稠油降解菌的篩選與降解效果評(píng)價(jià)

鄭克華，趙 陽(yáng)，隋殿雪，楊 磊

（1. 東北石油大學(xué) 提高采收率重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163318； 2. 大慶油田第四采油廠，黑龍江 大慶 163318）

稠油降解菌的篩選與降解效果評(píng)價(jià)

鄭克華1，趙 陽(yáng)1，隋殿雪2，楊 磊1

（1. 東北石油大學(xué) 提高采收率重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163318； 2. 大慶油田第四采油廠，黑龍江 大慶 163318）

微生物驅(qū)油技術(shù)的主要機(jī)理之一就是利用微生物降解原油中含有大組分，降低原油粘度，進(jìn)而改變?cè)偷奈镄浴＠迷鸵约昂臀鬯泻Y選出能降解稠油的菌組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，微生物作用使原油物性發(fā)生明顯變化，原油中的膠質(zhì)、瀝青質(zhì)含量降低，組分也發(fā)生了明顯變化，原油物性變化明顯。

稠油降解菌；粘度；菌數(shù)；組分

稠油是21世紀(jì)重要的后備戰(zhàn)略資源，在經(jīng)濟(jì)上也有著非常重要的地位。我國(guó)的稠油資源含量較大，隨著對(duì)稠油資源的重視以及開(kāi)發(fā)力度的加大，針對(duì)稠油的生物降解研究日益增多。國(guó)內(nèi)外關(guān)于稠油微生物開(kāi)采的機(jī)理研究有很多，總的來(lái)說(shuō)，主要是因?yàn)槲⑸锘蚱浯x產(chǎn)物對(duì)稠油的降粘作用[1]。微生物對(duì)稠油的降解主要是能夠降解大分子烷烴，使其變?yōu)樾》肿訜N化合物，也就是利用微生物把稠油中的高分子物質(zhì)如蠟質(zhì)、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)分解為低分子量的化合物，降低整個(gè)稠油的平均分子量，使稠油粘度下降[1]。

迄今為止，已探明能夠降解石油的微生物有190多種，其中細(xì)菌有假單胞菌屬、棒桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等。然而由于稠油組成復(fù)雜，難降解物質(zhì)較多，對(duì)稠油的降解作用并不理想，表現(xiàn)為處理周期長(zhǎng)，降解率低[2-4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)油田現(xiàn)場(chǎng)油井采出水中的4種降解菌進(jìn)行分離純化，從中篩選出對(duì)稠油有較好降解效果的菌株，并對(duì)其降解效果進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)選用菌種樣品取自于油田現(xiàn)場(chǎng)油井采出水中，從中分離并純化得到4株純菌株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基的制備

（1）分離及純化用培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基的制備需要瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等物質(zhì)在中性條件下配置[3]。

葡萄糖平板培養(yǎng)基的制備需要瓊脂、葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十六水磷酸氫二鈉、五水硫酸鎂、氯化鈣等物質(zhì)在中性條件下配置[3]。

（2）降解菌篩選培養(yǎng)基

種子瓶培養(yǎng)基的制備需要葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣等物質(zhì)在中性條件下配置[4]。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基的制備需要：葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣在中性條件下配置[4]。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離與純化

（1）涂布培養(yǎng)

我們將其分為三部分：樣本稀釋?zhuān)坎?，恒溫培養(yǎng)。通過(guò)樣本稀釋的的過(guò)程我們可以得到稀釋度為10-6的稀釋液；用無(wú)菌刮刀將得到的稀釋液均勻的涂到培養(yǎng)基表面并將其分為三組平行樣本；最后等培養(yǎng)基將平板表面液體吸收后，將其放到35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

（2）劃線培養(yǎng)

采用交叉劃線法 ，首先從1至6依次進(jìn)行。其次，我們將劃線后的平板倒放于35 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d。最后，我們選取單菌落進(jìn)行鏡檢。

（3）鏡檢

我們將過(guò)程分為三部分：涂片，染色，顯微鏡觀察。從上述三步中我們得到需要的純菌種以便下面實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

