphin was measured in the hypothalamus of CCI rat(n=6) in each group at l, 7, 14 days after PRF treatment.Results:At 1, 7, 14 days after PRF treatment, paw withdrawal thermal latency (PWTL) of PRF groups were all increased signi fi cantly comparing with sham operation group (P＜ 0.01). On the 7th day after the operation, PWTL of the medium and high voltage group was signi fi cantly higher than the low voltage group (P＜ 0.01). At the end of the experiment, the expression of beta-endorphin in PRF groups were signi fi cantly higher than sham operation group (P＜ 0.01). On the 7th day and 14th after the operation, the expression of beta-endorphin of the medium and high voltage group were increased significantly comparing with the low voltage group (P＜ 0.01). On the 14th day after the operation, there were differences between medium and high voltage group (P＜ 0.01).Conclusion:PRF(frequency 2 Hz) of the low, medium and high voltage group can all cause the increase of the PWTL of CCI rats, which may be related to the increase of the content of beta-endorphin in the hypothalamus. When the pulsed radiofrequency voltage is greater than 55V, the treatment effect is not improved further.

Pulsed radiofrequency; Different voltage; CCI rat; Neuropathic pain; Beta-endorphin

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.06.005

△通訊作者 xzx1284@126.com