乳酸菌復(fù)合發(fā)酵大蒜風(fēng)味、活性成分和微生物種群變化分析

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(徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221018)

乳酸菌復(fù)合發(fā)酵大蒜風(fēng)味、活性成分和微生物種群變化分析

侯進(jìn)慧，李勇，唐夢(mèng)笛，韓芝洋

(徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221018)

本文以大蒜為研究對(duì)象,添加植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等三種乳酸菌發(fā)酵大蒜,分析乳酸菌復(fù)合發(fā)酵大蒜在風(fēng)味、活性成分和微生物種群變化等方面的特征,為大規(guī)模的大蒜發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。結(jié)果顯示,發(fā)酵30 d后蒜味逐漸消失,并產(chǎn)生香味,口感顯著改善;開(kāi)始發(fā)酵后,發(fā)酵液pH下降明顯,10 d以后發(fā)酵液的pH基本保持在4左右;發(fā)酵開(kāi)始后,SOD酶活性有所增加,并保持在250 U的較高水平;細(xì)菌群落以添加的三種乳酸菌為主,發(fā)酵開(kāi)始時(shí)還伴有腸桿菌、不動(dòng)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、芽孢桿菌,但發(fā)酵后期沒(méi)檢測(cè)到腸桿菌、不動(dòng)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌,只檢測(cè)到三種乳酸菌和芽孢桿菌,而且乳酸菌除了剛發(fā)酵時(shí)有所降低,其他時(shí)間一直保持在較高水平。本文為乳酸復(fù)合發(fā)酵大蒜的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。

大蒜,乳酸菌,復(fù)合發(fā)酵,SOD,16S rDNA,微生物種群

大蒜是蔥科、蔥屬的重要經(jīng)濟(jì)作物,中國(guó)是全球最大的大蒜出口國(guó)[1-2]。我國(guó)大蒜加工產(chǎn)品主要有蒜粉、脫水蒜片、鹽水大蒜等,而適合國(guó)內(nèi)人群消費(fèi)的即食大蒜制品,如糖蒜、黑蒜、蒜醬等相對(duì)較少。在餐飲行業(yè),大蒜的消費(fèi)也以鮮大蒜頭為主,導(dǎo)致大蒜頭市場(chǎng)價(jià)格劇烈波動(dòng)。大蒜的主要活性成分包括超氧化物歧化酶(SOD)、蒜氨酸(Alliin)、大蒜素(Allicin)和多糖等。但是由于鮮蒜特殊的刺激性氣味,限制了其消費(fèi)和利用[3-7]。

在食品工業(yè)中,蔬菜發(fā)酵加工可提高蔬菜制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。乳酸菌是一類重要的食品發(fā)酵微生物,可以發(fā)酵糖類物質(zhì),其在發(fā)酵過(guò)程中也可以產(chǎn)生乳酸菌素而抑制腐敗菌,減少亞硝酸鹽的形成,改善蔬菜風(fēng)味,延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。乳酸菌還是一類重要的生理調(diào)節(jié)菌,可以改善人體的腸道內(nèi)環(huán)境,并產(chǎn)生乳酸等營(yíng)養(yǎng)物[8-10]。開(kāi)展微生物發(fā)酵大蒜的研究,相關(guān)產(chǎn)品可以提高大蒜銷售的附加值,穩(wěn)定大蒜的產(chǎn)品品質(zhì)和銷量,降低大蒜銷售的損耗,提升產(chǎn)品檔次。

本文利用乳酸菌復(fù)合發(fā)酵技術(shù)對(duì)大蒜進(jìn)行發(fā)酵,降低大蒜產(chǎn)品的刺激性異味,改善風(fēng)味,提高其活性成分的含量,同時(shí)分析發(fā)酵過(guò)程中的微生物種群類型和變化特征,為開(kāi)發(fā)出新型大蒜發(fā)酵產(chǎn)品提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

發(fā)酵所用大蒜 江蘇邳州;發(fā)酵大蒜所用的植物乳桿菌LactobacillusplantarumXN7、嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusXM3、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusXN9等乳酸菌菌種 課題組選育保藏菌種;用于菌種培養(yǎng)的蛋白胨、瓊脂粉等試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;用于菌株分子鑒定的Taq DNA聚合酶等PCR試劑和瓊脂糖等電泳試劑 寶生物工程(大連)有限公司。

