清咽潤(rùn)喉雙華李涼果的研制及功效評(píng)價(jià)

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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

清咽潤(rùn)喉雙華李涼果的研制及功效評(píng)價(jià)

宋倩,周愛梅*,王爽,胡燕敏,方瓊謎,李雪娜,林春秀

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

本文以雙華李果胚為原料,采用響應(yīng)面優(yōu)化四種中草藥(金銀花、甘草、胖大海、薄荷)提取濃縮液的復(fù)配比,結(jié)合涼果傳統(tǒng)加工工藝研發(fā)一種具有清咽潤(rùn)喉功效的雙華李涼果,以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞為模型,通過對(duì)炎癥因子(TNF-α、IL-lβ、IL-6、PGE2、NO)分泌的影響評(píng)價(jià)其清咽潤(rùn)喉效果。結(jié)果表明,四種中草藥提取濃縮液的最佳復(fù)配濃度分別為:金銀花56 mg/mL、甘草59 mg/mL、胖大海61 mg/mL、薄荷105 mg/mL。在炎癥反應(yīng)中,一定濃度的樣品均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低(p<0.05),而對(duì)PGE2的分泌沒有顯著性影響(p>0.05);當(dāng)濃度達(dá)到為50 mg/L時(shí)的抑制抑制作用最強(qiáng),對(duì)TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,說明研制的雙華李涼果能夠抑制炎癥因子的分泌,具有清咽潤(rùn)喉功效。

雙華李,涼果,中草藥提取液,脂多糖,抑制炎癥

涼果是以果蔬等為主要原料,經(jīng)腌制、漂洗、糖(蜜)熬煮或浸漬,添加或不添加食品添加劑和其他輔料,經(jīng)晾曬(烘干)等干燥處理加工而成的干態(tài)或半干態(tài)制品[1]。廣式?jīng)龉钍芟M(fèi)者喜愛[2],而雙華李含有大量的礦物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸等,營(yíng)養(yǎng)成分種類非常豐富,是制作廣式?jīng)龉闹饕a(chǎn)原料之一[3]。近年來,具有一定保健功能的新型涼果成為研究熱點(diǎn)[4-6],而日趨嚴(yán)重的環(huán)境污染使越來越多的人患有咽喉病[7],因此清咽潤(rùn)喉功能性涼果的研究具有積極意義。而傳統(tǒng)的清咽潤(rùn)喉涼果類產(chǎn)品,如黃皮[8]、李子等,功效并不顯著,且產(chǎn)品經(jīng)糖漬后會(huì)極大掩蓋原料的固有功效。

因此本實(shí)驗(yàn)以雙華李果為原料,添加國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)的具有清咽潤(rùn)喉功能的金銀花、甘草、胖大海、薄荷提取液,研發(fā)一種具有清咽潤(rùn)喉功效的雙華李涼果,并采用RAW264.7巨噬細(xì)胞模型評(píng)價(jià)其對(duì)炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、PGE2、NO分泌的影響,一方面可以豐富涼果市場(chǎng),另一方面又可以豐富保健食品市場(chǎng),為消費(fèi)者提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

硫藏雙華李果胚、金銀花、甘草根、胖大海、薄荷 廣東展翠食品有限公司提供;金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌 廣東省微生物菌種保藏中心;RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù);亞硝酸鈉、二甲基亞砜、DMEM培養(yǎng)基、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胎牛血清、二甲亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素 由Sigma公司提供;Mouse TNF-α、IL-1β、IL-6、PEG2ELISA試劑盒 南京建成公司;檸檬酸 市售分析純;糖 市售食品級(jí)白糖。

EZ-SX500N質(zhì)構(gòu)儀 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;EnSpire酶標(biāo)儀 PerkinElmer公司;LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SWCJ-A超凈工作臺(tái) 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙華李涼果的制備 雙華李涼果的制作工藝流程:硫藏雙華李果胚→脫鹽→脫硫→硬化→扎孔→第一次滲糖→第二次滲糖→第三次滲糖→第四次滲糖→干燥→成品(關(guān)鍵控制點(diǎn)為脫硫、滲糖、干燥)[10]。

