轉(zhuǎn)運蛋白在背根神經(jīng)節(jié)參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制研究*

馬冰潔 劉曉明 馬 柯

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院疼痛科，上海200092）

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轉(zhuǎn)運蛋白在背根神經(jīng)節(jié)參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制研究*

馬冰潔 劉曉明 馬 柯△

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院疼痛科，上海200092）

目的：探討背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)轉(zhuǎn)運蛋白(translocator protein, TSPO)對神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)的影響及可能的作用機制。方法：雄性SD大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、對照組(SNI組)和給藥組(Ro組)。采用von-Frey絲測量大鼠50%機械刺激縮足閾值 (paw withdrawal threshold, PWT)，在術(shù)后第7天、14天取DRG，采用免疫熒光及蛋白印跡技術(shù)檢測TSPO、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和蛋白激酶p-ERK。結(jié)果：①相較Sham組，SNI組DRG表達TSPO陽性細胞升高(D7:P＜ 0.05, D14:P＜ 0.01)，TSPO在DRG與肽能和非肽能中小神經(jīng)元、有髓大神經(jīng)元和衛(wèi)星膠質(zhì)細胞均有共定位。②SNI組大鼠PWT術(shù)后相較Sham組明顯降低 (P＜ 0.01)；Ro組大鼠鞘內(nèi)注射Ro5-4864后 PWT升高(D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)、BDNF下調(diào)(P＜ 0.05)、p-ERK1(P＜ 0.01)和p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)下降。結(jié)論：鞘內(nèi)注射TSPO配體 Ro5-4864可緩解NP大鼠的痛覺超敏，其在DRG的機制可能與抑制p-ERK、BDNF的活化有關(guān)。

神經(jīng)病理性疼痛；轉(zhuǎn)運蛋白；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病而直接造成的疼痛。以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏為主要臨床特征，不僅疼痛程度劇烈，且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。對于NP，傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥物如非甾體、阿片類藥物治療效果差，其他如抗驚厥/癲癇以及抗抑郁/焦慮等藥物也都不能達到滿意療效[1]。

轉(zhuǎn)運蛋白(translocator protein, TSPO)主要定位于線粒體外膜[2]，在甾體合成相關(guān)的組織中高度表達，包括大腦和脊髓。在類固醇合成的細胞中，TSPO介導(dǎo)膽固醇從線粒體外膜向內(nèi)膜轉(zhuǎn)移，是類固醇激素及神經(jīng)甾體合成的限速步驟[3]。最近，TSPO被認為在一些神經(jīng)疾病中起關(guān)鍵作用，如腦損傷、阿爾茨海默病、炎癥性疼痛和NP。在神經(jīng)系統(tǒng)中，TSPO在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均有表達，不過其作用尚不清楚。我們以往的研究表明，NP中脊髓水平TSPO表達增加，其可能通過抑制依賴CXCL1-CXCR2的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元信號系統(tǒng)和中樞敏化，減輕痛敏[4]。不過，TSPO在其他部位的作用機制尚未探究。因此，本實驗擬采用保留性坐骨神經(jīng)損傷模型(spared nerve injury, SNI)觀察術(shù)后DRG中TSPO的表達變化規(guī)律，并觀察鞘內(nèi)給予TSPO受體激動劑對大鼠痛覺超敏的影響，旨在為治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。

方 法

1. 實驗動物及分組

成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，由新華醫(yī)院動物房提供。動物用隨機數(shù)字表法隨機分為三組，包括假手術(shù)組（Sham組）：暴露但不結(jié)扎坐骨神經(jīng)，術(shù)后第三天鞘內(nèi)注射溶劑；對照組（SNI組）：行SNI術(shù)，術(shù)后第三天鞘內(nèi)注射溶劑；給藥組（Ro組）：行SNI術(shù)，術(shù)后第三天鞘內(nèi)注射TSPO受體激動劑Ro5-4864。每組均在術(shù)后第7天和術(shù)后第14天處死動物并取材，每個時間點6只大鼠，其中3只用于蛋白印跡檢測，3只用于免疫熒光檢測。

