高效液相色譜法測(cè)定益之康膠囊中總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)的含量

,,,,,*

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江杭州 310052)

高效液相色譜法測(cè)定益之康膠囊中總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)的含量

壽林均1,程巧鴛2,黃柳倩1,周明昊1,2,*

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江杭州 310052)

建立益之康膠囊中總蒽醌含量測(cè)定的高效液相色譜法。采用HPLC測(cè)定益之康膠囊中2種蒽醌類成分大黃素和大黃素甲醚的含量;流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25,v/v),柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。大黃素和大黃素甲醚分別在0.054～0.65 μg和0.022～0.27 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9999,檢出限分別為0.86 μg/g和0.87 μg/g,平均回收率分別為97.20%(RSD=2.26%)和99.96%(RSD=2.18%)。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠。

益之康膠囊,大黃素,大黃素甲醚,總蒽醌,高效液相色譜法(HPLC)

益之康膠囊是以丹參、制何首烏、山楂、澤瀉、玉竹為主要原料,經(jīng)提取,輔以淀粉,經(jīng)制粒、混合、填充膠囊等工藝制成的保健食品,具有調(diào)節(jié)血脂的功能。其中制何首烏為寥科植物何首烏PolygonummultijiorumThunb.的干燥塊根經(jīng)燉法或蒸法炮制而成。性味苦、甘、澀,微溫,歸肝、心、腎經(jīng)。具有補(bǔ)肝腎,益精血,烏須發(fā),強(qiáng)筋骨,化濁降脂的功效,用于血虛萎黃,眩暈耳鳴,須發(fā)早白,腰膝酸軟,肢體麻木,崩漏帶下,高脂血癥[1]。現(xiàn)代藥理研究表明,何首烏提取物及其有效部位具有調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2-3]。何首烏的主要化學(xué)成分有五大類:二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類、磷脂類和多糖類[4],其中蒽醌類化合物主要包括游離蒽醌(游離型大黃素和大黃素甲醚)及其與葡萄糖形成的結(jié)合蒽醌,而結(jié)合蒽醌是何首烏導(dǎo)致瀉下作用的主要成分[5]。何首烏經(jīng)炮制成制何首烏后,結(jié)合蒽醌水解成無瀉下作用的游離蒽醌,從而降低毒性,減小副作用[6],但炮制不當(dāng)或不徹底仍會(huì)使結(jié)合蒽醌含量偏高[7],長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生腹瀉作用。國家食品藥品監(jiān)督管理總局(國食藥監(jiān)許[2010]2號(hào))要求以何首烏等含蒽醌類成分為原料的保健食品,在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)增加蒽醌類成分的含量檢測(cè)指標(biāo),并按照范圍值標(biāo)示。目前,蒽醌類成分的含量測(cè)定方法主要為紫外分光光度法[8-9]和高效液相色譜法[10-19]。紫外分光光度法雖然操作簡(jiǎn)單,但其干擾大,影響因素多,并且顯色不穩(wěn)定,所以實(shí)際難以準(zhǔn)確測(cè)定總蒽醌的含量。

本文參考中國藥典2015年版制何首烏項(xiàng)下蒽醌類成分的含量測(cè)定方法以及朱培芳[10],蔡麗芬[12],徐乾麗[16],戴作波[17],胡建華[19]等的研究成果,以大黃素和大黃素甲醚對(duì)照品為對(duì)照,采用高效液相色譜法測(cè)定益之康膠囊中總蒽醌的含量,制何首烏中總蒽醌有游離型和結(jié)合型兩種,結(jié)合型的蒽醌主要與苷元結(jié)合存在,需要將其水解成游離型蒽醌,并以原游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌水解而成的游離型蒽醌的含量來計(jì)算益之康膠囊中總蒽醌的含量。本文用HPLC法測(cè)定益之康膠囊中總蒽醌的含量,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,為益之康膠囊的質(zhì)量控制提供了一種新手段。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

對(duì)照品大黃素(110756-201512,含量測(cè)定用,純度98.7%,使用前不需干燥)和大黃素甲醚(110758-201415,含量測(cè)定用,純度99.1%,使用前無需處理) 均由中國食品藥品檢定研究院提供,色譜純的甲醇和乙腈 默克公司;分析純的三氯甲烷 南京化學(xué)試劑股份有限公司;優(yōu)級(jí)純的鹽酸和分析純的磷酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;益之康膠囊 由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供,批號(hào)分別為研究用樣、1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008。

