超聲波輔助復(fù)合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝優(yōu)化

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(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州 730050;2.蘭州名德農(nóng)牧科技有限公司,甘肅蘭州 730010)

超聲波輔助復(fù)合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝優(yōu)化

張丙云1,王聰1,謝言言1，任海偉1,*,范文廣1,黃思瑤1,李志忠1,陳偉2

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州 730050;2.蘭州名德農(nóng)牧科技有限公司,甘肅蘭州 730010)

為實(shí)現(xiàn)羊胎盤深度開發(fā)利用,以肽得率和水解度為指標(biāo),篩選確定多種蛋白酶復(fù)合水解的最佳組合方案,并利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助復(fù)合酶法水解制備羊胎盤肽的預(yù)處理參數(shù)。結(jié)果表明,響應(yīng)面法優(yōu)化后的超聲預(yù)處理參數(shù)為超聲時(shí)間18 min、溫度28 ℃和功率420 W,超聲波預(yù)處理后羊胎盤經(jīng)木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶聯(lián)合同步復(fù)合酶解制備羊胎盤肽的肽得率為39.89%,水解度為21.78%;該最優(yōu)條件下平均肽鏈長(zhǎng)度為4.59,分子量約500～600。結(jié)論:超聲波輔助復(fù)合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝可行且有效。

藏系綿羊,羊胎盤肽,木瓜蛋白酶,風(fēng)味酶,超聲波預(yù)處理,工藝優(yōu)化

我國(guó)是養(yǎng)羊大國(guó),每年可供開發(fā)利用的羊胎盤潛藏量高達(dá)450萬個(gè)[1]。羊胎盤含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素,食用和藥用價(jià)值極高[2]。但大多數(shù)羊胎盤被廢棄處理,加工利用量不足總資源量的3%。同時(shí),羊的生殖期較為集中,導(dǎo)致大量羊胎盤在短期內(nèi)難以被加工處理,造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3]。

近年來,一些學(xué)者從活細(xì)胞素[4]、免疫調(diào)節(jié)因子[5]、保健品膠囊[6]、活性肽開發(fā)[7]等角度對(duì)羊胎盤進(jìn)行開發(fā)利用;其中有關(guān)活性肽的研究多集于在制備工藝(化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、酶解法)和活性研究(抗氧化活性、免疫活性)等方面[1-2,7]。研究表明,酶解法具有生產(chǎn)條件溫和、水解程度易于控制、可定位生產(chǎn)特定的肽、產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)成本低廉等特點(diǎn),是制備生物活性肽最常用的方法之一[8]。然而,酶法制備過程中,蛋白酶具有相對(duì)的底物專一性,底物不同對(duì)應(yīng)的酶切作用位點(diǎn)也不一樣,有必要針對(duì)特定的羊胎盤原料進(jìn)行蛋白酶篩選,并尋找能夠提高胎盤肽得率的預(yù)處理方法。

藏系綿羊是我國(guó)青藏高原寶貴的遺傳資源之一,主要分布于青海、甘南等高海拔寒旱地區(qū),具有耐高寒、耐缺氧、適應(yīng)性強(qiáng)等生物學(xué)特性[9]。本文以藏系綿羊胎盤肽的開發(fā)為目標(biāo),詳細(xì)考察木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶制備羊胎盤肽的酶解方案,在此基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波預(yù)處理參數(shù),以期得到制備羊胎盤肽的適宜預(yù)處理?xiàng)l件,為藏系綿羊胎盤肽的資源化利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

表1 雙酶組合酶解的參數(shù)設(shè)定Table 1 Parameter setting of the two enzymatic combination hydrolysis