清洗:選用飽滿、大小均一的硫藏雙華李果胚,清洗干凈。

脫鹽:將果胚在清水(自來水)中浸泡20 h進(jìn)行脫鹽。

脫硫:將果胚置于4%的檸檬酸液中于90 ℃下燙漂15 min[11](質(zhì)量比1∶5)。

硬化:將果胚置于硬化液(0.5% NaCl、0.2%檸檬酸、0.5%CaCl)中進(jìn)行硬化5 h(質(zhì)量比3∶1)。

第一次滲糖:將四種中草藥(金銀花、甘草、胖大海、薄荷)提取濃縮液(100 mg/mL)、蔗糖、甜味劑與水混合得到糖液(金銀花,56 mg/mL;甘草,59 mg/mL;胖大海,61 mg/mL;薄荷,105 mg/mL;蔗糖濃度,15%;甜菊糖,0.15 g/kg,其中中草藥濃度為滲糖溶液中最終質(zhì)量濃度),將糖液與果胚(質(zhì)量比3∶1)一起于90 ℃下加熱煮制,進(jìn)行第一次滲糖,煮至糖液濃度約為20%左右(糖度計(jì)測(cè)定),浸泡24 h。

第二次滲糖:在第一次滲糖的基礎(chǔ)上,加入蔗糖使糖液濃度為30%左右(糖度計(jì)測(cè)定),浸泡24 h,進(jìn)行第二次滲糖。

第三次滲糖:在第二次滲糖的基礎(chǔ)上,加入蔗糖使糖液濃度為40%左右,浸泡48 h,進(jìn)行第三次滲糖。

第四次滲糖:在第三次滲糖的基礎(chǔ)上,加入蔗糖使糖液濃度為45%左右,浸泡48 h,進(jìn)行第四次滲糖。

干燥:將滲糖后的雙華李果在55 ℃的恒溫干燥箱中干燥至水分含量為25%左右取出,放于密閉的容器中儲(chǔ)存。

1.2.2 四種中草藥提取濃縮液最佳復(fù)配濃度的確定 前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌為供試菌,以抑菌圈大小為指標(biāo),根據(jù)單一中草藥提取濃縮液的抑菌效果選取三個(gè)水平,利用響應(yīng)面中的中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)這四種中草藥之間協(xié)同抑菌實(shí)驗(yàn),研究這四種草藥之間的協(xié)同作用。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.3 加權(quán)評(píng)分計(jì)算 根據(jù)細(xì)菌引起咽喉炎的影響程度,將金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌的權(quán)重設(shè)為30、40、30,計(jì)算公式如下:

Y(加權(quán)評(píng)分)=d1/d1max×30+d2/d2max×40+d3/d3max×30

其中,d1為提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小;d2為提取液對(duì)乙型鏈球菌的抑菌圈大小;d3為提取液對(duì)肺炎雙球菌的抑菌圈大小;d1、d2、d3均為平均值。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)方法 中草藥提取濃縮液的制備采用水提法提取中草藥,準(zhǔn)確稱取10 g中草藥,加入20 mL蒸餾水,至于恒溫水浴鍋提取4 h,過濾(其中,中草藥的最佳提取條件為:胖大海和甘草的料液比為1∶30 (g/mL),最適溫度為70 ℃;金銀花的料液比為1∶25 (g/mL),最適溫度為70 ℃;薄荷的料液比為1∶30 (g/mL),最適溫度為90 ℃)。將濾液60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮液至10 mL(若少于10 mL,加蒸餾水補(bǔ)足至刻度),作為母液(1 g生藥/mL),過0.2 μm濾膜除菌無菌密封4 ℃保存。在無菌工作臺(tái)中,將已滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化,倒在培養(yǎng)皿內(nèi),每皿約15～20 mL,凝固后用馬克筆標(biāo)記牛津杯擺放位置。吸取100 μL已稀釋好后的菌懸液(107～108cfu/mL)打入凝固好的培養(yǎng)基表面,用無菌涂布棒將菌液涂布均勻,待培養(yǎng)基表面菌液干透后,在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯,輕輕加壓,使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在杯中加入已稀釋的中草藥提取濃縮液(100 mg/mL)200 μL,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后取出用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。以無菌水作空白對(duì)照,以山梨酸鉀溶液(0.12 g/mL)作陽(yáng)性對(duì)照[12]。