Agilent1260型高效液相色譜儀(G1311B 1260 Quat Pump,G1367E 1260 Hip ALS,G1316A 1260 TCC,G1314F 1260 VWD);紫外檢測(cè)器Agilent色譜工作站。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Waters Sunfire C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 大黃素對(duì)照品溶液:取大黃素對(duì)照品約20 mg,精密稱定,用甲醇溶解,定容到50 mL,即得。大黃素甲醚對(duì)照品溶液:取大黃素甲醚對(duì)照品約20 mg,精密稱定,先用少量三氯甲烷溶解,然后用甲醇定容到250 mL,即得。分別精密吸取0.4327 mg/mL的大黃素對(duì)照品溶液5 mL和0.0884 mg/mL的大黃素甲醚對(duì)照品溶液10 mL,混合后用甲醇稀釋并定容到20 mL,即得混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 取本品內(nèi)容物適量,研細(xì),取約2.000 g,精密稱定,置回流瓶中,精密加入8%鹽酸溶液25 mL和三氯甲烷25 mL,水浴中加熱回流1 h,取出,立即冷卻,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,洗液并入分液漏斗中,分取三氯甲烷液,酸液再用三氯甲烷振搖提取3次(30、20、20 mL),合并三氯甲烷液,回收溶劑至干,殘?jiān)蛹状际谷芙?轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.2.4 檢出限 將同一批供試品溶液稀釋成一系列濃度的溶液,以取樣量為2.000 g,信噪比約為3時(shí)計(jì)算檢出限。

1.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取1.2.2中大黃素和大黃素甲醚的混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6 μL,按照1.2.1中的色譜條件注入高效液相色譜儀中,記錄大黃素、大黃素甲醚的峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線用Y=aX+b表示。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2.2中大黃素和大黃素甲醚的混合對(duì)照品溶液10 μL,按照1.2.1中的色譜條件注入高效液相色譜儀中且連續(xù)進(jìn)樣六次,計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.7 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2.3中的供試品(研究用樣)溶液10 μL,按照1.2.1中的色譜條件于1、2、4、6、10、12、18、24 h后進(jìn)樣,計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取同一批供試品(研究用樣)6份,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算RSD。

1.2.9 專屬性實(shí)驗(yàn) 取沒有制何首烏的陰性樣品,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.10 回收率實(shí)驗(yàn) 取供試品(1604003)適量,研細(xì),取約2.0 g,精密稱定,置回流瓶中,按低、中、高三個(gè)水平精密加入混合對(duì)照品溶液(平行三份),按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率和RSD。

1.2.11 樣品測(cè)定 按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣,分別測(cè)定了廠家提供的6批樣品(批號(hào)分別為1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008)。

1.2.12 計(jì)算 大黃素和大黃素甲醚的含量按式(1)計(jì)算:

式(1)

注：A-大黃素(或大黃素甲醚)的峰面積;b-大黃素(或大黃素甲醚)線性方程的截距;a-大黃素(或大黃素甲醚)線性方程的斜率;V1-進(jìn)樣體積(μL);V2-稀釋倍數(shù)(mL);m-供試品稱樣質(zhì)量(g)。

總蒽醌的含量按式(2)計(jì)算:

總蒽醌含量(mg/g)=大黃素的含量+大黃素甲醚的含量

式(2)

所有計(jì)算都在Microsoft Excel 2016中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1檢出限

以供試品溶液信噪比約為3時(shí)計(jì)算得大黃素和大黃素甲醚的檢出限分別為0.86 μg/g和0.87 μg/g。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision results of the proposed HPLC method

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability results of the proposed HPLC method

2.2線性關(guān)系考察

如表1所示,大黃素和大黃素甲醚在0.054～0.65 μg和0.022～0.2700 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9999。

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

如表2所示,大黃素和大黃素甲醚的RSD分別為0.08%和0.10%,表示儀器精密度良好。

2.4溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

如表3所示,大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌在24 h內(nèi)的RSD分別為1.85%、3.47%和2.04%,表示溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

如表4所示,供試品(研究用樣)測(cè)得大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌的平均含量分別為0.1369、0.0181、0.1549 mg/g,RSD分別為1.37%、1.56%和1.21%,表明方法的重復(fù)性良好。

2.6專屬性實(shí)驗(yàn)

取沒有制何首烏的陰性樣品,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果在大黃素和大黃素甲醚對(duì)照品峰處未出現(xiàn)色譜峰,說明按上述方法測(cè)定,陰性樣品無干擾,見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of emodin and physcion 注;A:混標(biāo)色譜圖,B:樣品色譜圖, C:缺制何首烏的樣品色譜圖。

2.7回收率實(shí)驗(yàn)

如表5所示,大黃素的加標(biāo)平均回收率為97.20%,RSD為2.26%,大黃素甲醚為99.96%,RSD為2.18%。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability results of the proposed HPLC method

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Average spike recoveries and RSDs for emodin and physcion