注：第一次加酶水解6 h后,滅酶或不滅酶,第二次加酶繼續(xù)水解。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮藏系綿羊胎盤 羊體內(nèi)取出后-20 ℃冷庫低溫速凍保存,蘭州名德農(nóng)牧科技有限公司；木瓜蛋白酶 酶活力800000 U/g,廠家推薦適宜pH6.5～7.0,適宜溫度50 ℃;風(fēng)味酶 酶活力20000 U/g,廠家推薦適宜pH7.0～7.5,適宜溫度50 ℃;菠蘿蛋白酶 酶活力500000 U/g,廠家推薦適宜pH6.8～7.2,適宜溫度45 ℃;中性蛋白酶 酶活力200000 U/g,廠家推薦適宜pH7.0,適宜溫度50 ℃;堿性蛋白酶 酶活力20000 U/g,廠家推薦適宜pH8.0～10.0,適宜溫度50 ℃。酶 購于南寧龐博生物工程有限公司。

FA25高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;L-550臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司;KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SH220N石墨消解儀、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮羊胎盤洗凈、瀝干水分后剪碎,用高剪切分散乳化機(jī)均質(zhì),并以質(zhì)量比1∶5加入蒸餾水,20 ℃恒溫水浴2 h,然后3900 r/min離心20 min,取其沉淀(羊胎盤提取殘留物)作為酶解原料[10]。

1.2.2 蛋白水解酶的篩選 以肽得率和水解度為指標(biāo),從木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶中篩選適宜的蛋白水解酶,酶解條件依據(jù)參考文獻(xiàn)統(tǒng)一設(shè)置為酶添加量4000 U/g,酶解時(shí)間1 h,無酶添加作為對(duì)照組[11]。同時(shí),通過酶解液的色澤、渾濁程度和腥味對(duì)不同處理組的酶解液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[12]。

1.2.3 木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶的酶解條件確定 準(zhǔn)確稱取2.00 g羊胎盤提取殘留物36份置于錐形瓶中,分別加入100 mL、pH分別為6.5(木瓜蛋白酶)和7.5(風(fēng)味酶)的磷酸緩沖液,再按照酶添加量2000、4000、6000、8000和10000 U/g梯度加入相應(yīng)的酶進(jìn)行水解,無酶添加作為對(duì)照組。50 ℃恒溫酶解,時(shí)間分別為1、2、3、4、5和6 h[13]。酶解結(jié)束后立即沸水浴10 min滅酶,然后快速冷卻到室溫并3900 r/min離心20 min,取上清液于100 mL容量瓶中定容,分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測(cè)定總氮和氨基氮含量,計(jì)算肽得率和水解度,確定適宜的酶添加量和酶解時(shí)間[14-15]。

1.2.4 雙酶復(fù)合酶解的組合方案確定 木瓜蛋白酶的適宜pH6.5～7.0,風(fēng)味酶的適宜pH7.0～7.5,因此在pH7.0,50 ℃條件下,按照表1中不同酶解組合方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),水解結(jié)束后于3900 r/min離心20 min,取上清液于100 mL容量瓶中定容,分析上清液的總氮和氨基氮含量,根據(jù)肽得率和水解度等指標(biāo)確定適宜的組合方案。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取一定量羊胎盤提取殘留物,以肽得率和水解度為指標(biāo),按照以下設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),確定各因素的取值范圍。各單因素水平設(shè)計(jì)如下:固定超聲溫度40 ℃、超聲功率240 W,超聲時(shí)間分別取5、10、15、20、25、30 min。固定超聲功率240 W、超聲時(shí)間20 min,超聲溫度分別取25、30、35、40、45、50 ℃。固定超聲時(shí)間20 min、超聲溫度30 ℃,超聲功率分別取240、300、360、420、480、500 W。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定酶解法制備羊胎盤肽的適宜工藝參數(shù)。

1.2.7 測(cè)定方法 水分測(cè)定參照GB/T 6435-2014;蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB/T 5009.5-2010。水解度、肽得率和平均肽鏈長(zhǎng)度分別按式(1)、式(2)、式(3)計(jì)算[14-16]。平均分子量的計(jì)算參照文獻(xiàn)[17]。

式(1)

式(2)

式(3)