1.2.5 雙華李涼果指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 感官評(píng)分 根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)選三組中草藥復(fù)配比進(jìn)行涼果制備,分別對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分[13],篩選最佳復(fù)配比成分,感官評(píng)分見表2。

表2 感官評(píng)定方法Table 2 Sensory assessment method

1.2.5.2 顏色測(cè)定 采用全自動(dòng)測(cè)色色差儀檢測(cè)果胚褐變情況[14]。其中L*表示樣品亮度,a*代表樣品紅綠程度,b*表示樣品黃藍(lán)程度。

1.2.5.3 質(zhì)構(gòu)測(cè)定 采用EZ-SX500N質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定,測(cè)定條件為,探頭型號(hào):A/W EG;測(cè)前速率:1 mm/s;測(cè)試速率:2 mm/s;測(cè)后速率:5 mm/s;下壓距離:5 mm;觸發(fā)力大小:5 g。以最大剪切力(g)表示樣品硬度[15]。

1.2.6 雙華李涼果清咽潤(rùn)喉功效的評(píng)價(jià)

1.2.6.1 雙華李涼果提取液的制備 取制備的雙華李涼果樣品1 g置于100 mL蒸餾水中,在50 ℃條件下進(jìn)行磁力攪拌5 h,離心(5000 r/min,15 min)收集上清液,稀釋成不同濃度(0.1、10、50、100、200、400、500 mg/L)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所用細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系,于DMEM完全培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合后進(jìn)行傳代,1～2 d換一次培養(yǎng)液,4～6 d傳代一次[16-17]。所用操作均為無菌操作。

1.2.6.3 雙華李涼果提取液的細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,每孔體積200 μL。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,更換培養(yǎng)基,加入不同濃度的雙華李涼果提取液共同培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入5 mg/mL MTT試劑20 μL繼續(xù)孵育4 h,棄上清后每孔加入150 μL DMSO并振蕩30 min溶解沉淀[17-18]。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值(OD值),以無細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白,以正常細(xì)胞孔為對(duì)照,以含樣品的孔為樣品組,通過以下公式計(jì)算得到相對(duì)活性:

1.2.6.4 雙華李涼果提取液對(duì)PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子分泌的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞以1×105/孔的濃度接種于12孔板,每孔體積2 mL。置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組,雙華李樣品組(200,100,50,10,0.1 mg/L),LPS組(1 mg/L)和LPS(雙華李組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,依小鼠PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書測(cè)定含量。各炎癥因子標(biāo)準(zhǔn)曲線為:TNF-α,y=0.0013x+0.0373(R2=0.9990);IL-1β,y=0.003x-0.021(R2=0.9994);IL-6,y=0.0029x+0.1023(R2=0.9975);PGE2,y=0.0043x+0.079(R2=0.9948)。