1.2.2 降解菌的篩選

（1）種子培養(yǎng)

首先將得到的純菌株接入經(jīng)過(guò)滅菌后的種子瓶中，將瓶子放在35 ℃、150 r/min的搖床中，震蕩培養(yǎng) 15～16 h。然后取出放在超凈工作臺(tái)上，測(cè)定其pH，并觀察菌株生長(zhǎng)情況。選擇純菌株并且生長(zhǎng)狀況良好的種子液接種放入無(wú)菌發(fā)酵瓶中。若菌種生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，根據(jù)種子液 pH選擇，以 7.2為最佳[5]。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

取10 mL的種子液接種放入發(fā)酵瓶中，放入35℃、150 r/min的搖床，振蕩培養(yǎng)2～3 d。

（3）總菌數(shù)的測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用平板計(jì)數(shù)法。首先，采用100倍系列稀釋法，將待測(cè)樣品逐級(jí)稀釋?zhuān)∠♂尪葹?0-5、10-7、10-79的稀釋液0.2 mL于葡萄糖平板培養(yǎng)基上涂布均勻。然后，置于35 ℃的溫箱中培養(yǎng)24 h后取出計(jì)數(shù)，根據(jù)式1計(jì)算出總菌株[5]。

每毫升中總菌株=同一稀釋度兩組平行樣的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，不同稀釋度計(jì)算得到的總菌株不能相差太大，否則，視為檢驗(yàn)不準(zhǔn)確。

1.2.3 降解效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)稠油取自油田現(xiàn)場(chǎng)油井。試驗(yàn)溫度為 35℃，將培養(yǎng)基與稠油接種微生物混合，在150 r/min的搖床上發(fā)酵8 d。觀測(cè)菌株生長(zhǎng)分裂情況，繪制菌株生長(zhǎng)曲線，并檢測(cè)這一過(guò)程中的菌數(shù)及pH值的變化。取微生物作用前后的稠油測(cè)定稠油粘度、族組分，進(jìn)行全烴色譜分析，研究微生物對(duì)稠油的作用效果[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與純化結(jié)果

通過(guò)涂布、劃線培養(yǎng)，共得到4株內(nèi)源純菌株：1#、2#、3#、4#，石油降解菌經(jīng)鑒定分屬假單胞菌屬和芽孢菌屬。

2.2 降解菌的篩選結(jié)果

篩選得到生長(zhǎng)較好、性狀比較穩(wěn)定的降解菌 4株，5#、6#、14#、16#。分別設(shè)置平行樣命名為 5（1）#、5（2）#、6（1）#、6（2）#、14（1）#、14（2）#、16（1）#、16（2）#。其中，5#為粗短桿菌，6#為細(xì)小短桿菌，14#為球菌，16#為大球菌。

觀測(cè)4株稠油降解菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的菌數(shù)變化，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

圖1 各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of each strain

通過(guò)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) 6#、16#菌株在發(fā)酵過(guò)程中，總菌株較高，2-3d內(nèi)均能維持在108個(gè)/mL以上，并且菌數(shù)波動(dòng)較穩(wěn)定。而其余菌株的生長(zhǎng)狀況較差，整個(gè)過(guò)程中總菌株都不高（圖 1）或者波動(dòng)幅度很大。由于 6#、16#菌株的生長(zhǎng)能力優(yōu)于其它菌株因此將6#、16#作為稠油降解菌株保留備用。

從6#、16#菌株的種子瓶中取5 mL接入發(fā)酵瓶，在35 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)8 d，得到菌株的發(fā)酵曲線，如圖2、圖3所示。并取微生物作用前后稠油測(cè)定粘度，實(shí)驗(yàn)溫度50 ℃，表1列出了微生物作用前后稠油粘度變化的數(shù)據(jù)。

圖2 6#菌株發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of 6# strain

圖3 16#菌株發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation curve of 16# strain