式中:DH表示水解度,%;N1表示上清液氨基氮,g;N表示原料總氮,g;PY表示肽得率,%;N2表示上清液總氮,g;PCL表示平均肽鏈長(zhǎng)度;W表示原料總蛋白質(zhì),g。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Excel軟件處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù),用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)不同處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,p<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。用Design～Expert V8.0.6對(duì)超聲波預(yù)處理參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1羊胎盤肽蛋白水解酶的篩選

由圖1可知,與對(duì)照組(未添加蛋白酶)相比,添加5種蛋白酶作用后的肽得率和水解度均顯著(p<0.05)提高,且木瓜蛋白酶對(duì)應(yīng)的肽得率和水解度分別為22.93%和13.53%,肽得率顯著(p<0.05)高于風(fēng)味酶(17.25%)、中性蛋白酶(19.18%)、堿性蛋白酶(21.75%)和菠蘿蛋白酶(21.70%);水解度也顯著(p<0.05)高于風(fēng)味酶(12.94%)、中性蛋白酶(13.67%)和堿性蛋白酶(11.76%),但顯著(p<0.05)低于菠蘿蛋白酶(15.79%)。計(jì)算不同條件下的平均肽鏈長(zhǎng)度和平均分子量發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶作用后的平均肽鏈長(zhǎng)度為7.39,肽平均分子量約831.01,明顯高于菠蘿蛋白酶(6.33,714.64),與中性蛋白酶(7.32,822.68)相近,但明顯低于風(fēng)味酶(7.73,868.08)和堿性蛋白酶(8.50,953.37)。這是因?yàn)椴煌N類蛋白酶的酶解作用位點(diǎn)有很大差異,木瓜蛋白酶酶切位點(diǎn)在Arg-,Lys-,Phe-,X-等位置,特異性廣泛;風(fēng)味酶酶切位點(diǎn)有Arg-,Lys-,Leu-,Val-等,菠蘿蛋白酶酶切位點(diǎn)在Lys-,Ala-,Tyr-,Gly-,中性蛋白酶的酶切位點(diǎn)在Leu-,Phe-等,堿性蛋白酶酶切位點(diǎn)在Ala-,Leu-,Val-,Tyr-,Phe-,Trp-[10,18-19]。藏系綿羊胎盤中Asp、Glu、Leu、Lys、Arg和Val等氨基酸含量豐富[9],木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶在Lys、Leu和Arg處均有切割位點(diǎn),且木瓜蛋白酶能作用的位點(diǎn)較多,使木瓜蛋白酶作用后的肽得率和水解度相對(duì)較高。

圖1 不同種類蛋白酶的篩選Fig.1 Screening of different kinds of protease注:圖中不同大寫字母表示肽得率差異顯著(p<0.05), 不同小寫字母表示水解度差異顯著(p<0.05)；圖2～圖5同。

從表2酶解液的感官分析結(jié)果可知,風(fēng)味酶具有一定的脫腥和調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用;與風(fēng)味酶相比,盡管堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶有較好的酶解效果,但這三種酶作用后的酶解液腥味較重,這與朱蓓薇[12]等研究結(jié)果一致。綜合考慮酶解效果、感官質(zhì)量等因素,選擇木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶進(jìn)行后續(xù)酶解實(shí)驗(yàn)。

表2 不同種類蛋白酶作用后酶解液的感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation of enzymatic hydrolysate by different proteases

2.2木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶的酶解條件確定

2.2.1 木瓜蛋白酶的酶解實(shí)驗(yàn) 由表3可知,當(dāng)酶添加量介于0～6000 U/g時(shí),肽得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,分別在4 h或5 h時(shí)達(dá)到最高值,之后維持穩(wěn)定不再增加;當(dāng)酶添加量為8000 U/g和10000 U/g時(shí),肽得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降趨勢(shì),分別在5 h或4 h時(shí)達(dá)到最高值。另一方面,肽得率隨著酶添加量的增加呈先升高后下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)槊柑砑恿康脑黾訉?dǎo)致酶解產(chǎn)物不斷積累,酶活性受到反饋抑制,導(dǎo)致酶解效率有所降低[20]。同時(shí),隨著酶劑量的增加,水解效率大幅提高,肽得率到達(dá)高峰值的時(shí)間逐漸縮短,6000、8000、10000 U/g三種劑量分別在6、5、4 h時(shí)最高,分別高達(dá)25.40%、30.92%和28.53%。