1.2.6.5 雙華李涼果對(duì)NO炎癥因子分泌的影響 于96孔板中,每孔加RAW264.7細(xì)胞懸液(1.0×105cells/mL)100 μL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h,棄去培養(yǎng)液,加入含不同濃度藥物的新鮮完全培養(yǎng)液100 μL(陽(yáng)性對(duì)照不加藥),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,加入含LPS的完全培養(yǎng)液使終濃度為1 mg/mL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至另一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,各孔加入Griess A和Griess B混合試劑(1∶1)100 μL,暗處避光反應(yīng)10 min,于540 nm處測(cè)定OD值[19]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0048x+0.0028,R2=0.9997)計(jì)算待測(cè)樣品中NO含量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS Statistics 17.0.1軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1四種中草藥提取濃縮液最佳復(fù)配濃度的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,利用Design-Expert8.0.6程序?qū)?0個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合,以加權(quán)分為指標(biāo)得到二次多項(xiàng)回歸模擬方程為:

Y=65.72-2.13A-1.76B-2.54C-1.94D+2.41AB+2.60AC+2.02AD+0.82BC+0.60BC+2.40CD-0.87A2+4.42B2+3.68C2+0.68D2

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and result

表4 回歸系數(shù)模型及方差分析Table 4 Regression coefficient model and variance analysis

注：*代表0.05水平顯著;**代表0.01水平顯著。

由表4的分析結(jié)果可知,整體模型的“Prob>F”值為0.0090,表明模型的擬合度較好,能較好的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。表中各個(gè)因素的F值越大表明該因素對(duì)抑菌效果的影響越顯著,各中草藥提取濃縮液對(duì)復(fù)配后抑菌效果的影響大小為:胖大海>金銀花>薄荷>甘草。同時(shí),回歸方程的二次項(xiàng)B2和C2對(duì)復(fù)配抑菌效果均有極顯著影響,表明各因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而是呈二次關(guān)系。

對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,得到的四種中草藥提取濃縮液的最佳復(fù)配濃度為:金銀花為87.13 mg/mL、甘草為92.31 mg/mL、胖大海為52.02 mg/mL、薄荷為88.92 mg/mL,預(yù)測(cè)可得到復(fù)配后的抑菌加權(quán)分為92.84。為了檢測(cè)RSM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性,根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證?？紤]實(shí)際操作性,調(diào)整各中草藥提取濃縮液的濃度為:金銀花為87 mg/mL、甘草為92 mg/mL、胖大海為52 mg/mL、薄荷為89 mg/mL,測(cè)得該條件下四種中草藥復(fù)配后抑菌加權(quán)分為91.63(對(duì)三種供試菌的抑菌圈直徑分別為16.92、15.32、14.87 mm),抑菌加權(quán)評(píng)分為結(jié)果與模型預(yù)測(cè)得很接近。

考慮到制備的涼果成品還需要保證外觀和口感,因此另優(yōu)選其它兩組復(fù)配比(響應(yīng)面預(yù)測(cè)的較高評(píng)分組)和最優(yōu)復(fù)配比(記為復(fù)配組1)進(jìn)行感官評(píng)分對(duì)比,以確定最終的四種中草藥的復(fù)配比,所優(yōu)選的另外兩組分別記為復(fù)配組2(金銀花56 mg/L、甘草59 mg/L、胖大海61 mg/L、薄荷105 mg/L)、復(fù)配組3(金銀花95 mg/L、甘草59 mg/L、胖大海52 mg/L、薄荷116 mg/L)。

2.2三組雙華李涼果樣品的感官評(píng)分及質(zhì)構(gòu)對(duì)比

表5結(jié)果顯示,三組樣品感官評(píng)分有顯著性差異(p<0.05),其中復(fù)配組1的感官評(píng)分均比復(fù)配組2和組3低,樣品組2和組3的感官評(píng)分沒有顯著性差異(p>0.05),分別為81和83。

三組樣品涼果在硬度、彈性上沒有顯著差異(p>0.05),但在色澤方面,樣品組1的L*值和b*值均比樣品組2和組3低,而樣品2和3之間沒有顯著性差異(p>0.05),說明樣品1顏色整體較暗,分析原因是由于樣品1中加入的甘草提取液含量比其他兩組高,所以導(dǎo)致涼果果胚顏色較暗。