2. 主要試劑

TSPO受體激動劑Ro5-4864 (7-Chloro-5-(4-chlorophenyl)-1,3-Dihydro-1-Methyl-2H-1,4-Benzodiazepin-2-one)用二甲基亞砜（DMSO）溶解，Ro5-4864和DMSO均購買于美國Sigma Aldrich 公司。Ro5-4864溶于20%DMSO，Ro組在SNI術(shù)后第三天鞘內(nèi)注射 2 μg（濃度為 0.5 μg/μl, 體積 4 μl），SNI組和Sham組給予同等劑量的20%DMSO。

3. SNI模型的建立

根據(jù)文獻中描述的方法[5],對大鼠采用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠右側(cè)臥位，四肢固定于手術(shù)臺板上，在大鼠左側(cè)后肢上緣切開皮膚并鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干及其分支：脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。用5-0絲線緊緊結(jié)扎并剪斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，剪去2 ～4 mm殘余神經(jīng)末端，保留腓腸神經(jīng)。操作過程中盡量避免腓腸神經(jīng)受到損傷和牽拉。依次縫合肌肉和皮膚。Sham組僅暴露坐骨神經(jīng)及其三個分支，不給予結(jié)扎和剪斷，其余步驟同SNI模型。

4. 行為學(xué)分析

采用Chaplan等人報道的Up-Down方法[6]，在術(shù)前(D0)、術(shù)后第三天(D3)、術(shù)后第7天(D7)、術(shù)后第14天(D14)早晨9:00測定大鼠的50%機械刺激縮足閾值(paw withdrawal threshold, PWT)。將大鼠置于棕色不透光塑料籠架(20 cm×15 cm×15 cm)內(nèi)約30 min，待大鼠安靜后，采用Von Frey纖維絲根據(jù)折力大小對大鼠左后肢足底部外側(cè)皮膚進行機械性刺激，每次刺激持續(xù)6～8 s。首先用力度為2.0 g的纖維絲開始測試，測試時纖維絲微彎曲，在大鼠足底保持6～8 s，若出現(xiàn)快速縮足或舔足行為記為陽性反應(yīng)。若出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則選用相鄰刺激強度遞減的纖維絲繼續(xù)刺激；反之，若出現(xiàn)陰性反應(yīng)，則選擇相鄰遞增的纖維絲給予刺激，如此反復(fù)。每次刺激間隔時間為30 s左右。根據(jù)Chaplan等人描述的方法[6]計算50%PWT。

5. 蛋白免疫印跡分析

腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg深度麻醉后，放血處死大鼠，咬骨鉗分離椎板后，迅速取出L4、L5DRG，液氮速凍后放入-80℃保存。各樣本稱取等量組織標(biāo)本后，按比例加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，然后進行組織勻漿，12000 r/min 4℃離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。將40 μg/well總蛋白加入SDS上樣緩沖液，100℃變性10 min，采用12%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate -poly-acrylamide gel electrop horesis, SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時恒流300 mA，時間70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，抗TSPO抗體（兔源，1:1 000, Santa Cruz Biotechnology, 美國），抗BDNF抗體（兔源，1:1 000, Sigma Aldrich, 美國），抗p-ERK抗體（兔源，1:1 000, 將 Cell Signaling Technology, 美國），抗ACTIN抗體（小鼠源，1:1 000，碧云天，中國）4℃搖床孵育過夜。TBST緩沖液沖洗10 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗10 min×3次，ECL顯色曝光。目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。

6.免疫熒光檢測

分別于SNI術(shù)后第7天和第14天取材，腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg深度麻醉后，開胸經(jīng)左心室注射磷酸緩沖液（PBS）至流出液無色，灌注4%多聚甲醛固定組織后，取出L4、L5DRG，采用4%多聚甲醛后固定12 h，30%蔗糖脫水12 h至沉底，包埋制作冰凍切片，厚度10μm。切片經(jīng)10%驢血清加0.3% Triton X-100封閉破膜1 h，抗TSPO抗體（兔源，1:100, Santa Cruz Biotechnology,美國），抗NF200抗體（小鼠源, 1:1 000, Sigma Aldrich, 美國），抗CGRP抗體（小鼠源, 1:1 000，Sigma Aldrich, 美國），IB4（1:200, invitrogen, 美國）4℃ 孵育過夜。PBS緩沖液沖洗10 min×3次，熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，PBS緩沖液沖洗10 min×3次，滴加抗熒光淬滅劑 （購自碧云天，中國），封片，熒光顯微鏡下掃描拍照。

7. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。采用重復(fù)測量的方差分析比較各組機械痛閾值；TSPO,BDNF, p-ERK蛋白表達水平同一時間點組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。為了分析免疫熒光，我們從每只大鼠DRG中隨機選取6片，每組每個時間點三只動物。DRG上矩形內(nèi)的圖像用強度值來分析，Image J進行計算。每片的背景強度均被扣除。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. SNI導(dǎo)致NP并且誘導(dǎo)DRG中TSPO表達上調(diào)

行為學(xué)測量分別于SNI術(shù)前(D0)、術(shù)后第3天(D3)、第7天(D7)和第14天(D14)進行。SNI組在術(shù)后第3天直至本實驗觀察的術(shù)后第14天，其PWT顯著降低，與sham組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.01, 見圖1A)。我們用免疫熒光的方法檢測DRG中TSPO的表達，結(jié)果表明，sham組大鼠DRG中TSPO表達量較低，SNI術(shù)后第7天、第14天 TSPO表達量均上調(diào)（見圖1B）,與蛋白印跡結(jié)果一致（見圖3B）。

為了檢測TSPO的細胞定位，我們做了TSPO和不同神經(jīng)細胞標(biāo)志物的共染，結(jié)果表明，TSPO與NF200、IB4、CGRP和S-100均有共定位，其中在NF200（大神經(jīng)元）中分布最多，占47%（見圖2）。

2. 鞘內(nèi)注射TSPO受體激動劑Ro5-4864減輕NP并影響DRG中TSPO的表達

行為學(xué)表明，鞘內(nèi)注射Ro5-4864后，Ro組PWT在術(shù)后第7天、第14天均上升，與SNI組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05, 見圖3A)。蛋白印跡結(jié)果顯示，在術(shù)后第7天 Ro5-4864顯著增加了TSPO的表達量(P＜ 0.01)；同時在術(shù)后第14天抑制了TSPO的表達(P＜ 0.05, 見圖3B)。

3. 鞘內(nèi)注射Ro5-4864對DRG中BDNF、p-ERK的影響

圖1 SNI引起大鼠觸誘發(fā)痛并上調(diào)DRG中TSPO的表達A：SNI術(shù)后大鼠PWT的變化，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；B：SNI術(shù)后DRG中TSPO的表達變化Fig.1 Spared nerve injury (SNI) induces mechanical allodynia and translocator protein (TSPO) upregulation in the DRGA: Paw mechanical withdraw threshold(PWT) after SNI. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with sham group. B: TSPO expression in DRG after SNI.

根據(jù)蛋白印跡結(jié)果，神經(jīng)損傷后BDNF表達水平較sham組升高(D7:P＜ 0.01)，鞘內(nèi)注射Ro5-4864后，其表達下降(P＜ 0.05, 見圖4A)。同樣地，與Sham組相比，SNI術(shù)后上調(diào)p-ERK1 (P＜0.01)、p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)，鞘內(nèi)注射 Ro5-4864后也降低了 p-ERK1 (P＜ 0.01)和p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)的表達水平（見圖4B），與SNI組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)SNI能引起大鼠DRG中TSPO、BDNF、p-ERK的表達升高，通過鞘內(nèi)注射TSPO受體激動劑可以降低大鼠的痛覺超敏現(xiàn)象，并能減少DRG中BDNF和P-ERK的表達。

圖2 DRG中TSPO的分布免疫熒光共染表明TSPO和NF200（A）、IB4（B）、CGRP（C）和S-100（D）均有共定位。E為TSPO在DRG中各細胞分布的比例。Fig.2 Distribution of TSPO in the DRG(A-D) Double staining of immunofluorescence shows that TSPO is colocalized with NF200, IB4, CGRP and S-100.(E) Percentage of TSPO distribution in the DRG.