當(dāng)酶添加量介于0～4000 U/g時(shí),水解度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì),當(dāng)酶添加量介于6000～10000 U/g時(shí),水解度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì),在5 h或6 h時(shí)達(dá)到最高值;另一方面,水解度隨著酶添加量的增加也顯著升高,當(dāng)酶添加量為10000 U/g時(shí)的水解度始終顯著(p<0.05)高于其余添加量,但過高劑量酶制劑會(huì)導(dǎo)致成本上升;當(dāng)酶添加量為6000 U/g、水解6 h時(shí)的水解度也顯著(p<0.05)高于其它酶添加量的水解度,且與10000 U/g、6 h時(shí)水解度差異不顯著(p>0.05)。同時(shí),水解度越高,平均肽鏈長(zhǎng)度越小,相應(yīng)的分子量越小。酶添加量為6000 U/g、酶解6 h時(shí)水解度高達(dá)15.82%,此時(shí)肽鏈長(zhǎng)度為6.32,相應(yīng)分子量約713.20,屬于小分子肽范疇[17]。

綜合考慮水解效果、酶制劑成本等因素,確定木瓜蛋白酶的適宜添加量為6000 U/g,酶解時(shí)間為6 h,此時(shí)所得酶解液澄清透亮、腥味最弱,感官質(zhì)量最佳。

表3 木瓜蛋白酶添加量和酶解時(shí)間的篩選Table 3 Screening of the amount and time of enzymatic hydrolysis of papain

注：不同大寫字母表示相同酶添加量不同時(shí)間差異顯著(p<0.05);不同小寫字母表示同一時(shí)間不同酶添加量差異顯著(p<0.05)；表4同。

表4 風(fēng)味酶添加量和酶解時(shí)間的篩選Table 4 Screening of the amount and time of enzymatic hydrolysis of flavor enzyme

2.2.2 風(fēng)味酶的酶解實(shí)驗(yàn) 由表4可知,當(dāng)酶添加量介于0～4000 U/g范圍時(shí),肽得率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高;當(dāng)酶添加量介于6000～10000 U/g范圍時(shí),肽得率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后下降趨勢(shì);另一方面,肽得率隨著酶添加量的提高呈先升高后下降趨勢(shì),當(dāng)酶添加量在4000 U/g或6000 U/g時(shí)肽得率達(dá)到較高水平;酶添加量增至8000 U/g后,肽得率反而急劇下降至7%左右,這與木瓜蛋白酶變化趨勢(shì)基本一致。

從水解度角度而言,無論酶添加量多少,水解度均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì),隨酶添加量的增加呈逐漸升高趨勢(shì),但添加量為4000 U/g和6000 U/g時(shí)的水解度差異始終不顯著(p>0.05)。從水解效果分析,盡管風(fēng)味酶在添加量4000 U/g、時(shí)間為4 h條件下肽得率較高,之后隨時(shí)間延長(zhǎng)肽得率變化不顯著(p>0.05);但結(jié)合4、5、6 h時(shí)的酶解液感官評(píng)價(jià)結(jié)果分析,較長(zhǎng)時(shí)間的酶解反應(yīng)有利于改善羊胎盤肽液的感官質(zhì)量。因此,綜合考慮確定風(fēng)味酶的適宜添加量為4000 U/g、適宜酶解時(shí)間為6 h。

2.3雙酶組合酶解實(shí)驗(yàn)