表5 三組雙華李樣品組的質(zhì)構(gòu)及色澤Table 5 The texture and color of the three groups

根據(jù)以上對(duì)三組雙華李涼果樣品的感官評(píng)分、質(zhì)地以及色澤方面的分析,確定復(fù)合組2為四種中草藥提取濃縮液的最佳組合,在此基礎(chǔ)上結(jié)合涼果的傳統(tǒng)加工工藝制備出清咽潤(rùn)喉雙華李涼果,并進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià)。

2.3RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

RAW264.7巨噬細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞重懸后于培養(yǎng)液中呈現(xiàn)透明狀,橢圓形;傳代2～4 h后開始貼壁,8 h以后大部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞生長(zhǎng)很快,在倒置顯微鏡下觀察,可見細(xì)胞形態(tài)以類圓形和不規(guī)則多邊形為主,少量有偽足。從圖1中可以看到細(xì)胞之間緊密連接,并且貼壁很緊,此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。

圖1 RAW264.7細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(100×)Fig.1 RAW264.7 cells,cell growth status(100×)

2.4雙華李涼果提取液的細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,用不同濃度(25,50,100,200,400,500 mg/L)雙華李涼果提取液處理RAW264.7細(xì)胞,孵育18 h,結(jié)果如圖2顯示。圖2表明,不同濃度的雙華李涼果提取液處理RAW264.7細(xì)胞18 h后,以對(duì)照組細(xì)胞活性為100%作比較,樣品在劑量400 mg/L內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性沒有顯著性差異(p>0.05),說明在此范圍內(nèi)所選的雙華李涼果的濃度不影響RAW264.7細(xì)胞的增殖活性,對(duì)細(xì)胞無毒性作用。此結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)雙華李涼果劑量組提供參考依據(jù),由此可以說明后續(xù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的結(jié)果,不是由細(xì)胞死亡引起,而是雙華李涼果直接或間接抗炎作用的結(jié)果。

圖2 雙華李涼果樣品對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞毒性分析Fig.2 Effect of shuanghua preserved fruit on RAW264.7 macrophage toxicity

2.5雙華李涼果提取液對(duì)PGE2、TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO分泌的影響

圖3為雙華李涼果提取液對(duì)PGE2、TNF-α、IL-6、IL-lβ、NO幾種炎癥因子分泌的影響。圖中結(jié)果所示,對(duì)于TNF-α、IL-6、IL-lβ、NO四種炎癥因子,LPS誘導(dǎo)的模型組與空白組之間細(xì)胞炎癥因子的分泌水平均有顯著性差異(p<0.05),說明造模成功,與模型組對(duì)照,雙華李涼果提取液一定濃度條件下均能夠顯著降低炎癥因子的分泌水平(p<0.05),當(dāng)雙華李涼果提取液濃度為50 mg/L時(shí)對(duì)抑制TNF-α的分泌作用最強(qiáng),抑制率達(dá)到54.42%;當(dāng)濃度在50、200、400 mg/L時(shí)對(duì)IL-lβ的抑制率分別為32.93%、35.83%、38.50%,繼續(xù)增加濃度后抑制效果不再顯著增加(p>0.05);當(dāng)濃度為50 mg/L時(shí)對(duì)IL-6的抑制作用最強(qiáng),抑制率達(dá)到69.14%;當(dāng)濃度增加到200 mg/L時(shí),對(duì)NO的分泌有顯著抑制作用(p<0.05),此時(shí)抑制率最大為27.17%。圖3結(jié)果所示,LPS誘導(dǎo)的模型組與空白組之間的PGE2含量沒有顯著性差異(p>0.05),說明LPS刺激細(xì)胞后并沒有引起PGE2的變化,但雙華李涼果提取液濃度在200 mg/L時(shí)對(duì)細(xì)胞因子PGE2的分泌有顯著抑制作用(p<0.05),抑制率為9.52%,其他濃度沒有顯著影響(p>0.05)。