表1 微生物作用前后稠油粘度Table 1 Crude oil viscosity before and after microbial action

由圖3發(fā)酵曲線知，菌株在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)大體可分為三個(gè)階段。

第一階段為生長(zhǎng)初期，生物量不斷增加，pH變化加快，產(chǎn)物逐漸增加。

第二階段為生長(zhǎng)活躍期，總菌株逐漸達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，pH變化平緩，菌株代謝活力最強(qiáng)[6]。

第三階段為生長(zhǎng)后期，pH逐漸下降，菌體開(kāi)始衰亡，菌數(shù)減少。

通過(guò)發(fā)酵曲線可以看出，6#菌株生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的總菌數(shù)高于16#菌株。并且，由于6#菌株的pH值在發(fā)酵過(guò)程中不易受到發(fā)酵條件的干擾，波動(dòng)較小。同時(shí)，根據(jù)微生物作用前后稠油的粘度變化可以看出，6#降粘率85.9%，16#降粘率74.9%，6#的降解率大于16#，即6#的降解效果優(yōu)于16#的降解效果。因此，選擇6#菌株作為石油烴降解菌，接種至斜面保存。

2.3 微生物菌種的降解效果評(píng)價(jià)

篩選出的微生物，以大分子碳鏈的烴類(lèi)化合物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)將大分子轉(zhuǎn)化為小分子組分排出體外，達(dá)到稠油降解的目的[7]。我們從稠油降解菌的篩選及微生物作用后稠油物化性質(zhì)的改變情況，對(duì)6#菌作用前后稠油組分進(jìn)行了色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微生物使用前后稠油組分變化Table 2 Change of crude oil before and after using bacteria

從表2中可以看出，經(jīng)6#菌作用后稠油組分中非烴類(lèi)以及芳烴類(lèi)含量均發(fā)生變化。分析表明微生物已經(jīng)將稠油降解，稠油流動(dòng)性增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

（1）從油田現(xiàn)場(chǎng)油井采出水中分離純化得到4株降解菌，其中 6#、16#菌株發(fā)酵過(guò)程中的總菌數(shù)較高，初步篩選得到兩株菌株6#和16#。

（2）在發(fā)酵瓶中，6#、16#菌株的生長(zhǎng)大致經(jīng)歷了三個(gè)時(shí)期：生長(zhǎng)初期、活躍期、生長(zhǎng)后期。在生長(zhǎng)活躍期，菌體代謝活力最強(qiáng)，

（3）微生物繁殖能力較強(qiáng)。經(jīng)微生物作用后的稠油物性變化較大，大分子烷烴降解成小分子烷烴，稠油粘度也顯著的降低[8]。

（4）6#菌株的降解能力優(yōu)于 16#菌株，且 6#菌株不易受到發(fā)酵條件的干擾，因此6#菌株更適用于工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)。

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Screening of Thick Oil-degrading Bacteria and Its Degradation Effect

ZHENG Ke-hua1,ZHAO Yang1,SUI Dian-xue2,YANG Lei1

（1. Northeastern Petroleum University, Heilongjiang Daqing 163318，China; 2. Daqing Oilfield Company No.4 Oil Production Plant, Heilongjiang Daqing 163318, China）

One of the main mechanisms of microbial oil recovery technology is to reduce the viscosity and freezing point of crude oil by using microbial degradation of the main components such as gum and asphaltene in crude oil, so as to improve the physical and chemical properties of crude oil.In this paper,the experiment was carried out to isolate and select the bacteria to effectively degrade the heavy oil.The results show that the properties of heavy oil have been changed obviously with the action of bacteria, and the contents of each component in the heavy oil are decreased, and the composition and structure of the heavy oil are changed obviously.

Thick oil-degrading bacteria; Viscosity; Bacterial count; Component

TE 357

A

1671-0460（2017）04-0633-03

2017-02-26

鄭克華（1990-），男，山東省濟(jì)寧市人，碩士研究生，東北石油大學(xué)石油工程學(xué)院，研究方向：提高油氣采收率。E-mail：1009621146Qqq.com。