MDF-382E型超低溫冰箱 日本SANYO電子有限公司;HYG型振蕩培養(yǎng)箱 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司;Sigma3-16pk型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2培養(yǎng)基與菌體計(jì)數(shù)

使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基用于腸桿菌計(jì)數(shù)、分析,接種樣品,在37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h計(jì)數(shù)[11]。使用MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌計(jì)數(shù)、分析,接種樣品,在30 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h 計(jì)數(shù)[12]。用于菌種培養(yǎng)的LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,加蒸餾水定容至1 L,滅菌備用。每1 L固體LB培養(yǎng)基需要再添加瓊脂粉12 g到液體LB培養(yǎng)基,滅菌備用[13]。

1.3大蒜的發(fā)酵

1.3.1 原料前處理 對(duì)發(fā)酵的大蒜進(jìn)行前處理,包括清洗、剝皮、晾干和紫外殺菌30 min。

1.3.2 發(fā)酵工藝 將大蒜原料進(jìn)行剝皮、清洗、晾干,利用紫外線殺菌30 min,裝料,添加發(fā)酵乳酸菌菌種,包含LactobacillusplantarumXN7、LactobacillusacidophilusXM3、LactobacillusrhamnosusXN9等菌種,根據(jù)課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),三種菌的數(shù)量比是1∶1∶1,菌液接種量為發(fā)酵液體積的5%,料水體積比是1∶1,NaCl含量占培養(yǎng)液的1%,保持自然pH。經(jīng)攪拌均勻后,在28 ℃厭氧發(fā)酵。

1.4發(fā)酵液的pH和SOD檢測(cè)

在發(fā)酵過(guò)程中,固定時(shí)間取樣,用pH儀測(cè)定溶液的pH,以時(shí)間為橫坐標(biāo),以pH變化為縱坐標(biāo),繪制出pH變化曲線。用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性[14],將發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取出的發(fā)酵大蒜進(jìn)行粉碎,獲得提取液,在60 ℃處理20 min,4000 r/min離心后,取上清即為粗酶液,測(cè)定SOD活性。將1 min反應(yīng)液SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率50%定義為1個(gè)SOD活力單位。

1.5菌株基因組DNA提取與16SrDNA擴(kuò)增

利用苯酚-氯仿抽提獲得菌株基因組DNA[15]。以提取的基因組DNA為模板,擴(kuò)增16S rDNA,所用引物序列為:F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′,R:5′ GGTTACCTTGTTA CGACTT3′,進(jìn)行22次PCR循環(huán)擴(kuò)增。膠回收16S rDNA片段。與測(cè)序載體pGMT連接,挑選白色轉(zhuǎn)化子,送上海生工測(cè)序[13]。

1.6發(fā)酵過(guò)程中的微生物種群變化分析

在發(fā)酵過(guò)程中,固定時(shí)間取樣,利用LB培養(yǎng)基,采用純培養(yǎng)方法獲得菌種,利用基因擴(kuò)增方法,獲得菌株的16S rDNA序列。利用Blast程序,在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析菌株序列,利用DNAMAN等生物信息學(xué)軟件分析菌株的種群類型,確定發(fā)酵前、后的發(fā)酵液中微生物類群。

2 結(jié)果與分析

2.1乳酸復(fù)合發(fā)酵對(duì)大蒜風(fēng)味的影響

利用三種乳酸菌對(duì)大蒜進(jìn)行發(fā)酵,按照每10 d取一次樣品進(jìn)行風(fēng)味分析,將結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1?？梢钥闯?在發(fā)酵10 d以前,蒜味還非常強(qiáng)烈,辣味也很強(qiáng),在發(fā)酵30 d后,蒜味逐漸消失,并產(chǎn)生香味,蒜辣味在50 d以后顯著降低,口感顯著改善。

表1 復(fù)合發(fā)酵對(duì)大蒜風(fēng)味的影響Table 1 Effect of composite fermentation on garlic flavor

2.2復(fù)合發(fā)酵過(guò)程中pH變化情況

在發(fā)酵過(guò)程中,由于乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝作用,發(fā)酵液的pH不斷下降,連續(xù)測(cè)定獲得其pH變化曲線(圖1)。在最初的10 d,發(fā)酵液pH下降明顯,10 d以后溶液的pH基本保持穩(wěn)定在4,處于酸性環(huán)境,說(shuō)明乳酸菌生長(zhǎng)良好。