在炎癥反應(yīng)中,與對(duì)照組相比,一定濃度下研制的雙華李涼果提取液均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低,而對(duì)PGE2的分泌沒有顯著性影響。綜合幾種對(duì)炎癥因子的抑制作用,當(dāng)雙華李涼果提取液濃度在50 mg/L時(shí)對(duì)細(xì)胞整體炎癥因子的抑制作用最強(qiáng)。在此最強(qiáng)抑制濃度下,對(duì)TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,Choi,J[17]等人的研究中顯示陽(yáng)性抗炎藥物吲哚美辛(3.58 mg/L)對(duì)于TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為41.57%、44.33%、41.19%、35.15%,說明此雙華李涼果具有較好的抗炎效果。

圖3 雙華李涼果提取液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌PGE2(a)、TNF-α(b)、IL-1β(c)、IL-6(d)和NO(e)的影響Fig.3 Effect of shuanghua preserved fruit on PGE2(a),TNF-α(b),IL-1β(c),IL-6(d)and NO(e)in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結(jié)論

金銀花、甘草、胖大海、薄荷四種中草藥提取濃縮液的最佳復(fù)配濃度為:金銀花56 mg/mL、甘草59 mg/mL、胖大海61 mg/mL、薄荷105 mg/mL,此時(shí)復(fù)配制備的涼果感官質(zhì)量最好。采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞為炎癥模型中,雙華李涼果樣品在400 mg/L內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有毒性。在炎癥反應(yīng)中,LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥因子分泌量與空白組對(duì)照有極顯著性增加,且一定濃度的樣品均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低,而對(duì)PGE2的分泌沒有顯著性影響,當(dāng)雙華李涼果提取液濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)對(duì)細(xì)胞驗(yàn)證因子的抑制作用最強(qiáng)。在此最強(qiáng)抑制濃度下,對(duì)TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,說明所研制的雙華李涼果具有較好的抑菌抗炎效果。

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Preparationandevaluationofshuanghuaplumpreservedfruitwithqingyaneffect

SONGQian,ZHOUAi-mei*,WANGShuang,HUYan-min,FANGQiong-mi,LIXue-na,LINChun-xiu

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

With shuanghua plum being used as material,the optimum mixture ratio of the extract of four Chinese herbs was optimized by the response surface method using bacteriostatic testinvitro,prepared a functional preserved fruit with qingyan effect was prepared in combination with the traditional processing technology. LPS-induced RAW264.7 macrophage inflammatory model was adopted to determine the anti-inflammatory activity of shuanghua plum preserved fruit using inflammatory cytokines(TNF-α,IL-lβ,IL-6,PGE2,NO)as indicators. The results showed that the optimal combination ratio of the extract of the four herbs were honeysuckle 56 mg/mL,licorice 59 mg/mL,sterculia scaphigera 61 mg/mL and peppermint 105 mg/mL. In the inflammatory response,the samples at appropriate concentrations could decrease inflammatory cytokines(TNF-α,IL-lβ,IL-6,NO)significantly(p<0.05),while there was no significant effect on PGE2secretion(p>0.05). The strongest inhibitory effect of the extract of shuanghua plum preserved fruit was obtained at the concentration of 50 mg/L. Under this concentration,the inhibition rate against TNF-α,IL-l,IL-6 and NO was 54.42%,69.14%,38.50% and 27.17%,respectively,demonstrating the anti-inflammatory effect of the developed shuanghua plum preserved fruit by decomposing the inflammatory factors. This showed that the shuanghua plum preserved fruit can inhibit the secretion of inflammatory factors,with qingyan effect.

shuanghua plum;preserved fruit;the extract of Chinese herbs;lipopolysaccharide;anti-inflammation

2017-01-13

宋倩(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬加工研究，E-mail：songq0609@163.com。

*

周愛梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品及農(nóng)產(chǎn)品深加工研究，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

廣東省省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2013B090600003)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)21-0174-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.035