由圖2可知,木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶無論同時(shí)添加(方案5)或分步添加(方案1～4),兩種酶的復(fù)合酶解效果均優(yōu)于單酶作用,且同步復(fù)合酶解的方案5效果最好,肽得率和水解度均達(dá)到最高值,分別為37.08%和19.52%,比木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶單一酶解時(shí)的肽得率分別提高了31.50%和47.22%,水解度分別提高了18.95%和28.64%。因?yàn)槟竟系鞍酌笇儆诤瑤€基(-SH)肽鏈內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有較廣泛的特異性,對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的酶解能力,風(fēng)味酶起到調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用,將兩種酶組合可以對(duì)底物原料進(jìn)行多位點(diǎn)作用,提高酶與底物的接觸頻率和作用位點(diǎn),使其充分酶解,提高酶解效果[10]。因此,確定最優(yōu)酶解組合方式為同時(shí)加入6000 U/g木瓜蛋白酶和6000 U/g風(fēng)味酶,同步酶解12 h。

圖2 不同酶解方案的肽得率和水解度比較Fig.2 Comparison of the PY and DH for different enzymatic hydrolysis schemes

圖3 超聲時(shí)間對(duì)肽得率和水解度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the PY and DH

2.4超聲波預(yù)處理輔助酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 超聲時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的增加,肽得率總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),20 min時(shí)肽得率達(dá)到最高值。因?yàn)殡S著超聲輻射時(shí)間的延長(zhǎng),超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)逐漸增強(qiáng),使胎盤蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露并與酶緊密作用。但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)破壞胎盤組織細(xì)胞,反而會(huì)降低酶解產(chǎn)物的活性[21]。水解度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì),但作用30 min時(shí)的水解度突然增加,原因可能是超聲時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致胎盤組織細(xì)胞的大量?jī)?nèi)容物溶出,這與Jia[22]等研究結(jié)果一致。初步選擇超聲時(shí)間為20 min。

2.4.2 超聲溫度對(duì)酶解效果的影響 由圖4可知,在超聲時(shí)間范圍內(nèi),隨著溫度逐漸升高,肽得率和水解度均呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì),30 ℃時(shí)的肽得率最高,高達(dá)39.00%,該溫度時(shí)的水解度(21.04%)顯著(p<0.05)高于25 ℃(20.47%)、40 ℃(20.64%)、45 ℃(20.25%)和50 ℃(19.86%),但與35 ℃(20.87%)差異不顯著(p>0.05)。由于超聲處理可破壞蛋白結(jié)構(gòu),使蛋白的變性程度增加,適當(dāng)溫度能使底物蛋白與酶作用位點(diǎn)更好接觸,但溫度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性過度,使可溶性蛋白含量下降[23-24],故初步選擇超聲溫度30 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)肽得率和水解度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the PY and DH

2.4.3 超聲功率對(duì)酶解效果的影響 由圖5可知,隨著超聲功率的增加,水解度變化總體呈先增后減趨勢(shì),但超聲功率對(duì)肽得率影響無明顯變化規(guī)律。這可能是因?yàn)槌曁幚磉^程中的熱效應(yīng)作用使預(yù)處理體系的溫度升高,不同超聲功率對(duì)應(yīng)的溫度增幅有較大差異,多重作用因素對(duì)酶解過程的肽得率構(gòu)成不確定影響,這與彭彬[25]的研究結(jié)果一致。但考慮到功率為360 W時(shí)水解度最高達(dá)20.81%,此時(shí)對(duì)應(yīng)的平均肽鏈長(zhǎng)度最小(4.81),平均分子量約546左右,屬于小分子肽范疇,人體更容易消化吸收[17]。因此,初步選擇超聲功率為360 W。

圖5 超聲功率對(duì)肽得率和水解度的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the PY and DH

2.5響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝條件實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.4中單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以肽得率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行超聲時(shí)間(A)、溫度(B)、功率(C)3個(gè)因素的參數(shù)優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與肽得率結(jié)果如表5所示,響應(yīng)曲面圖如圖6所示。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型:Y=37.356-0.6275A+0.2175B+0.6225C-0.29AB+0.275AC-0.425BC-3.5255A2-2.2955B2+4.0245C2。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design and results of RSM