圖1 發(fā)酵過(guò)程pH變化情況Fig.1 pH variation in fermentation

2.3復(fù)合發(fā)酵過(guò)程中大蒜SOD活性變化

在發(fā)酵過(guò)程中,連續(xù)取樣測(cè)定SOD酶的活性變化,得到變化曲線(圖2)。在發(fā)酵20 d時(shí),SOD酶活性增加到250 U左右,并在20～50 d的發(fā)酵過(guò)程中保持基本穩(wěn)定,這是乳酸菌代謝的結(jié)果。在50 d以后,略有下降,可能是菌種活性有所降低。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中SOD酶活性變化情況Fig.2 Variation of SOD activity in fermentation

2.4腸桿菌數(shù)目變化情況

使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基對(duì)腸桿菌進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)。開(kāi)始時(shí),腸桿菌數(shù)目為104CFU/mL,前5 d菌落對(duì)數(shù)由4.2下降到3.5左右,下降較緩慢;在5～15 d,腸桿菌菌落對(duì)數(shù)由3.5下降到0.5,下降較快;15 d以后幾乎沒(méi)有腸桿菌,30 d之后沒(méi)有檢測(cè)到腸桿菌。這主要是由于厭氧培養(yǎng)和酸性環(huán)境對(duì)腸桿菌的抑制作用。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中腸桿菌數(shù)目變化情況Fig.3 Variation of enterobacteria number in fermentation

2.5乳酸菌數(shù)目變化情況

發(fā)酵開(kāi)始時(shí),乳酸菌為107CFU/mL,前5 d數(shù)目下降到105CFU/mL;5～10 d,乳酸菌數(shù)目保持在105CFU/mL左右;15 d以后,乳酸菌數(shù)目又回升到106～107CFU/mL。在40 d以后出現(xiàn)數(shù)目下降的情況。在開(kāi)始的5 d出現(xiàn)乳酸菌數(shù)目下降,可能與發(fā)酵液pH、溶氧較高和大蒜的抑菌作用有關(guān)系。乳酸菌數(shù)目的增加可能是由于發(fā)酵液的酸性環(huán)境有利于乳酸菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致其數(shù)目不斷增加。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)目變化情況Fig.4 Variation of lactic acid bacteria number in fermentation

2.6發(fā)酵液中微生物分離與16SrDNA擴(kuò)增

利用LB培養(yǎng)基,通過(guò)純培養(yǎng)方法,分離得到菌落形態(tài)各異的菌株,擴(kuò)增獲得各菌株的16S rDNA基因片段,通過(guò)測(cè)序獲得序列。提取菌株基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示提取的基因組DNA質(zhì)量較好,是單一條帶,斷裂較少,適合作為PCR反應(yīng)模板(圖5,箭頭所示)。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的菌株16S rDNA基因,獲得單一條帶,質(zhì)量較好,沒(méi)有雜帶(圖6,箭頭所示)。

圖5 菌株基因組DNA 電泳Fig.5 Electrophoresis of genomic DNA注:M泳道是DNA Marker, 1～3泳道是基因組DNA(如箭頭所示)。

圖6 菌株16S rDNA電泳Fig.6 Electrophoresis of 16S rDNA注:M泳道是DNA Marker, 1～4泳道是16S rDNA(如箭頭所示)。

2.7發(fā)酵液中微生物類群分析

利用DNAMAN生物信息學(xué)軟件分析菌株的種群類型,確定發(fā)酵前和發(fā)酵后發(fā)酵液的微生物類群。發(fā)酵前,發(fā)酵體系中的主要微生物類群是(圖7):植物乳桿菌(L.plantarum)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、腸桿菌(E.xiangfangensis、Enterobactersp.)、不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)。發(fā)酵60 d后,發(fā)酵體系中檢出的主要微生物類群是:植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和芽孢桿菌,沒(méi)有檢測(cè)到腸桿菌。這與腸桿菌數(shù)目變化情況(圖3)的結(jié)果一致,說(shuō)明厭氧發(fā)酵顯著抑制腸桿菌的生長(zhǎng)。