圖3 鞘內(nèi)注射Ro5-4864減輕大鼠觸誘發(fā)痛并調(diào)節(jié)DRG中TSPO的表達A：鞘內(nèi)注射Ro5-4864對SNI大鼠PWT的影響；B：鞘內(nèi)注射Ro5-4864后 DRG中TSPO的表達變化。箭頭表示給藥時間。與Sham 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 SNI組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.3 Intrathecal injection of Ro5-4864 alleviates mechanical allodynia and regulates TSPO expression in the DRGA: Effects of intrathecal injection of Ro5-4864 on PWT; B:TSPO expression in the DRG after intrathecal injection of Ro5-4864. Arrow indicates the time of intrathecal injection. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01compared with sham group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 compared with SNI group.

圖4 各組大鼠DRG中BDNF、p-ERK表達量的變化A：鞘內(nèi)注射Ro5-4864后DRG中BDNF的表達變化；B：鞘內(nèi)注射Ro5-4864對DRG中p-ERK的影響。與Sham組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 SNI組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.4 Changes of BDNF and p-ERK expression in the DRG in all groupsA: BDNF expression in DRG after intrathecal injection of Ro5-4864; B: Effects of intrathecal injection of Ro5-4864 on phospho–extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) activation in the DRG. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01compared with sham group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 compared with SNI group.

在以往的研究中，TSPO受體激動劑被證明在治療神經(jīng)精神類疾病和疼痛中有效[7,8]，我們的實驗結(jié)果也表明，鞘內(nèi)注射TSPO受體激動劑后，明顯減輕了NP大鼠的痛覺超敏現(xiàn)象。本實驗采取鞘內(nèi)給藥的方法，故TSPO受體激動劑可能在脊髓和DRG中均發(fā)揮作用。在脊髓水平，TSPO受體激動劑可能通過調(diào)節(jié)類固醇激素的合成抑制NP[7]；許多學(xué)者認為TSPO的表達上調(diào)是機體在應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)源性保護反應(yīng)，神經(jīng)損傷后脊髓背角TSPO表達增高，當(dāng)神經(jīng)恢復(fù)正常時，TSPO表達也降至正常水平[7]；我們以往的研究也表明，在脊髓中TSPO受體激動劑抑制星形膠質(zhì)細胞活化，進一步抑制依賴CXCL1-CXCR2的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元信號系統(tǒng)和中樞敏化，減輕NP中的痛敏[4]。 生理狀態(tài)下，DRG中TSPO的表達水平不高，外周神經(jīng)損傷后其表達上調(diào)。本實驗中，當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，DRG中TSPO表達水平上升，在給予TSPO受體激動劑后，隨著大鼠機械痛閾的上升，TSPO表達水平在術(shù)后第14天較對照組下調(diào)。在類固醇合成的細胞中，TSPO介導(dǎo)膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移，是類固醇激素及神經(jīng)甾體合成的限速步驟[3]，許多類固醇激素具有鎮(zhèn)痛作用。例如，黃體酮代謝為5α-DHT和3α，5α-THP，在DRG中感覺神經(jīng)元的興奮性由3α，5α-THP的濃度調(diào)控，3α，5α-THP可通過T型鈣通道和GABAA產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[9]。因此，DRG中TSPO可能通過調(diào)控類固醇激素來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。神經(jīng)損傷后TSPO表達上調(diào)，給予Ro5-4864可有助于DRG中神經(jīng)元存活和神經(jīng)突的生長、促進外周神經(jīng)再生[10]，但其是否和NP有關(guān)尚有待進一步研究。