圖6 超聲時(shí)間、功率和溫度對(duì)肽得率影響Fig.6 Effect of ultrasonic time,power and temperature on the yield of peptide

表6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 6 Variance analysis of quadratic regression equation

注：復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9687;離散系數(shù)CV=3.51%;*表示差異顯著(p<0.05)。

由表6模型方差分析可知,模型的F值為4.89(p<0.05),肽得率模型表現(xiàn)顯著;失擬項(xiàng)p值為0.2936(p>0.05),表現(xiàn)不顯著,復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.9687,說明該回歸方程擬合度良好,可用此模型對(duì)超聲波輔助酶解工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[26]。因子A、B和C及其交互項(xiàng)對(duì)肽得率影響不顯著(p>0.05),但其二次方A2、B2和C2對(duì)肽得率影響顯著(p<0.05)。超聲預(yù)處理的最佳參數(shù)條件為時(shí)間18.25 min、超聲溫度28.34 ℃、超聲功率405.95 W,該條件下肽得率和水解度的預(yù)測(cè)值分別為39.66%和21.69%。為便于實(shí)驗(yàn)操作,將參數(shù)設(shè)置為時(shí)間18 min、溫度28 ℃、功率420 W進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的肽得率平均值為39.89%,水解度平均值為21.78%,與預(yù)測(cè)值接近。與理論值相比,其相對(duì)誤差值分別為0.58%和0.41%,且重復(fù)性較好,結(jié)果可靠。計(jì)算得到該最優(yōu)條件下胎盤肽的平均肽鏈長(zhǎng)度為4.59,平均相對(duì)分子質(zhì)量約500～600。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法優(yōu)化后的羊胎盤超聲預(yù)處理最優(yōu)參數(shù)為溫度28 ℃、功率420 W和超聲時(shí)間18 min,經(jīng)超聲預(yù)處理后羊胎盤酶解的肽得率和水解度分別提高至39.89%和21.78%,制備得到了平均肽鏈長(zhǎng)度4.59和平均相對(duì)分子質(zhì)量500～600的小分子羊胎盤肽。說明超聲波輔助復(fù)合酶法制備羊胎盤肽的工藝可行,且效果明顯。

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OptimizationofpreparationofTibetansheepplacentapeptidebyultrasonic-assistedcompositeenzymatichydrolysis

ZHANGBing-yun1,WANGCong1,XIEYan-yan1,RENHai-wei1,*,FANWen-guang1,HUANGSi-yao1,LIZhi-zhong1,CHENWei2

(1.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China; 2.Lanzhou Mingde Agriculture-husbandry Technology Co.,Ltd.,Lanzhou 730010,China)

In order to realize the development and utilization of sheep placenta,the optimal combination scheme for the composite enzymatic hydrolysis of multiple proteases was investigated with the indicators of the yield of peptide(PY)and the degree of hydrolysis(DH). On this basis,the ultrasonic pretreatment parameters of sheep placenta were optimized by response surface methodology(RSM). The results showed that the optimal conditions of ultrasound pretreatment were found as follows:ultrasonic time of 18 min,temperature of 28 ℃and power of 420 W. Under these optimal ultrasound pretreatment conditions,synchronous composite enzymatic preparation by papain and flavor enzyme of the PY was 39.89%,the DH was 21.78%. And the average chain length was 4.59 and the molecular weight was about 500～600. Conclusion:the ultrasonic assisted enzymatic preparation method was feasible and effective in the preparation of Tibetan sheep placenta peptide.

Tibetan sheep;sheep placenta peptide;papain;flavor enzyme;ultrasonic pretreatment;process optimization

2017-03-22

張丙云(1968-),女,碩士,副教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:zhang.b.y@163.com。

*

任海偉(1983-),男,博士,副教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:rhw52571119@163.com。

甘肅省自然科學(xué)基金(1606RJZA206，1606RJYA287);蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-2-20);蘭州理工大學(xué)紅柳青年教師培養(yǎng)計(jì)劃(Q201207)。

TS251.95

A

1002-0306(2017)21-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.027