2.8樣品測(cè)定

1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008樣品中的大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌的含量如表6所示,本實(shí)驗(yàn)中的蒽醌主要來自配方中的制何首烏,2015版中國藥典中規(guī)定制何首烏中游離蒽醌以大黃素和大黃素甲醚的總量計(jì),并且含量不得少于0.10%,本實(shí)驗(yàn)測(cè)的總蒽醌包括游離蒽醌和結(jié)合蒽醌兩部分,目前暫無國標(biāo)要求。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果Table 6 The results of samples

表7 前處理優(yōu)化結(jié)果Table 7 The results of preprocessing optimization

2.9前處理優(yōu)化

采用(1)8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸,三氯甲烷(2)16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸,三氯甲烷來水解結(jié)合型蒽醌并提取總蒽醌,結(jié)果如表7所示。實(shí)驗(yàn)證明8%鹽酸,三氯甲烷法的總蒽醌含量最高,其潛在原因可能是大黃素甲醚極性較弱,在甲醇中的溶解性較低,而其在益之康膠囊中含量又不高,故提取效率不高,同時(shí)三氯甲烷極性較弱,根據(jù)相似相溶原理可知,大黃素甲醚能溶于三氯甲烷,雖然其在益之康膠囊中含量不高,但經(jīng)過三氯甲烷多次萃取,基本能將游離型蒽醌中的大黃素甲醚提取完全。

2.10流動(dòng)相的比較

本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)不同流動(dòng)相(1)乙腈-0.1%磷酸溶液(60∶40)、(2)甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)、(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)的色譜行為進(jìn)行了比較。在(2)甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)中,大黃素未完全分離,前峰腳位置包含未知物質(zhì);在(1)乙腈-0.1%磷酸溶液(60∶40)和(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)中,大黃素和大黃素甲醚能完全分離,但在(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)中,大黃素和大黃素甲醚附近干擾較少,同時(shí)甲醇的成本比乙腈低廉,所以選擇(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)作為流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相的色譜圖Fig.2 Chromatograms of different mobile phase

2.11柱溫的比較

本實(shí)驗(yàn)比較了不同柱溫30、35、40 ℃對(duì)樣品分離的影響,結(jié)果隨著柱溫升高出峰時(shí)間加快,如圖3所示,在30 ℃時(shí)峰形較好。

圖3 不同柱溫的色譜圖Fig.3 Chromatograms of different temperature

3 結(jié)論

益之康膠囊中的總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)主要來自于配方中的制何首烏,通過8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽酸水解結(jié)合型蒽醌后經(jīng)三氯甲烷多次萃取,能較好的提取出大黃素和大黃素甲醚,并用高效液相色譜測(cè)定大黃素和大黃素甲醚的含量,將大黃素和大黃素甲醚的含量之和作為總蒽醌的含量。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證,說明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠:大黃素和大黃素甲醚分別在0.05409～0.6491 μg和0.02211～0.2653 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9999,平均回收率分別為97.20%(RSD=2.26%)和99.96%(RSD=2.18%)。同時(shí),由于大黃素甲醚微溶于甲醇,應(yīng)先用少量三氯甲烷溶解后再用甲醇定容。

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Determinationoftotalanthraquinone(emodinandphyscion)inYizhikangcapsulebyhighperformanceliquidchromatography

SHOULin-jun1,CHENGQiao-yuan2,HUANGLiu-qian1,ZHOUMing-hao1,2,*

(1.Zhejiang University of Technology,College of Chemical Engineering,Hangzhou 310014,China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

Objective:To establish a High Performance Liquid Chromatography(HPLC)method for determining the totalanthraquinone in Yizhikang capsule. Methods:The contents of emodin and physcion were determined by a HPLC method. The emodin and physcion were separated on a Waters Sunfire C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)using a mobile phase made up of methanol and 0.1% phosphoric acid solution(75∶25,v/v)at a flow rate of 1.0 mL/min and detected by a UV detector at a wavelength of 254 nm.The column temperature was set at 30 ℃.Results:The response showed good linear relationship in the range of 54.09～649.05 μg/mL for emodin,22.11～265.31 μg/mL for physcion with all the coefficients of correlation(R2)=0.9999.The detection limits(LODs)were 0.86 μg/g for emodin,0.87 μg/g for physcion,respectively. The average recoveries of emodin and physcion were 97.20%(RSD=2.26%)and 99.96%(RSD=2.18%),respectively. Conclusions:This method is simple,accurate,reliable and reproducible and can be used for the quality control of yizhikang capsule.

Yizhikang capsule;emodin;physcion;total anthraquinone;high performance liquid chromatography(HPLC)

2017-03-03

壽林均(1993-)，男，碩士，研究方向：保健食品及化妝品的檢測(cè)，E-mail：1837393007@qq.com。

*

周明昊(1971-)，男，碩士，主任藥師，研究方向：保健食品及化妝品的檢測(cè)，E-mail：zmh888@hotmail.com。

TS207.3

A

1002-0306(2017)21-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.050