在NP的發(fā)展過程中，DRG并非僅僅是在生理功能上被動支持連接外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而是深深參與到NP的外周過程。外周神經(jīng)損傷后，DRG釋放一系列細胞因子：趨化素、生長因子、白介素、干擾素、TNF-α，早期、晚期基因發(fā)生改變，ATP產(chǎn)生變化，鈉、鉀、鈣離子通道和離子流改變，導(dǎo)致DRG神經(jīng)元超興奮；衛(wèi)星膠質(zhì)細胞的激活可進一步影響脊髓背角神經(jīng)元，導(dǎo)致中樞敏化和慢性疼痛[11]。外周神經(jīng)損傷后，DRG中BDNF mRNA和蛋白水平上升，在術(shù)后第一天其mRNA水平最高，隨后下降，至術(shù)后第14天，依然高于正常水平[12]。BDNF在DRG神經(jīng)元中合成，順行運輸?shù)郊顾璧闹袠猩窠?jīng)末梢。在脊髓背角，BDNF通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)促進中樞敏化導(dǎo)致NP[13]；另一方面，BDNF可激活星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)NP[14]。直接注射外源性BDNF可以引起機械觸誘發(fā)痛。神經(jīng)損傷后DRG中增加的BDNF可能通過TrR B受體降低BK通道活性，使初級傳入神經(jīng)元超興奮，增加脊髓的傷害性信息傳入，導(dǎo)致NP[15]。TSPO可以調(diào)節(jié)類固醇激素的合成，在糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠中，給予TSPO受體激動劑可提高烯醇酮(PREG)、黃體酮(PROG)等類固醇激素的水平，起到神經(jīng)保護的作用[16]。大腦損傷后BDNF水平上升，經(jīng)過類固醇激素黃體酮(PROG)治療，其Pro-BDNF和成熟BDNF水平均下降[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后BDNF水平下降，給予PROG治療后BDNF水平上升[18]。在我們的研究中，SNI術(shù)后BDNF水平上升，鞘內(nèi)注射TSPO受體激動劑后，其水平降低。因此，我們推測，在DRG 中，TSPO受體激動劑可能通過調(diào)節(jié)類固醇激素的合成來平衡BDNF的水平。在外周炎癥和NP模型中，ERK活化是DRG神經(jīng)元細胞體內(nèi)BDNF上調(diào)的原因[19]。而且，在NP模型中，DRG內(nèi)ERK磷酸化導(dǎo)致受損神經(jīng)元中NPY水平上調(diào)，DRG中的NPY可以改變神經(jīng)元的興奮性，調(diào)節(jié)疼痛[19]。在CCD模型中，CCD通過活化ERK抑制A型快速失活鉀通道，引起DRG神經(jīng)元興奮[20]。在本實驗中，給予TSPO受體激動劑后，p-ERK和BDNF水平下調(diào)，TSPO可能通過其下調(diào)進一步影響NP。

總之，TSPO參與NP的調(diào)控，TSPO受體激動劑或許為治療NP提供一種新的思路。

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THE INVOLVEMENT OF TRANSLOCATOR PROTEIN IN THE DORSAL ROOT GANGLION IN NEUROPATHIC PAIN *

MA Bing-Jie1, LIU Xiao-Ming1, MA Ke1△
(1Department of Pain Management, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092, China)

Objective:To investigate the role of translocator protein (TSPO) in the dorsal root ganglion (DRG)in neuropathic pain and to explore the possible mechanism.Methods:All male Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups: the Sham group, the control group (SNI group) and the treatment group (Ro group). Vonfrey fi laments were used to measure the 50% paw withdrawal thresholds (PWT). The expression of TSPO, BDNF and p-ERK in the DRG was detected by western blot and immuno fl uorescence.Results:① Compared with the Sham group, the expression of TSPO was increased in the SNI group (D7:P＜ 0.05,D14:P＜ 0.01). The TSPO signals were colocalized with IB4, CGRP, NF-200 positive neurons and S-100 positive glial cells. ② The PWT of SNI rats was signi fi cantly decreased compared with the sham group (P＜0.01), which was reversed by intrathecal injection of ligand of TSPO (Ro5-4864) (D7:P＜ 0.01, D14:P＜0.05). Furthermore, the expression of BDNF (P＜ 0.05), p-ERK1 (P＜ 0.01) and p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05) was declined in the Ro group.Conclusion:A single intrathecal injection of TSPO agonist Ro5-4864 attenuated mechanical allodynia in neuropathic pain. The mechanisms may be partly attributed to the inhibition of p-ERK and BDNF expression in the DRG.

Neuropathic pain; TSPO; BDNF

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.06.004

國家自然基金（81371246）；江蘇省博士后科研基金（1302019B）

△通訊作者 marke72@163.com