圖7 發(fā)酵前的主要微生物類群Fig.7 The microbial population before fermentation

圖8 發(fā)酵后的主要微生物類群Fig.8 The microbial population after fermentation

3 結(jié)論

乳酸菌是可以定植在人類腸道中的益生菌,具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤等功效,其研究和應(yīng)用日益被人們重視[16]。利用菌種發(fā)酵大蒜,可以發(fā)揮出不同菌株的代謝優(yōu)勢(shì)、調(diào)節(jié)大蒜風(fēng)味,開(kāi)發(fā)出新型發(fā)酵大蒜產(chǎn)品[17]。本文利用植物乳桿菌L.plantarumXN7、嗜酸乳桿菌L.acidophilusXM3、鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusXN9 等三種乳酸菌共同發(fā)酵大蒜,取得了較好的效果。經(jīng)過(guò)30 d以上的發(fā)酵,蒜味逐漸消失,并產(chǎn)生香味,口感顯著改善。發(fā)酵的中后期,pH下降到4左右并基本保持穩(wěn)定,SOD酶的活性則有所升高,且能保持較高水平。本研究的微生物類群特征分析顯示,腸桿菌、不動(dòng)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌只是在發(fā)酵前期存在,而中后期則沒(méi)有檢測(cè)到,這應(yīng)該是厭氧和酸性環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用。乳酸菌在發(fā)酵的前5 d數(shù)目有所下降并保持了一段時(shí)間,在15 d以后,乳酸菌數(shù)目又回升到開(kāi)始的數(shù)目并保持到發(fā)酵后期,這可能與發(fā)酵液pH、溶氧和大蒜的抑菌作用有關(guān)系,還需要進(jìn)一步研究。利用16S rDNA分析發(fā)酵過(guò)程中微生物類群的變化,可以很快揭示出種群變化特征,為整體把握發(fā)酵過(guò)程提供依據(jù)。利用16S rDNA序列同源性分析食品中的乳酸菌[18-21],結(jié)果表明利用分子序列對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定是快速有效的。本文以16S rDNA為參考基因,分析發(fā)酵過(guò)程中的微生物種類,基本可以反映出微生物菌群的特征和變化。文中采用純培養(yǎng)的方法,可以分析出發(fā)酵液中大量存在的微生物類群,也就是優(yōu)勢(shì)種群。但并不能完全反映出菌落的全部特征,還有一些數(shù)量極少的或者不可培養(yǎng)的菌株,采用提取總DNA的方法可以分析出更加全面的菌落種群特征。

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Analysisofthechangesofflavor,activecomponentsandmicrobialpopulationinfermentationofgarlicbylacticacidbacteria

HOUJin-hui，LIYong，TANGMeng-di，HANZhi-yang

(Xuzhou University of Technology,Xuzhou 221018,China)

In the paper,three kinds of lactic acid bacterial strains,LactobacillusplantarumXN7,LactobacillusacidophilusXM3,LactobacillusrhamnosusXN9,were added in the composite fermentation of garlic,and flavor,active ingredients and microbial population changes were analyzed. The results showed that after 30 days of fermentation the smell of garlic gradually disappeared,fragrance appeared,and the taste significantly improved. After fermentation,pH decreased significantly and after 10 days the pH of the solution remained at 4. The SOD activity increased at the beginning of fermentation,and maintained at a higher level,250 U. At the beginning of fermentation,bacterial community was composed by the three kinds of lactic acid bacteria added,and accompanied byEnterobactersp.,Acinetobactersp.,Stenotrophomonassp. andBacillussp.,butEnterobactersp.,Acinetobactersp.,Stenotrophomonassp. cannot be detected at the end of the fermentation,only three kinds of lactic acid bacteria andBacillussp. can be detected. The paper provides a reference for the production of fermented garlic.

Alliumsativum;lactic acid bacteria;composite fermentation;SOD;16S rDNA;microbial population

2017-05-08

侯進(jìn)慧(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：houjinhui0@126.com。

江蘇省科技廳項(xiàng)目(BN2016022)；江蘇省青藍(lán)工程骨干教師項(xiàng)目(2017年)；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(KC15N0011)；徐州工程學(xué)院校級(jí)科研課題(XKY2013108)；徐州工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目(2017年)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0092-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.019