規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)塞內(nèi)加谷病及SVV HN16株的分離鑒定

賀東生，羅天霞，蘇丹萍，徐帥飛，熊景峰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)塞內(nèi)加谷病及SVV HN16株的分離鑒定

賀東生，羅天霞，蘇丹萍，徐帥飛，熊景峰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

2016年3月，華南某豬場(chǎng)發(fā)生水皰性疾病。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室PCR診斷，排除FMDV后顯示為SVV陽(yáng)性。使用PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)和傳代，采用特異性的VP1基因引物擴(kuò)增該片段，使用DNAMAN7．0和MEGA6．06軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，該病毒可以在細(xì)胞上成功繁殖，成功克隆了該病毒的VP1基因，序列長(zhǎng)度為694 bp，并進(jìn)行基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。序列同源性分析顯示：該毒株與國(guó)內(nèi)其他毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)形成一個(gè)分支。表明該毒株為塞內(nèi)加谷病毒的新成員，命名為SVV HN16。

豬；塞內(nèi)加谷病毒；分離鑒定；序列分析

塞內(nèi)加谷病毒（Seneca Valley virus，SVV)又名塞內(nèi)加A病毒（Senecavirus A，SVA），為單股正鏈不分節(jié)的RNA病毒，隸屬小RNA毒科Senecavirus病毒屬。癥狀與口蹄疫相似，其主要通過(guò)感染仔豬使其豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面從而導(dǎo)致跛足甚至死亡。該病毒最早于1998年被分離[1]到，因其在2014年巴西大規(guī)模暴發(fā)才被養(yǎng)豬業(yè)所重視[2]。2015年3月，該病首次在我國(guó)廣東某豬場(chǎng)暴發(fā)，并從發(fā)病病料分離到了SVV[3]。2016年3月華南某集約化豬場(chǎng)肉豬和母豬群暴發(fā)水泡性疾病，發(fā)病率100%、病死率約40%。發(fā)病豬的病料經(jīng)多項(xiàng)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)排除了FMDV、SVD等類(lèi)似病原存在，證實(shí)這是一起單純SVV引起的暴發(fā)，并對(duì)該病毒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分離鑒定，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞系

本研究從華南某豬場(chǎng)（2 500頭基礎(chǔ)母豬）3～7日齡的乳豬中，采集鼻吻、蹄冠部位出現(xiàn)水皰樣病變的仔豬內(nèi)臟及水皰液，按1∶3加入PBS緩沖液進(jìn)行稀釋研磨，6 000 g， 4 ℃離心5 min，取上清，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩K-15傳代細(xì)胞系由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室保存。

1.2 主要試劑

One-step RT-PCR試 劑 盒、DNA Marker、dNTP、 Taq 酶 等 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，pMD18-T載 體、DH5α 感 受 態(tài) 細(xì)胞、Trizol試劑、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱、DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾儀器有限公司，倒置顯微鏡為徠卡儀器有限公司，其他所用化學(xué)試劑都為分析純。引物合成、DNA測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)GenBank 所發(fā)布的序列號(hào)，選擇全基因序列，運(yùn)用Primer Premier5.0針對(duì)SVV、FMDV（O、A、Asia1通用檢測(cè)型）分別設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段分別為700 bp和350 bp，退火溫度分別為58 ℃和54 ℃。引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 總RNA 的提取

將病料離心后取出上清，按Trizol法提取病毒總RNA，然后用無(wú)RNA酶的去離子水溶解，-80 ℃冰箱保存。具體步驟參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)。

1.5 病毒的RT-PCR 檢測(cè)

以病毒總RNA為模板進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Onestep RT-PCR buffer 12.5μL， 上 下游引物各 1.0μL，RNA 模板 3μL，Rnase Free DH2O7.5μL。PCR 擴(kuò) 增程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min ；95 ℃預(yù)變性5 min ；95 ℃變性 30 s；54 ℃退火 3 s；72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán) ；72 ℃延伸 10 min ；4 ℃保存。取 5μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，CLINX凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.6 病毒的分離

取離心后保存的上清液用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，取適量過(guò)濾后的病毒液加入到鋪滿單層細(xì)胞的細(xì)胞板上。37 ℃溫箱孵育60 min，再加入2%血清培養(yǎng)的DMEM37 ℃，培養(yǎng)48 h后收毒。在下一次傳代前，先將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，取上清液接種細(xì)胞進(jìn)行傳代，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)并記錄。

1.7 克隆測(cè)序

將陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與PMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后挑單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒送往睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 序列分析

將RT-PCR 擴(kuò)增獲得的基因片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，利用DNAMAN7.0和MEGA6.06軟件處理，與GenBank上已公布的SVV毒株的全基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

以提取的總RNA為模板，用SVV和FMDV引物分別對(duì)樣品進(jìn)行以上2種病毒的檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)MDV檢測(cè)結(jié)果為陰性，SVV 在700 bp左右有明顯條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。由此說(shuō)明該病毒為SVV而非FMDV。將SVV VP1基因PCR產(chǎn)物純化后構(gòu)建至pMD-18T質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

2.2 SVV CH_GDHS_2017的分離

病毒接種單層PK-15細(xì)胞，24 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)病變，48 h收毒。隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)CPE的時(shí)間縮短且程度隨之加劇。目前病毒已傳至第8代，基本能在該細(xì)胞系上穩(wěn)定增殖。病毒傳至24 h時(shí)有細(xì)胞變圓，折光性變強(qiáng)，有較多漂浮的死細(xì)胞；而對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)良好(圖2A，2B)。培養(yǎng)48h，細(xì)胞CPE達(dá)75%以上，細(xì)胞基本變圓且有大量漂浮的死細(xì)胞；對(duì)照仍是致密的單層細(xì)胞，只有少量的細(xì)胞漂浮在液面（圖2C，2D）。每隔2代進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。由此，可以確定成功分離了一株SVV HN16毒株。

2.3 SVV VP1基因同源性分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示其與GeneBank中已發(fā)表序列同源性高達(dá)99%，由此進(jìn)一步確定其為SVV，將其命名為SVV HN16。以GenBank中已發(fā)表的13株SVV毒株為參考（表1），進(jìn)行SVV VP1基因同源性分析（圖3）。結(jié)果顯示， SVV HN16 VP1基因之間核苷酸序列同源性為85%～96.9%：其中與中國(guó)已公布毒株相比核苷酸同源性為94.7%～95.1%；與巴西毒株相比核苷酸同源性為93.9%～96.9；與美國(guó)毒株核苷酸同源性為85.0%～86.5%.巴西毒株與國(guó)內(nèi)毒株相比，同源性為95.9%～97.2%。該毒株與巴西毒株同源性最高，為96.9%，與美國(guó)毒株同源性最低，為85.0%。

圖1 SVV VP1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 A為接毒24 h；B為對(duì)照24 h；C為接毒48 h；D 為對(duì)照 48 h

表1 GenBank已登錄的svv參考毒株

圖3 基于SVV VP1基因的序列同源性

圖4 基于SVV VP1基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.4 基于SVV VP1基因的遺傳進(jìn)化分析

以表1中13株毒株為參考，運(yùn)用MEGA6.06軟件采用Neighbor-Joining聚類(lèi)分析方法構(gòu)建基于VP1基因序列的進(jìn)化樹(shù)。如圖4所示，SVV HN16與國(guó)內(nèi)毒株親緣關(guān)系較近，而與美國(guó)毒株較遠(yuǎn)。本次鑒定毒株與國(guó)內(nèi)其他毒株雖然親緣關(guān)系較近，但單獨(dú)形成一個(gè)分支，說(shuō)明該病毒是SVV新成員。

3 討論

SVV 最初分離自細(xì)胞培養(yǎng)基，懷疑有可能來(lái)自豬胰蛋白酶或胎牛血清[1]。在2007年，SVV在美國(guó)和加拿大的豬群中被分離[4]到，在美國(guó)和巴西等地，該病毒僅有零星報(bào)道，直至2014年11月到2015年4月，巴西出現(xiàn)幾次嚴(yán)重的感染癥狀，并導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失，該病才逐漸被重視[5]。在2015年9月，該病在美國(guó)某豬場(chǎng)暴發(fā)，并伴隨大量新生仔豬死亡[6]。在2016年，國(guó)內(nèi)首株塞內(nèi)加谷病毒被報(bào)道[3]， 該病開(kāi)始傳入我國(guó)并威脅著我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)。

本次鑒定出的SVV HN16與國(guó)內(nèi)其他毒株不在一個(gè)分支，表明在進(jìn)化過(guò)程中變異迅速，這種變異對(duì)疾病的防治和疫苗的研究增加了難度。對(duì)該病毒使用細(xì)胞進(jìn)行增殖，目前已傳至第8代，且能出現(xiàn)穩(wěn)定的病變，有望對(duì)新疫苗的研制提供幫助。因該病是豬場(chǎng)新病，對(duì)其認(rèn)知比較有限，且發(fā)病率較高、傳播快、豬場(chǎng)損失大，對(duì)豬場(chǎng)短期及長(zhǎng)期的影響難以預(yù)估，需要進(jìn)一步研究其傳入源頭、防控方法，做好防控方案。

致謝：本實(shí)驗(yàn)是在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和廣東省獸用生物制品技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝廣東省生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金的資助。

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2017-08-31)